Application of 16SrRNA Gene Detection in the Early Diagnosis of Bacterial Meningitis in Children
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摘要:
目的 探讨脑脊液（cerebrospinal fluid，CSF）中16SrRNA基因检测在儿童细菌性脑膜炎（BM）早期诊断中的应用价值。 方法 收集40例2019年1月至2020年6月间，在昆明市儿童医院确诊为BM患者的CSF标本进行16SrRNA基因PCR检测，16SrRNA基因PCR检测阳性标本进行基因测序，测序结果通过NCBI BLAST进行序列比对和同源性分析，同时进行CSF细菌培养，将CSF 16SrRNA基因PCR检测结果与CSF培养结果进行比较。 结果 40例患儿CSF中16例16SrRNA基因PCR检测阳性，阳性率40%；7例细菌培养阳性，阳性率17.5%，PCR检测法阳性率高于细菌培养法（χ2 = 4.93，P < 0.05），以CSF培养为“金标准”，PCR检测法的灵敏度为71.4%（5/7），特异度为66.7%（22/33）；16SrRNA基因测序结果与CSF培养结果一致，且检测出CSF培养未检出的5种细菌；CSF培养时间为（61.21±12.62）h，PCR检测法所需时间为（7.09±0.45）h，两者之间差异有统计学意义（P < 0.05）。 结论 CSF中16SrRNA基因PCR检测法能提高BM患者CSF中病原菌的检出率，且能降低漏检率，具有特异、快速特点能及时为临床BM早期诊断提供可靠的病原学依据。 Abstract:Objective To explore the value of 16SrRNA gene detection in cerebrospinal fluid （CSF） in the early diagnosis of bacterial meningitis （BM） in children. Methods CSF specimens were collected from 40 patients with BM who were diagnosed of BM in Kunming Children’ s Hospital between January 2019 and June 2020. PCR was used to detect the 16SrRNA gene in the specimens. Then the 16SrRNA gene was sequenced for the positive samples by PCR, and the sequencing results sequence alignment and homology were analyzed by NCBI BLAST. At the same time, all the specimens were cultured simultaneously. Results Of the 40 children’ s CSF samples, 16 were positive for 16SrRNA gene PCR, with a positive rate of 40%; 7 cases were positive for bacterial culture, with a positive rate of 17.5%. The positive rate of PCR method was higher than that of the bacterial culture method （χ2 = 4.93, P < 0.05）, with CSF as the “gold standard”, the sensitivity and specificity of PCR assay were 71.4% （5/7） and 66.7% （22/33）; the results of 16SrRNA gene sequencing were consistent with the results of CSF culture, and five bacterias which were not detected