The Electroencephalogram and Analysis of MPTP-Induced Tree Shrew Model for Parkinson's Disease
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摘要:
目的 研究树鼩帕金森病（PD）模型的皮层脑电图和脑电功率谱、地形图特征。 方法 选取普通级成年滇缅树鼩10只，随机分为模型组（n = 5）和对照组（n = 5）。采用1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（MPTP） 2 mg/kg肌肉注射建立树鼩PD模型，对照组注射等体积 0.9% 氯化钠溶液，连续15 d。停药1月后，采用EEG技术对树鼩PD模型进行皮层脑电图描记与功率谱、地形图分析。 结果 成功建立树鼩PD模型。正常对照组树鼩大脑半球额部、顶部、枕部等各部位脑电波的频率、波幅、波形、相位无明显差异和特异性。脑电波各部位α波占主导，波幅差 < 30%；背景为散在δ、θ波；脑电功率谱直方图，两半球各频带功率值分布对称；地形图双侧六频带为低功率频谱，其功率值 < 100 μv2/Hz。树鼩PD模型组记录到棘波、尖波等异常波形呈节律性发放，主要表现为α波左右不对称，异常波形主要表现在额部和顶部，部分出现高振幅慢波δ、θ；脑电功率谱主要表现为α波相位不同步，各频带功率谱直方图分布不对称；树鼩PD模型组地形图δ频段功率平均值 > 1 000 μv2/Hz，为低频高功率。δ、θ、α1、α2频带功率值与对照组相比显著性增高。 结论 树鼩PD模型脑电波形图、脑电频谱直方图及脑电地形图较正常对照组具有显著的特异性，可为PD模型神经电生理研究提供参考。 Abstract:Objective To study the characteristics of cortical electroencephalogram （EEG）, power spectrum and mapping in tree shrew model for Parkinson’ s disease （PD）. Methods Ten common-level Burmese adult tree shrews were selected and randomly divided into a model group (n = 5) and a control group （n = 5）. A PD model of tree shrew was produced by intramuscular injection of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine （MPTP）, with a MPTP dose of 2 mg/kg. The control group was injected with an equal volume of 0.9% sodium chloride solution continuously for 15 days. One month after the drug withdrawal, EEG technology was used to perform the cortical EEG tracing, power spectrum and topographic analysis of the tree shrew PD model. Results The MPTP-Induced Tree Shrew Model for PD was established successfully. In the normal control group, there was no significant difference and specificity in frequency, amplitude, waveform and phase of EEG in the frontal, parietal and occipital parts of the cerebral hemisphere,α wave was dominant in the waves recorded in each part of the tree shrews brain and amplitude difference was less than 30%, with δ and θ waves being scattered; The histogram of EEG power spectrum was basically symmetrical on both sides; The power value of each frequency band was distributed symmetrically in the two hemispheres and the bilateral six bands in the EEG mapping was low power and its power value was less than 100 μv2/Hz. In the tree shrew PD model group, spikes, sharp waves and other abnormal waves were recorded, showing rhythmic emission. The mainly manifested α