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依托咪酯在不同程度烧伤患者体内的药代动力学

袁枫 角述兰 陈瑞 向兵兵 思永玉

王禹雪, 张华莉, 陈理军, 陆永萍. 一种经济的乳兔骨髓来源的肥大细胞诱导培养及鉴定[J]. 昆明医科大学学报, 2023, 44(6): 1-5. doi: 10.12259/j.issn.2095-610X.S20230622
引用本文: 袁枫, 角述兰, 陈瑞, 向兵兵, 思永玉. 依托咪酯在不同程度烧伤患者体内的药代动力学[J]. 昆明医科大学学报, 2021, 42(6): 94-97. doi: 10.12259/j.issn.2095-610X.S20210637
Yuxue WANG, Huali ZHANG, Lijun CHEN, Yongping LU. An Economical Method for Cultivation and Identification of Mast Cell Derived from Suckling Rabbit Bone Marrow[J]. Journal of Kunming Medical University, 2023, 44(6): 1-5. doi: 10.12259/j.issn.2095-610X.S20230622
Citation: Feng YUANG, Shu-lan JIAO, Rui CHEN, Bing-bing XIANG, Yong-yu SI. Pharmacokinetics of Etomidate in Patients with Different Degrees of Burn[J]. Journal of Kunming Medical University, 2021, 42(6): 94-97. doi: 10.12259/j.issn.2095-610X.S20210637

依托咪酯在不同程度烧伤患者体内的药代动力学

doi: 10.12259/j.issn.2095-610X.S20210637
基金项目: 云南省科技厅-昆明医科大学应用基础研究联合专项基金资助项目(2014FZ027)
详细信息
    作者简介:

    袁枫(1993~),男,四川南充人,医学硕士,住院医师,主要从事烧伤患者的药代动力学研究及病态肥胖患者临床麻醉工作

    通讯作者:

    角述兰,E-mail:ynkmjsl5@163.Com

  • 中图分类号: R614.2+4

Pharmacokinetics of Etomidate in Patients with Different Degrees of Burn

  • 摘要:   目的  研究依托咪酯在不同程度烧伤患者体内的药代动力学。  方法  选取行切痂植皮烧伤患者45例,按轻中重度烧伤分为A、B、C 3组,每组15例。45例患者开始以舒芬太尼TCI给药,TCI舒芬太尼15 min(Tt15)时开始静脉恒速泵注依托咪酯(0.4 mg/kg),2 min泵注结束,辅以罗库溴铵,右美托咪定,七氟烷麻醉维持,维持BIS值在40~60。在TCI开始后20、30、40、50、60、90 min及TCI停药时(停时)和TCI停药后1、3、5、8、10、20、30 min时间点采集动脉血2 mL,测定标本血浆中依托咪酯的Cm,计算药代动力学参数。  结果  C组的K31、CL1、CL3小于A组和B组(P < 0.05);C组的V3、T1/2r 大于A组和B 2组(P < 0.05)。A组和B组的K31、CL1、CL3、V3、T1/2r组间,差异无统计学意义(P > 0.05)。  结论  重度烧伤患者依托咪酯药代动力学参数中,K31变小、V3增加、CL1、CL3降低,T1/2r明显延长,可适当减少用药剂量。
  • 九十年代初期的研究表明,在动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)形成过程中,动脉内膜和外膜层聚集着肥大细胞(mast cells,MCs),首次提出MCs参与AS进程[1]

    血管的微环境一旦发生变化,炎性细胞便会从血管外膜的滋养血管中渗出,参与疾病的变化[2-3]。MCs激活时释放出来的趋化因子、细胞因子、组胺、白三烯等炎症因子[4]使血管的通透性增加,导致单核巨噬细胞和淋巴细胞聚集到斑块处[5],释放出大量的中性蛋白酶,可以加速低密度脂蛋白(low-density lipoprotein,LDL)进入到血管内膜局部并聚集[6],促进AS斑块形成。

    在骨髓细胞向MCs分化及活化过程中白细胞介素3(interleukin-3,IL-3)和干细胞因子(stem cell factor,SCF)起到重要作用[7-8]。本研究旨在通过提取乳兔骨髓细胞,利用IL-3、SCF、β-巯基乙醇联合作用诱导培养骨髓来源肥大细胞并鉴定其纯度与活性,为进一步研究肥大细胞与AS的关系提供依据。

    IL-3、SCF(美国Peprotech公司);FBS、DMEM、DMEM/F12、RPMI-1640(美国Gibco公司);实验动物:2周龄乳兔,昆明医科大学实验动物学部,环境条件符合国家实验动物环境及设施标准要求,室内保持安静、清洁、干燥和通风。自由饮水。实验动物使用许可证号:SCXK(滇)2015-0002。

