Transplantation of Nurr1 Gene-modified Embryo Midbrain Neural Stem Cells for Treatment in Parkinson’ s Disease
-
摘要:
目的 探讨移植Nurr1基因修饰胚胎中脑神经干细胞对帕金森大鼠的治疗效果。 方法 （1） 建立SD大鼠帕金森病模型；（2）原代培养SD大鼠胚胎中脑神经干细胞，并于神经干细胞过表达Nurr1；（3）移植治疗分组：假手术组（A组），移植神经干细胞组（B组），移植Nurr1修饰神经干细胞组（C组）；（4）在移植后3周、6周、9周和12周分别对各组大鼠进行行为学测试，观察各组症状改善情况；（5）移植12周后，分别检测各组中Nurr1、TH蛋白表达情况和Nurr1荧光情况。 结果 （1）原代培养大鼠胚胎中脑神经干细胞，并于神经干细胞成功过表达Nurr1基因。（2）免疫荧光、Western Blot证实过表达Nurr1可以促进神经干细胞向多巴胺能神经元转化（P < 0.05）。（3）移植Nurr1修饰神经干细胞可以有效的改善帕金森大鼠的症状（P < 0.05），Western Blot证实小胶质细胞可显著促进移植后的神经干细胞在分化为多巴胺能神经元（P < 0.05）。（4）移植后Nurr1能促进神经干细胞向多巴胺能神经元转化，提高移植神经干细胞的存活，达到更好治疗效果。 结论 Nurr1基因可以促进神经干细胞向多巴胺能神经元转化；移植修饰Nurr1神经干细胞可以有效治疗帕金森大鼠。 Abstract:Objective To investigate the therapeutic effect of transplanted Nurr1 gene-modified embryo midbrain neural stem cells in Parkinson’ s rats. Methods 1. Establishment of Parkinson’ s disease animal model in SD rats. 2. Primary culture of embryo midbrain neural stem cells （NCSs） and Nurr1 gene-modified neural stem cells. 3. Grouping: sham operation group （sham group）, Transplanted neural stem cell group （NCS group）, transplanted Nurr1 gene-modified neural stem cells group （NNCS group）. 4. At 3 weeks, 6 weeks, 9 weeks, and 12 weeks after the transplantation, the behavioral tests of rats in each group were performed to observe the improvement of symptoms in each group. 5. After 12 weeks of transplantation, the expression of Nurr1, TH protein and Nurr1 fluorescence were detected in each group. Results 1. Primary cultured neural stem cells, and successfully overexpressed Nurr1 in neural stem cells. 2. Overexpression of Nurr1 could promote the transformation of neural stem cells into dopaminergic neurons （P < 0.05）, which was confirmed by immunofluorescence and Western Blot. 3. Transplantation of NNCS can effectively improve the symptoms of rats with Parkinson’ s （P < 0.05）. 4. After transplantation, Nurr1 can promote the transformation of neural stem cells into dopaminergic neurons, greatly improve the survival of transplanted neural stem cells and achieve better therapeutic effect. Conclusion Nurr1 can promote the transformation of neural stem cells into dopaminergic neurons. Transplantation of overexpression of Nurr1 neural stem cells can effectively treat Parkinson’ s rats. -
Key words:
- Nurr1 /
- Embryonic stem cells /
- Parkinson disease
-