by CSF culture; the time of CSF culture was （61.21±12.62） h, however, the PCR detection time required （7.09±0.45） h, and the difference of detection time between the two methods was statistically significant （P < 0.05）. Conclusion The PCR detection method of 16SrRNA gene in CSF can improve the detection rate of CSF pathogenic bacteria in BM patients, and it can reduce the missed detection rate. It has the specific and rapid characteristics and can provide the reliable pathogenic basis for early diagnosis of clinical BM in time. -
近年来，随着研究者对神经系统的关注增加，各类受体功能的研究成为了热点。而多巴胺系统作为神经系统功能表达的重要组成部分，在各类神经退行性疾病和精神紊乱的机制中起到了重要作用，例如帕金森（Parkinson’ s disease，PD）、亨廷顿病（Huntington disease，HD）、迟发性运动障碍（tardive dyskinesia，TD）、精神分裂症（schizophrenia，SZ）等[1]。在脑内，多巴胺系统主要由分泌多巴胺的神经元和接受多巴胺调控的神经元组成，多巴胺作用于多巴胺受体时能改变下游神经元的兴奋性，从而发挥运动、情感、认知以及神经内分泌等调控作用。目前已知有5种多巴胺受体亚型[2]。在神经系统中，多巴胺受体主要分为D1样受体（dopamine D1-like receptors，D1Rs ）和D2样受体（dopamine D2-like receptors，D2Rs ）2类。其中DRD1在神经系统中表达最为广泛，并在认知、运动、炎症调节、免疫系统功能调节等方面具有重要作用，且在神经炎症的发病机制和病程进展方面扮演了重要角色[3]。DRD1在神经系统中的功能研究将为神经系统疾病的临床治疗和药物研发提供新的靶点和依据。现将DRD1进行综述。
1. DRD1概述
DR是1类位于神经细胞膜上的蛋白质，在多巴胺信号传递过程中发挥着至关重要的作用。目前已分离出5种DR，并根据其生物化学和药理学性质分为D1Rs和D2Rs 2个亚家族。D1Rs包括D1和D5受体（在大鼠也称D1A和 D1B受体），其序列具有高度同源性，并可激活腺苷酸环化酶 （adenylyl cyclase，AC） 途径；D2Rs包括D2、D3和D4受体，其主要是抑制AC途径[4]。
DRD1属于7次跨膜G蛋白偶联受体，是多巴胺（dopamine，DA）信号传递的关键环节。DA与DRD1结合可激活细胞内的信号转导通路，从而参与许多生物学过程的调控，如运动控制、行为奖赏、学习记忆、情绪调节和认知功能等。
1.1 DRD1的结构
DRD1作为1种G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptors，GPCR），由1条大约400个氨基酸残基的肽链构成，分为N端外部区域、7次跨膜区域和C端内部区域[5]。DRD1的7个跨膜疏水结构域分别为TM1、TM2、TM3、TM4、TM5、TM6和TM7[6]，这7次跨膜区域通过跨膜螺旋连接起来，形成受体的核心结构。C端内部区域含有蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）磷酸化位点，这些位点可以调节受体的活性和信号转导过程。
与其他受体亚型相比，DRD1的结构具有一些特殊之处[7]。首先，它的N端外部区域包含了较多的糖基化位点，这提高了受体的稳定性并赋予了它更复杂的功能。其次，DRD1还具有与激动剂（如SKF-38393）和拮抗剂（如SCH-23390）结合的位点，这些位点是药物开发和治疗研究的重要基础。
