Anesthetic Effects and Mechanism of Hydromorphone Combined with Propofol on Colorectal Dilatation Model
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摘要:
目的 研究氢吗啡酮复合丙泊酚用于无痛肠镜检查的麻醉效果，并探讨氢吗啡酮产生内脏痛镇痛作用的机制。 方法 将清洁级雄性SD大鼠随机分成4组：正常组；丙泊酚组；芬太尼复合丙泊酚组；氢吗啡酮复合丙泊酚组。模型大鼠麻醉10 min后，利用充分润滑的气囊，分别进行1次/5 min，每次持续30 s的结直肠扩张。观察记录各组腹壁撤回反射（AWR3）评分，利用ELISA检测肾上腺素，去甲肾上腺素含量，利用Western blot 检测MAPK p38表达变化。 结果 （1）腹腔注射给药10 min后，丙泊酚组的腹壁撤回反射（AWR3）评分数值明显高于芬太尼复合丙泊酚组以及氢吗啡酮复合丙泊酚组（P < 0.0001）。3组均在腹腔注射给药15 min后到达AWR3评分数值最低点，腹部给药20 min后，芬太尼复合丙泊酚组以及氢吗啡酮复合丙泊酚组的AWR3评分数值与给药10～15 min时相比虽有上升，但仍维持在较低水平；（2）芬太尼复合丙泊酚组以及氢吗啡酮复合丙泊酚组的肾上腺素含量，去甲肾上腺素含量与丙泊酚组大鼠相比均有明显降低（肾上腺素：P = 0.0023，P = 0.0002；去甲肾上腺素：P < 0.0001）；（3）芬太尼复合丙泊酚组以及氢吗啡酮复合丙泊酚组的p-p38/p38比值与丙泊酚组大鼠相比均有明显降低（P < 0.0001）。 结论 氢吗啡酮复合丙泊酚能有效抑制p38MAPK的磷酸化，从而缓解疼痛。 Abstract:Objective To study the anesthetic effect of hydrocodone combined with propofol for painless colonoscopy and to investigate the mechanism of the analgesic effect produced by hydrocodone. Methods Clean grade male SD rats were randomly divided into four groups: normal group; propofol group; fentanyl combined with propofol group; hydromorphone combined with propofol group. After the model was anesthetized for 10 minutes, colorectal dilation was performed using a fully lubricated balloon for once per 5 min, each lasting 30 s. The abdominal wall withdrawal reflex （AWR3） scores of each group were recorded, and epinephrine and norepinephrine content were detected by ELISA. MAPK p38 expression changes were detected by western blot. Results （1） 10 minutes after abdominal administration of propofol, the AWR3 scores of the propofol group were significantly higher than those of the fentanyl combined with propofol group and the hydromorphone combined with propofol group （P < 0.0001, P < 0.0001）. The lowest AWR3 scores were reached 15 minutes after abdominal administration in all three groups. 