新生儿重症肺炎在床旁超声的监测下发现常合并肺实变[1-2]。新生儿肺实变使患儿处于持续低氧状态、进而影响呼吸循环系统的稳定性，是导致新生儿死亡的重要原因[3-5]。在新生儿重症肺炎的治疗中，氧疗、机械通气，恰当的抗生素的使用等治疗固然占据主导地位，但合适的护理措施也对重症肺炎的恢复起到至关重要的作用[6-8]。在常规的重症肺炎护理中，所有患儿无论肺部病变程度、性质如何，均给以固定时间间隔的翻身、拍背、吸痰等措施，以促进气道分泌物排出[9-10]。但由于新生儿气道清洁能力不足，自主活动能力差，常规护理往往收效甚微[11-12]。因此，为了提高新生儿重症肺炎并肺实变的疗效，需要制定针对不同肺部病变性质的精准护理措施[13]。随着肺脏超声在新生儿领域的广泛应用，该技术为新生儿重症肺炎并肺实变的精准护理提供了一种有效的方法，对缩短病程和提高疗效有重要价值。
1. 资料与方法
1.1 一般资料
选取2021年1月至12月昆明市儿童医院新生儿重症监护室（NICU）收治的60例重症肺炎新生儿为研究对象，该研究获得了昆明市儿童医院伦理委员会的批准（2022-03-130-K01）。纳入标准：新生儿重症肺炎的诊断标准符合第5版《实用新生儿学》中的诊断标准；患儿除咳嗽、鼻塞等呼吸道症状外，合并明显呼吸困难或循环不稳定者定义为重症肺炎[14]。排除标准：（1）伴有先天性疾病；（2）确诊脓毒血症；（3）放弃治疗。采用随机数字法随机分为研究组和对照组2组，每组各30例。研究组男 13 例，女 17例；年龄中位数1.5（8.0，18.5 ） d；体重中位数3.2（2.6，3.8 ）kg；胎龄中位数38.5（36.8，40.3）周；剖宫产14例，阴道分娩16例；均有咳嗽咳痰等呼吸道症状，其中机械通气者12例（40%），普通吸氧者18例（60%）。 对照组患儿男 12例，女18例；年龄中位数11（ 8.0，21.3） d；体重中位数3.0（ 2.5，3.7） kg；胎龄中位数39（37，40）周；剖宫产 10例，阴道分娩 20例；均有咳嗽咳痰等呼吸道症状，其中机械通气者10例（30%），普通吸氧者20例（70%）。2组一般资料差异无统计学意义（P > 0.05），见 表1。
表 1 一般资料比较[M（P25，P75）/n（%）]Table 1. Comparison of general information [M（P25，P75）/n（%）]组别 胎龄（周） 日龄（d） 体重（kg） 咳嗽 腹胀 心衰 休克 中毒性脑病 机械通气 研究组 38.5（36.8，40.3） 11.5
（8.0，18.5 ）3.2
（2.6，3.8 ）30
（100）6（20） 10（30） 13（43） 2（7） 18（60） 对照组 39
（37，40）11
（ 8.0，21.3）3.0
（ 2.5，3.7）30
（100）8（27） 12（40 11（37） 1（3） 20（66） Z/χ2 −0.630 −0.220 −0.430 0.570 0.640 0.490 0.680 P 0.530 0.824 0.667 0.678 0.584 0.801 0.433 1.2 研究方法
2组患儿均采取普通吸氧或机械通气、抗感染、雾化、维持循环系统稳定等常规治疗。对照组给予常规护理干预：（1）基础护理: 保持病房清洁、常规口、脐、臀、皮肤护理，发热者及时降温处理，施与袋鼠式护理；（2）呼吸道护理：定时翻身、拍背、根据痰多少给予相应频次的吸痰。
研究组在对照组常规护理的基础上，每天使用床旁超声检查肺脏2～4次，根据超声发现采取不同护理干预措施，具体如下：（1）超声提示肺实变征象，见图1：实变面积较大时予纤维支气管镜下或气管插管下肺泡灌洗术；实变局限于胸膜线下，呈虫蚀样改变时以叩背、机械振动、手法震颤以及吸痰为主，根据严重程度选择一种或多种方式进行排痰，扣背、机械振动、手法震颤等措施位置主要为实变区域，并将患儿体位管理为实变对侧卧位为主。（2）超声提示肺间质综合征征象，见图2：予固定时间翻身，不常规行拍背吸痰。
1.3 观察指标
（1）接受机械通气的患儿撤离呼吸机的时间；（2）接受普通给氧的患儿停氧的时间；（3）咳嗽咳痰、肺部啰音、少吃少动症状体征消失的时间；（4）住院时间。
1.4 统计学处理
应用SPSS 22.0统计软件，计量资料中，对于符合正态分布的数据采用（ $\bar x \pm s $）表示，2组间用独立样本t 检验进行比较；对于不符合正态分布的数据采用中位数和四分位间距即M（P25，P75）表示，2组间采用非参数秩和检验（Wilcoxon’s signed rank）比较。计数资料以n（%）表示，行χ2检验，P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 2组超声图像比较
超声下，对照组与研究组均显示肺炎征象，包括胸膜线下虫蚀样改变、实变位置深、至少累及2个肋间，胸腔积液、肺不张和支气管充液征，且以累及2个以上肋间以上的深度实变为主，多合并胸腔积液和肺不张，提示重症肺炎的患儿肺脏感染重，渗出液多，存在因炎性分泌物导致的中小气道堵塞。2组超声图像特征均差异无统计学意义（P > 0.05），见 表2。
表 2 2组超声图像比较[n（%）]Table 2. Comparison of two groups of ultrasound images [n（%）]组别 实变范围 胸腔积液 肺不张 支气管
充液征虫蚀样 深，累及2个及
以上肋间对照组 8（27） 22（73） 19（63） 5（17） 30（100） 研究组 6（20） 24（80） 22（73） 4（13） 30（100） χ2 0.740 0.834 0.830 0.670 P 0.564 0.681 0.632 0.547 2.2 2组临床症状缓解时间及住院时间比较
研究组咳嗽咳痰、肺部啰音、少吃少动症状消失的时间中位数分别为8（6.5，10.0）d及（4.5，10.0）d，住院时间中位数10（8.0，11.0）d；对照组咳嗽咳痰、肺部啰音、少吃少动症状消失的时间中位数分别为11（10.0，12.3）d及15（7.0，18.0）d，住院时间中位数14（12.0，15.3）d。研究组患儿咳嗽咳痰、肺部啰音消、少吃少动消失时间及住院时间均较对照组缩短（P < 0.05），见 表3。