wave was asymmetry, the abnormal waveforms were mainly in the frontal and parietal areas, and the high amplitude slow waves δ、θ also appeared in some areas; The main features of EEG power spectrum were as follows: α wave phase was not synchronous, and the histogram distribution of power spectrum in each frequency band was asymmetric; The δ frequency band in the EEG mapping was low frequency and high power and the average power was more than 1 000 μv2/Hz. Compared with the control group, the frequency band power values of δ、θ、α1and α2 were significantly higher than those of the control group. Conclusion Compared with the normal control group, the EEG waveforms, EEG spectrum histogram and EEG mapping in the tree shrew PD model all show the significant characteristics, proving that they can provide references for the study of neuroelectrophysiology in PD model. -
Key words:
- Electroencephalography /
- EEG power spectrum /
- EEG mapping /
- Parkinson’ s model /
- Tree shrew /
- MPTP
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帕金森病（parkinson’ s disease，PD）是中老年人常见的仅次于阿尔茨海默病（alzheimer disease，AD）的第二大中枢神经系统退行性疾病。目前，该病的生理、病理机制仍不能完全明确[1]。脑电图（electroencephalography，EEG）是大脑皮层锥体细胞及其顶树突突触后电位同步综合波，是中枢神经系统中始终存在着的伴随脑神经活动所产生的电位活动。EEG通过电极能够持续记录脑细胞群的自发性、节律性电活动。临床上EEG是有效的用于检测大脑皮层病理状态的方法，近几年较好地应用于PD的辅助诊断[2-3]。PD患者一般会出现大脑皮层萎缩情况，出现认知功能障碍，头皮脑电描记技术因其具有敏感、经济、无创等优势，已被广泛应用于PD认知障碍疾病、冷漠和抑郁[2,4-7]，PD其它并发症等方面的诊断[8-10]。
脑电波信号是非平稳且随机的非线性复杂信号，能综合反映大脑组织电活动和大脑功能状态。在医学检测方面，脑电信号的分析结果可以为神经系统疾病提供相对应的依据。傅里叶变换在信号处理中具有非常重要的作用，是进行脑电时频分析的主要手段[11]。通过快速傅里叶变换（fast fourier transform，FFT），能客观反映大脑功能变化，已成为当代临床新型诊断技术之一，较好地应用于各类脑局部疾病患者慢波活动相关领域检测方面[12]和人类神经系统疾病动物模型研究方面。
国际上把脑电波频率分为四个频段即δ（delta）、θ（theta）、α（alpha）、β（beta），相对功率谱可分为δ、θ、α1、α2、β1、β2六个频段[4]。本研究采用EEG技术对树鼩PD模型进行局部对称型皮层脑电图描记与FFT功率谱、地形图分析，旨在为今后开展基于EEG的神经疾病模型研究工作提供皮层脑电图描记和分析的方法。
1. 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物
成年普通级滇缅树鼩10只，购自昆明医科大学实验动物学部，饲养于普通环境实验室[使用许可证号：SYXK（滇）K2015—0002]。饲喂颗粒饲料，自由采食和饮水，适应性饲养1个月后进行相关实验。本实验依据优化、减少、替代的3R原则进行实验设计，遵守国际惯例。所有操作均申报并通过昆明医科大学实验动物伦理审查。
1.1.2 主要试剂
MPTP（Sigma公司，M0896-100MG），实验前用0.9%氯化钠溶液（NS）10 mL注入MPTP试剂瓶内，使粉末充分溶解，配成所需剂量的MPTP药液，专人专管，严格特定区域内使用；3%戊巴比妥钠（北京鼎国生物股份有限公司）。
1.1.3 主要仪器
KT88数字脑电地形图仪（秦皇岛康泰医学系统股份有限公司），银针等。
1.2 方法
1.2.1 肌肉注射MPTP诱导树鼩PD模型
树鼩随机分为模型组（n = 5）和正常对照组（n = 5），选择树鼩后肢内侧肌肉进行注射，模型组MPTP药液剂量为2 mg/kg，正常对照组注射同体积的0.9%氯化钠溶液，连续注射15 d。
1.2.2 脑电图采集方法