    1.2.1   兔骨髓细胞的获取

    麻醉:(经2周龄乳兔耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠,1 mL/kg)→浸泡(75%C2H5OH,10 min)→剥离(后肢皮肤切开,逐层分离,剥离肌肉)→暴露股骨→取出→浸泡(75% C2H5OH的无菌培养皿中浸泡3~5 min)→股骨两端剪去→吹打骨髓(吸取DMEM高糖培养基后吹打骨髓,股骨变白)→获取细胞(1000 r/min,5 min。如果在获取的细胞中有较多红细胞,则应用红细胞裂解液进行处理)→培养体系(含84 mL DMEM高糖培养基、15 mL FBS、1 mL双抗)。

    1.2.2   细胞的培养

    接种到T25瓶中(含DMEM高糖培养基)→隔天换液→细胞铺满→消化细胞→新培养瓶→贴壁→改用F12诱导培养基(含84 mL DMEM/F12、15 mL FBS、1 mL双抗、10 ng/mL SCF、10 ng/mL IL-3及0、10×10-5 mol/L的β-巯基乙醇)→放置37 ℃、5% CO2 饱和湿度环境→隔天换液→镜下观察细胞有变圆→更换为1640促成熟培养基(含84 mL RPMI 1640、15 mFBS、1 mL双抗、10 ng/mL SCF、10 ng/mL IL-3及0、10×10-5 mol/L的β-巯基乙醇)→7 d换液→直至细胞诱导成熟。

    1.2.3   肥大细胞功能学鉴定

    诱导成熟的重悬细胞液→载玻片→干燥→甲苯胺蓝染色→95% C2H5OH脱色→清洗→镜下观察。

    1.2.4   肥大细胞形态学鉴定

    通过光镜下观察不同培养时间的细胞形态,直至诱导成熟。

    消化细胞→洗2次(PBS)→细胞密度1×10 7个/mL→每管100 μL→单染管各加入5.0 μL的 CD117-PE抗体及FcεR1α-FITC抗体→双染管加两种抗体→空白对照管(无抗体)→避光孵育30 min→每管加1 mL PBS→离心10 min(400 g)→去上清→上法洗涤1次→去上清→每管加100 μL PBS→检测。

    2 d后开始出现以形态为长梭形的贴壁细胞;7 d时:细胞基本将培养瓶铺满;2周时:细胞逐渐变形;4周时:细胞基本变为圆形,悬浮细胞变多;6周时:细胞基本变为类圆形,且形态均匀具有折光性(图1)。

    图  1  肥大细胞变形过程(100×)
    A:7 d时长梭形贴壁细胞;B:2周时细胞逐渐变形;C:4周时细胞逐渐变圆;D:6周时变为类圆形细胞。
    Figure  1.  Changes in mast cells(100×)

    培养6周细胞成熟后利用甲苯胺蓝染色:可以观察到细胞质为紫红色,细胞核为蓝色。异染颗粒的细胞加入β-巯基乙醇比不加入β-巯基乙醇的能得到更多(图2)。

    图  2  甲苯胺蓝染色(100×)
    A:β-巯基乙醇浓度0 mol/L;B:β-巯基乙醇浓度10×10-5 mol/L。
    Figure  2.  Toluene blue staining(100×)

    培养6周收集细胞,利用流式细胞术检测细胞表面CD117及FcεR1α的表达情况,加入β-巯基乙醇双阳性细胞的比例达96.2%,大于不加入β-巯基乙醇的(图3),且与不加β-巯基乙醇相比有统计学意义(P < 0.05),见表1

    图  3  流式细胞仪检测细胞的双阳性率
    A:β-巯基乙醇为0 mol/L;B:β-巯基乙醇为10×10-5 mol/L。
    Figure  3.  Double positive rate of cells detected by flow cytometry
    表  1  不同浓度β-巯基乙醇诱导后CD117+ FcεRIα+肥大细胞的比例
    Table  1.  The proportion of CD117+ FcεRIα+ mast cells induced by different concentrations of β-mercaptoethanol
    β-巯基乙醇
    (mol/L)
    实验次数CD117+ FcεRIα+
    肥大细胞的比例(%)
    P
    0548.97 ± 3.120.7069
    10×10−55 95.64 ± 4.66#
      与β-巯基乙醇浓度为0 mol/L比较,#P < 0.05。
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    在正常人的心脏、主动脉及脂肪组织中有少量的MCs存在,当人类发生疾病时MCs的数量就会增多,比如AS。近年来,研究表明MCs在AS的发生、发展及斑块稳定性中有着重要作用[9]

    当下有研究认为MCs是利用其表面的趋化因子受体-3与AS斑块中表达的嗜酸细胞活化CC趋化因子亚族中趋化因子配体-11结合而向病变部位聚集[10]。MCs起源于骨髓造血干细胞[11],促进MCs成熟的分子主要有SCF和神经生长因子(nerve growthfactor,NGF)[17],SCF可能在MCs向受累区域聚集发挥作用,而MCs侵入受累区域可能会进一步导致更多的炎性细胞浸润,促进AS斑块形成。