此外，DRD1的特异性结构为显影剂提供了较好的结合位点。将DRD1抑制剂或激动剂经放射性核素标记后可间接显示出多巴胺受体的分布及表达情况，帮助研究者了解神经系统疾病进程中多巴胺的合成路径、多巴胺受体密度和状态的改变[8-9]，并为神经系统疾病的发病机制、早期诊断、治疗效果评估以及脑认知功能的研究等提供了客观、科学的研究手段。
1.2 DRD1的空间分布
DRD1是在神经系统中表达最广泛的DR亚型[10]。通过免疫荧光双标技术对小鼠大脑皮层中DRD1的空间分布进行标记，实验发现DRD1广泛表达在额叶、顶叶、颞叶和枕叶，且在外嗅皮层表达最为强烈，提示DRD1与短期记忆、情绪控制、嗅觉功能等有关[11]。在额叶皮质区域和内嗅皮层检测到的荧光强度略低于外嗅皮层，但较其他脑区强烈，这些区域主司大脑空间记忆、进食与策略等功能。当前额叶和颞叶联合区域的DRD1表达水平发生变化时，可能导致精神分裂症等精神疾病。而在内侧前叶区和海马表达的DRD1与学习记忆和空间导航的功能有关，此部位DRD1降低可导致认知功能下降。同时，在基底神经节，包括纹状体和壳核，DRD1的表达水平同样较高，说明DRD1在决策制定、运动控制、奖赏学习和成瘾行为中起着关键作用[12]。
除了参与神经系统功能外，DRD1也在大多数免疫细胞中表达，能够抑制炎症小体的形成，进而调节炎症和免疫功能[13]。
2. 功能
2.1 认知功能
多巴胺在认知功能方面发挥着重要作用[14]，目前已经有大量研究证明多巴胺是脑内参与学习、记忆、决策等认知过程的重要神经递质之一，与认知功能联系密切[15−16]。研究发现大脑中的海马、前额叶发挥工作记忆功能与DRD1密切相关[17]。Jonathan Tsang等[18]用遗传学与神经生物学相结合的跨学科方法提供了DRD1与认知表现改变之间可能的机制。在非人灵长类动物中将DRD1拮抗剂输注到前额叶皮层（prefrontal cortex，PFC） 中会诱导工作记忆任务的缺陷，在人类受试者中，混合 DRD1/DRD2 激动剂的给药有助于工作记忆，而只使用DRD2 激动剂没有作用，表明多巴胺 D1 受体对神经认知功能有重要调节作用。M El-Ghundi等[19]利用DRD1缺陷小鼠（D（1）-/-）通过水迷宫实验发现，与野生型（D（1）+/+）和杂合子（D（1）+/-）同窝小鼠相比，DRD1缺陷小鼠的逃逸潜伏期明显更长，并且在探针试验期间没有空间偏差。在视觉提示任务中，DRD1缺陷小鼠的表现优于隐藏平台试验，但逃逸潜伏期略高于DRD1野生型和杂合子同窝小鼠。而幼稚的DRD1缺陷小鼠仅暴露于提示任务时，其逃逸潜伏期与DRD1野生型和杂合子小鼠相同，同时在感觉运动反射、运动活动、自发交替和情境学习在2组之间没有差异。这些结果表明，DRD1缺陷小鼠在空间学习方面存在缺陷，同时没有视觉或运动障碍，因此DRD1参与至少1种形式的认知过程[20]。当小鼠暴露于早期生活压力导致认知能力受损时，其前额叶皮质中的DRD1表达增加。此外[21]，精神分裂症患者DRD1-48A/G基因多态性与记忆功能紧密联系，通过DRD1可以调节前额叶皮层神经元的活动，从而影响认知任务的执行。
2.2 运动控制
多巴胺在运动控制中发挥着重要作用[22]。DRD1参与了运动规划、执行和学习等过程。在纹状体中的DRD1通过调节直接通路神经元（direct pathway neurons，dMSNs）的兴奋性，调控基底神经节的输出并进一步影响丘脑神经元向大脑运动皮层传递运动执行的信号，从而参与运动调控[23]。Darmopil S等[24]在每天施加左旋多巴（levodopa，L-DOPA）（25 mg/kg）的3周内，对小鼠的对侧翻身行为和运动障碍进行检查。用免疫组化方法检测左旋多巴诱导的信号分子和其他蛋白质在病变纹状体中的表达变化。结果显示慢性 L-DOPA 治疗可逐渐诱导野生型半侧帕金森小鼠出现旋转行为和运动障碍。证明多巴胺 D1 受体对于 L-DOPA 诱导的小鼠运动障碍的发生以及去神经纹状体的潜在分子变化至关重要。Kimberley M.Reid等[25]对婴儿帕金森综合征-肌张力障碍中DRD1的功能丧失变异进行了研究，通过全基因组测序显示DRD1在纹状体中表达最高，发现 DRD1 是1种新的疾病相关基因。
2.3 情绪调控