造模1月后进行脑电图采集。戊巴比妥钠按30 mg/kg经腹腔注射麻醉树鼩，确认树鼩麻醉后，用细绳将其俯卧位固定在动物操作台上。在脑电仪器电极末端固定上银针，将银针电极经头皮插入肌肉，注意不要伤及颅骨。电极安置按国际10-20标准双侧对称，要求安置电极为左右对称，记录电极分别安置选择额部（F3/F4）、顶部（C3/C4）、枕部（P3/P4），参考电极置于树鼩双耳垂（A1/A2）（图1），共同接地。电极固定后，用KT88脑电记录仪进行脑电描记，保证操作台周围无金属或电磁干扰。根据实验所需采集数据5～20 min自发脑电图，注意采集过程保持实验环境的绝对安静。
图 1 树鼩脑电描记实验图A：记录电极安置位置；B：树鼩脑电描记采集保定。Figure 1. Experimental diagrams of tree shrew brain electroencephalography1.2.3 功率谱与地形图分析
树鼩大脑皮层脑电图描记采集频段分别为δ：1.0～4.0 Hz、θ：4.0～8.0 Hz、α1：8.0～10.0 Hz、α2：10.5～13.0 Hz、β1：13.5～17.5 Hz、β2：18.0～35.0 Hz。树鼩皮层脑电图描记采集完成后，利用KT88数字脑电地形图仪软件处理记录脑电信号，脑电图仪的时间常数为0.3 s，滤波频率为50 Hz，即记录脑电信号速率30 mm/s，幅值5 mm/50 μv。首先评估树鼩图像质量，排除因动物抖动或环境干扰产生的伪信号。隐藏所有采集图像的动物编号和分组信息，进行功率谱，地形图分析处理。每只动物地形图δ、θ、α1、α2、β1、β2频带功率值测量记录五次并求取平均值。
1.3 统计学处理
采用SPSS统计学软件进行分析，计量资料服从正态分布用均数±标准差（
$\bar x \pm s $ ）表示，采用两组独立样本t检验分析。P < 0.05为差异有统计学意义。2. 结果
2.1 MPTP诱导的树鼩行为学表现
MPTP药液注射至第2～3次，模型组树鼩开始表现出肉眼可见的典型PD运动症状，包括震颤、姿势异常、运动异常、步态异常、平衡异常等5个方面。肉眼可见的异常表现一般于注射后1～3 min立即呈现，1 h内基本可恢复。注射至3～5次时，PD运动症状最明显，随着注射次数的增加，症状减弱或不再表现出肉眼可见的异常姿势。正常对照组无异常表现。注射持续至第15次停药。
2.2 树鼩PD模型的脑电波形特征
正常对照组树鼩大脑两半球额、顶、枕等各部位频率、波幅、波形、相位脑电波四个基本因素无明显差异和特异性。脑电波左右基本对称，背景脑电波以α波为主，占85～90%，少数β节律占10～15%，α波频率差不超过2 Hz；全部记录中偶见δ活动，波幅 < 50 μv。树鼩PD模型组可记录到棘波、尖波、棘-慢复合波、多棘-慢复合波、尖-慢复合波呈节律性发放。表现为α波左右不对称，部分顶区相差超过50%、其它导联超过30%等。异常波形主要表现在额部和顶部，部分出现高振幅慢波δ、θ。α节律、β节律的比例下降。脑电波形特征见图2。
图 2 树鼩脑电波波形特征A：正常对照组；B：树鼩PD模型组典型表现1；C：树鼩PD模型组典型表现2。Figure 2. Typical brain waveform in tree shrew groups2.3 树鼩PD模型的脑电频谱直方图特征
对照组树鼩脑电功率谱双侧左右基本对称，树鼩PD模型组主要表现为α波相位不同步，各频带功率谱直方图分布不对称。脑电频谱直方图特征见图3。
图 3 树鼩脑电频谱直方图A：正常对照组；B：树鼩PD模型组典型表现1；C：树鼩PD模型组典型表现2。Figure 3. Typical brain spectrum histogram of tree shrew PD model group 12.4 树鼩PD模型的脑电地形图特征
对照组各频带功率值两半球分布对称，地形图双侧各频带为低功率（图4）。树鼩PD模型组各频带功率值两半球分布不对称，背景脑电的绝对功率值与正常组比较，各频带功率值超过正常值，尤其是θ和δ频带的功率值升高出现低频高功率，δ功率 > 1 000 uv2/Hz，各频带功率值两半球分布不对称，α频率在两半球不相等（图5）。对各频带的功率谱地形图进行统计分析， δ 频带功率值显著高于对照组（P < 0.05）、θ、α1、α2频带功率值与对照组相比显著性增高（P < 0.01），实验树鼩脑电各频段的相对能量情况见表1。
图 4 对照组树鼩脑电地形图A：对照组三维旋转图表现；B：对照组脑电地形图表现。Figure 4. Typical brain topography of tree shrew PD model group1表 1 实验树鼩脑电各频段的相对能量单位（$\bar x \pm s $ ）Table 1. Relative energy units of each frequency band of the experimental tree shrew’s EEG （$\bar x \pm s $ ）组别 δ θ α1 α2 β1 β2 1.0～4.0 Hz 4.0～8.0 Hz 8.0～10.0 Hz 10.5～13.0 Hz 13.5～17.5 Hz 18.0～35.0 Hz 对照组（n = 5） 55.83 ± 19.70 39.48 ± 14.99 8.75 ± 2.67 5.35 ± 0.91 7.33 ± 3.00 7.33 ± 2.84 模型组（n = 5） 1498.66 ± 707.86* 246.05 ± 87.64** 26.06 ± 6.54** 18.96 ± 6.03** 14.87 ± 7.82 10.46 ± 3.52 P 0.01 0.006 0.002 0.007 0.079 0.182 与对照组比较，*P < 0.05，**P < 0.01。 