    IL-3又被叫做肥大细胞生长因子,在MCs的生长、分化、迁移和效应中具有重要作用。活化T细胞、天然杀伤(NK)细胞和MCs都可产生IL-3,且对于SCF在MCs前体的发生、发展、扩增具有促进意义[12-13]。SCF的配体CD117(c-kit)除在其表面外,各种造血祖细胞中均可存在。MCs发挥重要表面标志的是FcεRIα,但FcεRIα还表达于嗜酸性粒细胞等细胞表面,只有MCs同时表达CD117和FcεRIα[14]。甲苯胺蓝染色是一种常用于识别及判断MCs功能状态的方法,同时也是MCs的特异性染色,可染细胞核为蓝色,胞质内为异染性紫红色颗粒,说明其具有吞噬功能[15]。通过甲苯胺蓝染色和流式细胞仪检测结果对诱导获得的MCs的纯度进行鉴定,就目前来说,利用兔的骨髓间质干细胞来诱导培养MCs的报道是极少的。

    本研究选用2周龄的乳兔来获取骨髓间质干细胞,因为当兔龄大于或者小于2周龄时,笔者发现细胞生长速度变得缓慢,可能是2周龄的骨髓间质干细胞的活性更好,更有利于细胞的培养。当IL-3浓度10 ng/mL、SCF浓度为10 ng/mL,加入β-巯基乙醇时:甲苯胺蓝染色及流式检测均较不加入β-巯基乙醇时可以获取更多、双阳性率更高的MSc,原因可能为β-巯基乙醇作为一种还原剂,在降低氧对细胞产生氧化损伤的同时促进干细胞生长。所以该培养体系是一种良好的体外诱导培养体系,其操作简单,且能获得更加成熟、更具有典型特征的MCs,为下一步对兔行进炎性损伤研究提供了优势。综上所述,本研究利用形态学、功能学2个方面对诱导的兔骨髓来源MCs进行鉴定,培养出的细胞不仅具有成熟MCs的生物学特性,还具有其功能,这便为后续的基础研究及临床研究奠定基础。

  • 表  1  一般情况($\bar x \pm s$

    Table  1.   General information ($\bar x \pm s$

    项目A组(n = 15)B组(n = 15)C组(n = 15)
    术前白蛋白(g/L) 39.8 ± 5.4* 36.7 ± 4.5* 29.8 ± 3.8
    术前ALT(U/L) 33.8 ± 21.9* 34.0 ± 26.24* 117.8 ± 86.0
    出血量(mL) 149 ± 89.1* 134 ± 56.4* 427 ± 189.2
      与C组比较,*P < 0.05。
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    表  2  依托咪酯药代动力学参数($\bar x \pm s$

    Table  2.   Pharmacokinetical parameters of Etomidate ($\bar x \pm s$

    项目A组(n = 15)B组(n = 15)C组(n = 15)
    T1/2α(min) 2.48 ± 0.83 2.29 ± 0.67 2.33 ± 0.52
    T1/2β(min) 24.54 ± 2.62 25.50 ± 4.72 25.01 ± 5.37
    T1/2r(min) 257.97 ± 51.11a 275.47 ± 40.92a 357.47 ± 60.5
    V1(L) 4.92 ± 1.29 5.14 ± 1.04 4.87 ± 1.12
    V2(L) 16.22 ± 3.12 14.52 ± 2.13 15.26 ± 2.11
    V3(L) 117.11 ± 22.12* 114.20 ± 19.15* 141.61 ± 28.21
    CL1(L/min) 1.41 ± 0.39* 1.37 ± 0.27* 1.09 ± 0.29
    CL2(L/min) 1.07 ± 0.21 0.91 ± 0.17 0.99 ± 0.18
    CL3(L/min) 0.97 ± 0.14* 0.89 ± 0.18* 0.68 ± 0.19
    K10(min−1 0.287 ± 0.014 0.266 ± 0.013 0.223 ± 0.043
    K12(min−1 0.271 ± 0.029 0.177 ± 0.016 0.172 ± 0.022
    K21(min−1 0.066 ± 0.004 0.065 ± 0.003 0.065 ± 0.017
    K13(min−1 0.197 ± 0.032 0.173 ± 0.033 0.139 ± 0.025
    K31(min−1 0.008 28 ± 0.002 9* 0.0079 ± 0.001 7* 0.004 81 ± 0.000 9
      与C组比较,*P < 0.05。
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出版历程
  • 收稿日期:  2021-04-19
  • 网络出版日期:  2021-07-09
  • 刊出日期:  2021-07-21

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