20 minutes after abdominal administration, the AWR3 scores in the fentanyl combined with propofol group and the hydromorphone combined with propofol group were higher than those in the 10 and 15 minutes, but remained low. （2） The contents of epinephrine and norepinephrine in the fentanyl combined with propofol group and the hydromorphone combined with propofol group decreased significantly compared with those in the propofol group （epinephrine: P = 0.0023, P = 0.0002; norepinephrine: P < 0.0001, P < 0.0001）. （3） The p-p38/p38 ratio was significantly reduced in the fentanyl combined with propofol group and the hydromorphone combined with propofol group （P < 0.0001, P < 0.0001） compared with the propofol group rats. Conclusion Hydromorphone combined with propofol can effectively inhibit the phosphorylation of p38MAPK, thereby relieving pain. -
Key words:
- Painless enteroscopy /
- Hydromorphone /
- Propofol /
- p38MAPK
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肠镜检查是临床中肠道疾病的常规检查，但普通肠镜作为一种侵入性的临床操作，操作时间长，可刺激肠道反射性痉挛，导致诸多不良反应如腹部胀痛、恶心呕吐等[1-2]。无痛肠镜检测通过进行适当的镇静、镇痛，可有效减少疼痛与不适，进而减轻应激性损伤，同时也提供良好的操作条件，有助于更仔细、彻底地完成检查和治疗[3-4]。作为常用于侵入性操作的麻醉性镇静药物，丙泊酚起效快，苏醒质量高，在体内无蓄积，但存在镇痛效果弱，对呼吸循环系统有明显抑制作用的缺点，因此常复合应用镇痛药[5-8]。本文旨在研究氢吗啡酮复合丙泊酚用于无痛肠镜检查的麻醉效果，并初步探讨氢吗啡酮产生内脏痛镇痛作用的机制。
1. 材料与方法
1.1 模型制备
清洁级雄性SD大鼠（体重 295～360 g）购自昆明医科大学动物研究中心（动物许可证号SCXK（滇）k2015-0002），动物饲养室的室温20 ℃～24 ℃，相对湿度55%～65%，自由摄食饮水，适应性饲养1周后开始实验。实验前禁食24 h。将大鼠通过随机数字法随机分成4组：正常组（n = 12）：腹腔注射0.9% 生理盐水，丙泊酚组（n = 12）：腹腔注射丙泊酚30 mg/kg；芬太尼复合丙泊酚组（n = 12）：腹腔注射芬太尼50 μg/kg + 丙泊酚30 mg/kg；氢吗啡酮复合丙泊酚组（n = 12）：腹腔注射氢吗啡酮0.2 mg + 丙泊酚30 mg/kg。正常组不做特殊处理，其余大鼠麻醉10 min后，将涂以石蜡油，充分润滑的气囊经大鼠肛门缓慢插入至直肠内6～7 cm，用医用胶带固定体外导管，缓慢注气至60 mmHg，分别进行1次/5 min，每次持续30 s的结直肠扩张。
1.2 行为反应评分
将大鼠放入无盖的有机玻璃箱中（20 cm ×15 cm ×15 cm），观察每次注气时大鼠的行为反应，按照腹壁撤回反射（AWR3）评分标准（0分，大鼠无明显行为变化；1分，大鼠身体不动或仅有简单的头部运动；2分，大鼠腹部肌肉开始收缩；3分，大鼠下腹壁抬离箱底或明显收缩变平；4分，大鼠腹壁拱起或伴身体、骨盆躬起），在注药后10，15，20，25 min 4个时间点对腹壁撤回反射的强度进行评分[9]。
1.3 酶联免疫吸附实验（ELISA）