图 5 模型组树鼩脑电地形图A：模型组三维旋转图表现1；B：模型组脑电地形图表现1；C：模型组三维旋转图表现2；D：模型组脑电地形图表现2。Figure 5. Typical brain topography of tree shrew PD model group3. 讨论
EEG体现了宏观水平的脑皮质活动，其通过无创记录不同脑区电活动来反映脑功能状态，对辅助诊断疾病甚至较影像学结构改变更早[4]。复杂的随机脑电波信号，在不同的思维状态和病理情况在大脑的皮层位置的反映不同，得到不同反映的EEG[11]。EEG记录到的脑电电场与皮层不同层次锥体神经元的突触电位密切相关，由于不同递质在脑内各区分布存在差异，所以，两侧同步性慢波间断性出现，这种节律说明病灶侵犯皮层下皮质及中脑网状结构，不同脑区的电活动分布也不同。EEG较好地应用于癫痫、AD等人类疾病动物模型研究中[13-15]。
国际脑电图与临床神经生理联盟认为棘波是指脑电图上出现短时、明显突出于背景活动，在规定的纸速下为尖峰状、持续20～70 ms，主要成份为负相、波幅不定的脑电波，棘波是癫痫、PD等疾病异常放电最具特征性的表现。本研究发现树鼩PD模型组记录到棘波、尖波、棘-慢复合波、多棘-慢复合波、尖-慢复合波呈节律性发放，脑电图所描记的脑部异常活动图形主要体现在额部，其次在顶部，提示树鼩PD模型病变造成了脑部局限或弥散的病理表现。
脑电地形图是对多导脑电信号进行二次处理，时域转化为频域分析，先计算出各节律在不同头皮位置上的功率，然后再通过差值运算，得出做图所需像素值，并用彩色或灰度表达其强弱，构成能定量反映大脑机能变化的分布图像，从而把复杂多变的脑机能变化，变成通俗易懂的图形。脑功能受损体现在脑电图功率谱上的一个重要特征就是慢波频带增强[16]。本研究中树鼩PD模型组和对照组慢波低功率δ和θ、快波功率α1和α2的频带功率值与对照组相比显著性增高，提示MPTP诱导的树鼩PD模型脑功能障碍。
EEG在PD研究中具有较高的应用价值，尤其在药物治疗前后通过复查脑电图以判断疗效及预后方面[6，17]。虽然EEG是大脑功能变化较有效检查方法，但需要定期进行脑电图复查，便于准确地发现疾病。本研究树鼩PD模型EEG波形全部表现异常，有较高的特异性，但从波形、功率谱等呈现的数据来看，树鼩也存在个体差异大的情况，造模前后配对的跟踪检测研究有待进一步完善。
国内外树鼩脑电相关研究报道甚少，本研究对树鼩EEG脑电波的采集和后处理、脑电波形图、脑电频谱直方图及脑电地形图详细进行了介绍和研究，对基于EEG的神经疾病模型研究工作有一定应用价值。
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图 1 树鼩脑电描记实验图
A：记录电极安置位置；B：树鼩脑电描记采集保定。
Figure 1. Experimental diagrams of tree shrew brain electroencephalography
图 2 树鼩脑电波波形特征
A：正常对照组；B：树鼩PD模型组典型表现1；C：树鼩PD模型组典型表现2。
Figure 2. Typical brain waveform in tree shrew groups
图 3 树鼩脑电频谱直方图
A：正常对照组；B：树鼩PD模型组典型表现1；C：树鼩PD模型组典型表现2。
Figure 3. Typical brain spectrum histogram of tree shrew PD model group 1
图 4 对照组树鼩脑电地形图
A：对照组三维旋转图表现；B：对照组脑电地形图表现。
Figure 4. Typical brain topography of tree shrew PD model group1
图 5 模型组树鼩脑电地形图
A：模型组三维旋转图表现1；B：模型组脑电地形图表现1；C：模型组三维旋转图表现2；D：模型组脑电地形图表现2。
Figure 5. Typical brain topography of tree shrew PD model group
表 1 实验树鼩脑电各频段的相对能量单位（
$\bar x \pm s $ ）Table 1. Relative energy units of each frequency band of the experimental tree shrew’s EEG （
$\bar x \pm s $ ）组别 δ θ α1 α2 β1 β2 1.0～4.0 Hz 4.0～8.0 Hz 8.0～10.0 Hz 10.5～13.0 Hz 13.5～17.5 Hz 18.0～35.0 Hz 对照组（n = 5） 55.83 ± 19.70 39.48 ± 14.99 8.75 ± 2.67 5.35 ± 0.91 7.33 ± 3.00 7.33 ± 2.84 模型组（n = 5） 1498.66 ± 707.86* 246.05 ± 87.64** 26.06 ± 6.54** 18.96 ± 6.03** 14.87 ± 7.82 10.46 ± 3.52 P 0.01 0.006 0.002 0.007 0.079 0.182 与对照组比较，*P < 0.05，**P < 0.01。 
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