DRD1与情绪调控密不可分。自闭症谱系障碍（autism spectrum disorder，ASD）是一种神经系统发育障碍，与多巴胺能通路息息相关[26]，和ASD相关的遗传改变会调节多巴胺转运蛋白的功能。有研究发现在果蝇模型中2种不同的ASD相关遗传改变会产生相同的神经和行为改变[27]。有研究证明单胺能神经传递系统的改变被怀疑与神经精神疾病（包括抑郁症）的发病机制有关。Eyleen Corrales等[28]通过儿童抑郁量表（children’ s depression inventory，CDI）评估抑郁症状的严重程度，研究了基因型和单倍型关联以及上位效应，在rs1039089与位于DRD1与DRD2基因上游的rs877138之间检测到显着的交互作用，这种新描述的多巴胺受体假定调节区域之间的遗传相互作用可能通过D1-D2异构体的不平衡和认知过程的调节来影响抑郁症状的表现水平，证明DRD1是青少年抑郁症产生的危险因素之一。
2.4 疼痛
DRD1还有可能参与到疼痛感受及相关情感反馈之中[29]；齿状回作为海马形成的重要门户，在疼痛的调节中起着重要作用，在海马区使用D1受体拮抗剂之后，可以使小鼠的疼痛反应更加剧烈进而产生相应的情绪反馈。
2.5 药物成瘾
多巴胺受体D1与药物成瘾等高危行为有很大联系。延迟贴现（delay discounting，DD）是指奖励的现值因延迟收到而减少[30]，通过测量奖励敏感性的延迟折扣任务来衡量个体冲动的大小。近年来一些研究人员还在检查吸毒成瘾、赌博、减肥和其他以自我控制受损为特征的疾病时，将延迟贴现的测量、奖励主观估值随时间的变化整合到他们对成瘾的研究中[31−32]。调查发现[33]，DRD1 rs686可调节不同药理状态下阿片类药物（如海洛因）的DD评分，并与药物使用冲动密不可分。另外个体基因组中与尼古丁代谢、感受以及成瘾性的相关基因遗传变异对尼古丁成瘾和戒烟有显著影响，在2项关于戒烟治疗的随机临床试验中对13个编码尼古丁乙酰胆碱受体和参与多巴胺奖励系统的蛋白质的区域进行了核磁共振分层分析。分析发现DRD1的 3 个单核苷酸多态性具有显著的交互作用[34]，且与尼古丁依赖密切相关。
2.6 炎症与免疫
有文章报道指出，DA和DRD1信号可以通过环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）负调控NLRP3炎症小体，从而阻止NLRP3炎症小体依赖的炎症，例如神经毒素等诱导的神经炎症[35]。说明DRD1参与了抑制神经炎症的过程。
DA及D1R激动剂能抑制人外周血CD4+、CD25+T细胞和单核细胞合成儿茶酚胺，同时能够降低酪氨酸羟化酶mRNA的表达从而进一步抑制儿茶酚胺的产生。有研究表明[36−37]，儿茶酚胺可以引起普遍的免疫抑制，并借此直接影响细胞免疫和体液免疫尤其对细胞免疫抑制效果显著[38−39]。
DRD1对免疫细胞的生理功能具有调节作用，并借此对炎症抑制产生作用。树突状细胞是免疫系统中1种极为重要的抗原呈递细胞，可以产生诸多调节分子，并向处于静息状态的T细胞释放DA，以此决定辅助性T细胞向Th1、Th2或Th17亚群的分化方向。此外，星形胶质细胞中也表达DRD1，并通过DRD1提高胞内cAMP水平[40]。在激活星形胶质细胞DRD1时，其所分泌的成纤维生长因子-2（fibroblast growth factor-2，FGF-2）增加[41]，通过非经典的DA受体通路，即磷脂酰肌醇关联的通路，来介导DA对神经元的保护作用[42]。因此，DRD1不仅直接通过cAMP负调控NLRP3炎症小体从而抑制神经炎症，亦可通过调控神经细胞生理活动来抑制神经炎症。
3. DRD1相关信号通路
DRD1作为多巴胺受体家族中的一员，在中枢神经系统功能的调控中扮演着重要角色，作为1种G蛋白偶联受体，它能激活多种信号通路来调节细胞功能，在认知、运动控制和情绪调节等重要生理过程中发挥着关键作用。
3.1 蛋白激酶A（PKA）信号通路
DA与D1类多巴胺受体结合后，激活与之偶联的AC，促进cAMP生成，从而激活 cAMP依赖的PKA[43]，来调控细胞内的许多信号通路并参与蛋白质的磷酸化过程。
在黑质纹状体通路中，D1类受体正性调控cAMP的水平。DRD1通过与激活型 G 蛋白 Gs 偶联后，提高细胞内cAMP水平，激活PKA，PKA磷酸化细胞质和细胞核因子，调控细胞代谢。包括离子通道功能，使跨膜 G 蛋白偶联受体去敏感化，导致细胞神经递质释放，使得突触后细胞表现出兴奋性效应，增加黑质纹状体中DA的释放，激活DA能神经元，进而改善帕金森综合征的运动失调症状[44]。