各组大鼠予以腹主动脉采血，所取样本静置后离心取上清液，-80 ℃冰箱保存。参照肾上腺素（epinephrine，E）试剂盒以及去甲肾上腺素（norepinephrine，NE）试剂盒（均购于武汉默沙克）的操作指南进行酶联免疫吸附实验测定血清中肾上腺素以及去甲肾上腺素的浓度。
1.4 Western blot
取适量脊髓样本加入组织裂解液提取总蛋白，根据试剂盒说明使用BCA试剂盒测定蛋白浓度，蛋白变性后转膜至PVDF膜，脱脂奶粉室温封闭后，加入一抗p38（1∶1000），p-p38（1∶1000）（均购于abcam公司）4 ℃过夜，后加入二抗（1∶2000）室温下孵育2 h。ECL法显影，β-actin为内参，目的蛋白与β-actin蛋白灰度比为相对蛋白含量。
1.5 统计学处理
计量资料服从正态分布，并通过GraphPad Prism 9.0 软件（graphpad software，san diego，CA）进行统计分析。数据表达均以平均数±标准差（
$ \bar{x}\pm s $ ）表示，组间比较采用单因素方差分析，如有差异进一步用Tukey’ s Multiple Comparison Test进行两两比较。在图中以连线表示比较的组别，P < 0.05为差异有统计学意义。2. 结果
2.1 大鼠行为反应
腹腔注射给药10 min后，丙泊酚组的腹壁撤回反射（AWR3）评分数值明显高于芬太尼复合丙泊酚组以及氢吗啡酮复合丙泊酚组（P < 0.0001），而芬太尼复合丙泊酚组以及氢吗啡酮复合丙泊酚组之间的AWR3评分数值差异无统计学意义。3组均在腹部给药15 min后到达AWR3评分数值最低点，证明镇静镇痛效果在腹部给药15 min后最佳。随后，腹部给药20 min后，丙泊酚组的AWR3评分数值开始上升，证明丙泊酚组的镇静镇痛效果开始减弱，而芬太尼复合丙泊酚组以及氢吗啡酮复合丙泊酚组的AWR3评分数值与给药10～15 min时相比虽有上升，但仍维持在较低水平，证明丙泊酚复合镇痛药氢吗啡酮或芬太尼后，对结直肠扩张模型的镇静镇痛时效有明显的提高，见图1。
图 1 大鼠腹壁撤回反射（AWR3）评分数据表达以平均数±标准差（$\bar {x}\pm s$ Figure 1. Abdominal withdrawal reflex （AWR3） score2.2 各组肾上腺素，去甲肾上腺素的含量
ELISA检测结果显示，与正常组大鼠比较，丙泊酚组大鼠血清中肾上腺素（E）（P < 0.0001），去甲肾上腺素（NE）（P < 0.0001）的含量均有明显上升，而芬太尼复合丙泊酚组以及氢吗啡酮复合丙泊酚组的肾上腺素，去甲肾上腺素的含量与丙泊酚组大鼠相比均有明显降低（肾上腺素：P = 0.0023，P = 0.0002；去甲肾上腺素：P < 0.0001，P < 0.0001），且2组之间差异无显著统计学意义（P > 0.05），见图2。
图 2 肾上腺素，去甲肾上腺素浓度检测A：肾上腺素；B：去甲肾上腺素。*P < 0.05，**P < 0.01，****P < 0.000 1。Figure 2. Determination of epinephrine and norepinephrine.2.3 各组MAPK p38表达变化
WB检测结果显示，与正常组大鼠比较，丙泊酚组大鼠血清中p-p38/p38比值有明显上升（P < 0.0001），而芬太尼复合丙泊酚组以及氢吗啡酮复合丙泊酚组的p-p38/p38比值与丙泊酚组大鼠相比均有明显降低（P < 0.0001>），且2组之间差异无统计学意义（P > 0.05），见图3。
3. 讨论
由于现代社会的生活压力剧增，人们的饮食水平改变，肠道疾病频发[10]，而肠镜检查作为消化内科的常规诊断和治疗手段，可以直接观察到肠道粘膜颜色，病变的部位以及性质，同时还能进行活检和微创手术治疗[11-12]。然而，由于肠镜检查过程会对肠道及肠系膜造成牵拉刺激，产生牵涉痛以及神经性痉挛，而对结直肠的刺激导致交感神经过度兴奋，造成恶心、呕吐、呛咳、呃逆、躁动不安、窦性心动过速及高血压等应激反应[13-14]。接受无痛肠镜时患者处于浅麻醉状态，既要保证在肠镜检查过程中充分镇静和镇痛，又要保证麻醉后能迅速恢复，且应考虑有效降低术中以及术后的麻醉风险[15-16]。丙泊酚是一种烷基酸类短效静脉麻醉药物，广泛应用于临床短小手术和操作的麻醉与镇静[17-18]。丙泊酚具有起效快，麻醉平稳，苏醒完全等特点，但由于其镇痛作用弱，单独使用时所需剂量较大，可能造成呼吸抑制和呼吸暂停及循环暂停，故临床上常需复合应用镇痛药[19-21]。芬太尼是常用的阿片类药，但其呼吸抑制明显，常导致缺氧甚至窒息等麻醉风险[22-23]。本文主要验证了氢吗啡酮复合丙泊酚对大鼠结直肠扩张内脏痛的镇静镇痛作用，以及氢吗啡酮复合丙泊酚对MAPK通路的抑制作用。
氢酮吗啡是一种半合成阿片类镇痛药，主要作用于阿片μ受体，较少作用在δ受体[24-25]。其镇痛作用强，是吗啡的5～8倍，且麻醉起效快，主要代谢产物无活性，不良反应相比吗啡较少，临床应用安全有效[26-27]。然而，目前仍缺乏关于氢吗啡酮是否适合用于无痛肠镜检查麻醉的报道。应激反应是评价麻醉效果的重要指标，有研究表明，进行无痛肠镜检查时，患者处于应激状态下，肾上腺素，去甲肾上腺素水平不断上升[17, 28]。本文实验结果证明，给予氢吗啡酮复合丙泊酚，可以很大程度缓解结直肠扩张模型内脏痛，且缓解程度与芬太尼复合丙泊酚的镇静镇痛效果类似。
目前研究认为，丝裂原活化蛋白激酶家族（mitogen-activated protein kinase，MAPKs）主要包括细胞外信号调节激酶1/2（extracellular signal-regulated kinase，ERK1/2）、氨基末端激酶（jun n-lerminal kinase，JNK）、p38 MAPK 和ERK5[29-30]。MAPKs 家族成员之间对信号途径的接受和转导方面，有其共性，也存在特异性之处。其中，p38MAPK主要接收上游MAPK 激酶（MAPK kinase，MKK）MKK3，MKK6的激发或抑制[31]。p38MAPK为双磷酸化三肽模体“T-G-Y“结构，参与调控细胞炎症，应激，凋亡[32-33]。p38参与疼痛的调控，包括外周和中枢敏化。据报道，p38MAPK信号通路参与术后疼痛的发生和维持，当疼痛发生时，p38信号通路被激活，p38MAPK磷酸化增加，大鼠痛阈降低，疼痛敏感[34]。当给予氢吗啡酮复合丙泊酚，结直肠扩张模型大鼠脊髓中的p38MAPK磷酸化明显下降，证明氢吗啡酮复合丙泊酚能有效抑制p38MAPK 的磷酸化，从而缓解疼痛，且缓解机制可能与芬太尼复合丙泊酚的镇痛机制类似。
目前认为，p38主要通过多种疼痛介质参与中枢敏化的调控，如脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）、肿瘤坏死因-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素1β（interleukin1β，IL-1β）和环氧化酶2（Cyclooxygenase-2，COX-2）等[30]。有研究表明，IL-1可通过激活神经元和小胶质细胞中的MAPK信号通路导致中枢敏化[35]。因此，氢吗啡酮复合丙泊酚如何影响p38MAPK上游疼痛介质的表达还有待进一步验证。
总之，本文首次对氢酮吗啡用于扩张内脏痛的镇静镇痛效果进行了评估，并对其机制进行了初步探讨。本文证明，氢吗啡酮复合丙泊酚能可有效抑制p38MAPK 的磷酸化，因此可以在扩张性结直肠模型中很大程度缓解结内脏痛，且其对扩张内脏痛的缓解程度及其机制与氢酮吗啡复合丙泊酚类似，表明氢酮吗啡或可代替芬太尼用于临床无痛肠镜的镇静镇痛，对无痛肠镜检查的麻醉药物选择具有一定的临床指导意义。
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《昆明医科大学学报》编辑部
2021年1月17日
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图 1 大鼠腹壁撤回反射（AWR3）评分
数据表达以平均数±标准差（$\bar {x}\pm s$）表示；与丙泊酚组比较，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。
Figure 1. Abdominal withdrawal reflex （AWR3） score
图 2 肾上腺素，去甲肾上腺素浓度检测
A：肾上腺素；B：去甲肾上腺素。*P < 0.05，**P < 0.01，****P < 0.000 1。
Figure 2. Determination of epinephrine and norepinephrine.
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