cAMP响应元件结合蛋白(cAMP response element binding protein，CREB）是1种真核细胞生物核内蛋白质，具有调节基因转录、增强突触可塑性和改善记忆障碍的功能[45]。在纹状体神经元中DRD1能激活cAMP/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB）/CREB通路[46]，上调cAMP水平而发挥其功能活性[47−48]。cAMP生成后可激活PKA，进而磷酸化CREB，从而调控基因的转录和表达。研究表明，抑郁症与海马 cAMP-CREB 通路异常活化密切相关，抗抑郁剂可特异性上调海马此通路的功能。CREB 被认为是抗抑郁剂的靶基因之一[49−51]。
DRD1通过cAMP负调控NLRP3炎症小体，cAMP与NLRP3结合，并通过MARCH7酶的作用，促进其泛素化和降解。DA和DRD1信号转导可以预防NLRP3炎症小体依赖性炎症，包括神经毒素诱导的神经炎症、脂多糖诱导的全身炎症和尿酸单钠晶体（MSU）诱导的腹膜炎症等[52]。
3.2 蛋白激酶C（PKC）信号通路
PKC是磷酸酰肌醇等途径信号转导的主要介质，介导多种信号通路[53]，早在1989年，Felder等[54]就报道称，D1受体激动剂SKF 82526在肾小管膜中独立于cAMP刺激磷脂酶C （phospholipase C，PLC）活性，PLC的激活导致三磷酸肌醇（inositol triphosphate，IP3）和二酰甘油（diacylglycerol，DAG）的产生，最终导致PKC被DAG激活，并增加细胞内钙的动员以响应IP3[55]；在既往的研究中，研究者通过使用水杨酸（salicylic acid，SS）来抑制γ-氨基丁酸（gamma-aminobutyric acid，GABA），实验后发现，该过程中D1受体及其下游分子蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）受到影响[56]，进一步证实了DRD1对PKC的调控作用。DRD1功能缺失可引起原发性高血压的发生，其原因便是DRD1对PKC调节功能丧失[57−58]；综上所述，DRD1的激活可以激活PKC，从而影响细胞内信号传递、细胞增殖、细胞凋亡等生物学过程。
3.3 钙离子内流
DRD1的激活还可以直接或间接地调节细胞内钙离子的浓度，通过控制钙离子通道的开放和关闭，调节细胞内的信号传导和细胞功能。甲基苯丙胺（methamphetamine，METH）作为一种苯丙胺类兴奋剂，主要通过作用于 DA 转运蛋白和囊泡单胺转运蛋白-2 （vesicular monoamine transporter-2，VMAT-2） 来诱导细胞外和细胞质 DA 释放[59]；大麻二酚（cannabidiol，CBD）是大麻植物中的主要非精神活性大麻素，在治疗神经精神疾病方面应用广泛，包括癫痫、PD、AD、抑郁症、焦虑症、精神病和药物依赖[60−61]。而METH和CBD都是通过与DA竞争性结合 DRD1，导致细胞内钙离子超载来发挥作用。
4. 小结
综上所述，DRD1是人体内的重要受体，在神经系统中作用广泛。DRD1接受多巴胺及DRD1激动剂的刺激，发挥出与认知、记忆、运动、情绪、成瘾等相关的调控作用。目前被广泛研究的信号通路主要有3条，分别通过PKA、PKC、钙离子浓度变化来发挥作用。
随着研究深入，人们发现DRD1可能通过影响一些炎症因子的生成来抑制炎症反应，这在神经炎症发生发展和免疫调节中有着重要意义。
DRD1在学习记忆、认知、运动等神经系统功能中的作用为相关疾病的预防、诊断、治疗及预后方面具有重要价值，同时也为相关神经系统疾病的研究指明了方向。目前，有关DRD1的信号通路尚未完善，与炎症和免疫有关的证据不够充分，与部分疾病的关系不够明确，还需要进一步研究，以期为临床神经系统疾病诊治和功能调节提供新的依据和技术。
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图 1 16例CSF临床样本16SrRNA基因PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳
M：DNA Marker；1：阴性对照（EBV）；2：阳性对照（金黄色葡萄球菌）；3～4：为大肠埃希菌；5：肺炎克雷伯杆菌；6：肺炎链球菌；7：无乳链球菌；3～7为两种方法检测均为阳性；8～18为细菌培养阴性，而16SrRNA基因PCR基因检测阳性标本。
Figure 1. Agarose gel electrophoresis of 16SrRNA gene PCR amplification products from clinical samples of 16 cerebrospinal fluid
表 1 40例细菌性脑膜炎患儿一般情况分析[n（%）]
Table 1. Analysis of general situations of 40 children with bacterial meningitis [n（%）]
项目 基本信息 总计 年龄 新生儿（< 28 d） 14（35.0） 28 d～1岁 16（40.0） 1～3岁 6（15.0） 大于3岁 4（10.0） 性别 男 17（42.5） 女 23（57.5） 临床表现 发热 30（75.0） 抽搐 6（15.0） 头痛 11（27.5） 呕吐 8（20.0） 腹泻 5（12.5） 病理征 4（10.0） 脑膜刺激征 7（17.5） 膝反射 4（10.0） 脑脊液改变 白细胞数（106/L） < 50 4（10.0） 50～500 13（32.5） 501～1000 5（12.5） > 1000 15（37.5） 腰穿前是否使用过抗生素 是 28（70） 否 12（30） 基础疾病 外伤 2（5.0） 手术后脑积水 5（12.5） 临床转归 康复或痊愈 29（72.5） 后遗症 5（12.5） 死亡/放弃治疗 1（2.5） 
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表 2 40例细菌性脑膜炎患儿血培养、CSF培养、CSF细菌涂片及CSF16SrRNA基因检测阳性率比较[n（%）]
Table 2. Comparison of blood culture，CSF culture，CSF bacterial smear and CSF 16SrRNA gene detection positive rate of 40 children with bacterial meningitis [n（%）]
方法 阳性率 χ2 P 血培养 6（15.0）* 脑脊液培养 7（17.5）* 脑脊液细菌涂片 4（10.0）* 12.94 0.005 脑脊液16SrRNA 基因PCR法 16（40.0） 与1616SrRNA基因检测法比较，*P < 0.05。
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表 3 16SrRNA基因PCR检测结果与细菌培养结果比较（n）
Table 3. Comparison between 16SrRNA gene PCR and bacterial culture results （n）
16SrRNA基因PCR法 脑脊液细菌培养法 合计 χ2 P 阳性 阴性 阳性 5 11 16 阴性 2 22 24 4.93 0.026 合计 7 33 40
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表 4 各年龄段两种不同方法检测病原菌分布情况（n）
Table 4. Two different methods to detect the distribution of pathogens in each age group （n）
病原菌 病原菌检测方法 < 28 d 28 d～1岁 1～3岁 ≥3岁 总计 脑脊液培养 16SrRNA基因PCR法 大肠埃希氏菌 4 6 3 3 0 0 6 肺炎克雷伯 1 1 0 0 1 0 1 肺炎链球菌 1 1 0 0 1 0 1 无乳链球菌 1 1 1 0 0 0 1 金黄色葡萄球菌 0 1 0 0 1 0 1 溶血性葡萄球菌 0 2 0 1 1 0 2 流感嗜血杆菌 0 2 1 0 1 0 2 表皮葡萄球菌 0 1 0 0 1 0 1 鞘氨醇单胞菌 0 1 0 0 0 1 1 总计 7 16 5 4 6 1 16
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