表 3 2组临床征象缓解时间及住院时间比较[M（P25，P75），d]Table 3. Comparison of clinical remission time and hospitalization time between two groups [M（P25，P75），d]组别 临床症状消失 住院时间 咳嗽咳痰 肺部啰音 少吃少动 腹胀 心衰 休克 研究组 8
（6.5，10.0）4
（3.5，11.07
（4.5，10）3（1，5） 2（1，4） 3（1.5，5） 10（8.0，11.0） 对照组 11
（10.0，12.3）10
（9，13）15
（7，18）7（13，9） 5（2，7） 4（2，6） 14（12.0，15.3） Z −4.642 11.031 8.983 9.043 10.031 9.532 −5.642 P < 0.001* < 0.001* < 0.001* < 0.001* < 0.001* < 0.001* < 0.001* *P < 0.05。 2.3 2组撤离呼吸机或停氧时间比较
研究组撤离呼吸机时间中位数为5（4.0，6.3）d，停氧时间中位数7（5.1，9.5）d；对照组撤离呼吸机时间中位数为8（6.0，9.3）d，停氧时间中位数10（8.0，12）d。研究组患儿撤离呼吸机或停氧时间均较对照组短（P < 0.05） ，见 表4。
表 4 2组撤离呼吸机或停氧时间比较[M（P25，P75），d]Table 4. Comparison of extubation time or deaeration time between two groups [M（P25，P75），d]组别 撤离呼吸机 停氧 研究组 5（4.0，6.3） 7（5.1，9.5） 对照组 8（6.0，9.3） 10（8.0，12） Z −4.812 −4.674 P < 0.001* < 0.001* *P < 0.05。 3. 讨论
3.1 新生儿肺实变的特点
新生儿肺实变好发部位与成人和儿童有很大差别 很少有报道新生儿肺实变的好发部位，成人和儿童重症肺炎时发生肺实变常见部位为肺下段，但新生儿发生肺实变的常见部位为脊柱两侧以及肩甲骨区域部位[15]。分析发现与体位有关，成人和儿童当患重症肺炎时，卧床期间，肺下段处于低位，而新生儿卧床期间，一般下肢处于卷曲状态，导致身体处于低位的部位为后备及胸廓段，由于重力的原因，痰液集聚在处于低位的肺段处，故存在新生儿肺实变的区域与成人和儿童不同。
3.2 超声引导精准护理治疗肺实变的价值
新生儿肺实变隐匿且治疗困难 新生儿实变区域多数在脊柱两侧及肩胛骨区域，床旁X-线片很难发现脊柱两侧细小的实变区，但在B超下能明显显示实变[16]。且该区域被骨组织覆盖，在治疗时考虑到施力后导致骨折的原因，导致在进行扣背、手法震颤等护理措施时力度不敢过大，加之震颤的穿透力在透过骨组织时会被大大的削弱，导致治疗效果相对差[17-19]。故发生在新生儿脊柱两侧及肩甲骨区域的肺实变精准护理的时间相对长方能有效。
3.3 体位管理在新生儿肺实变精准护理中的价值
体位引流与儿童及成人差异较大 儿童和成年人建立翻身卡能明确左、右侧卧位以及俯卧位，这类人群能自主维持相应的体位；但新生儿除了俯卧有明确的更换体位外，达到完全的侧卧极为困难，新生儿不能自主维持任何体位，当新生儿处于俯卧位时，如果体位摆放不规范，可能会有“婴儿猝死综合征”的危险[20]。当新生儿摆放侧卧位时，因为新生儿本身处于卷曲状态，侧卧位不能完全实现，导致体位引流效果不如成人及儿童，所以在施以新生儿体位管理时，需要有相应的辅助支撑的用具方能提高体位管理的效果。
床旁肺脏超声在新生儿肺实变临床诊断上有非常大的敏感性[21]。精准化护理措施在超声动态监视下能动态监测肺实变的治疗效果，但在精准化护理措施实施过程中，医护协助极为重要，且治疗过程中力度的掌握、病情的监护极为重要。
-
图 1 神经干细胞的培养及鉴定
A：神经干细胞原代培养7 d；B、C：巢蛋白（Nestin）鉴定阳性。
Figure 1. Culture and identification of neural stem cells
图 2 过表达Nurr1和对神经干细胞分化的影响
A：转染72 h后荧光显微镜检测Nurr1呈绿色；B、C：转染7 d后RT-PCR检测Nurr1的mRNA表达；D：分化培养7 d后检测TH荧光呈红色；E、F、G：分化7 d后Western检测Nurr1和TH表达。 与对照组比较，*** P < 0.001。
Figure 2. Overexpression of Nurr1 and its effect on differentiation of neural stem cells
图 3 细胞移植后分析阿扑吗啡诱导的旋转评分
各组分别在移植后3、6、9、12周，利用阿扑吗啡诱导检测转圈行为 与C组比较，*P < 0.05， **P < 0.001。
Figure 3. Apomorphine-induced rotation scores after cell transplantation.
-
[1] Balestrino R,Schapira A H V. Parkinson disease[J]. Eur J Neurol,2020,27(1):27-42. [2] 陈彪. 左旋多巴在帕金森病治疗中的地位及进展[J]. 中国临床神经科学,2017,25(5):546-550. doi: 10.3969/j.issn.1008-0678.2017.05.012 [3] Zhu B,Caldwell M,Song B. Development of stem cell-based therapies for Parkinson’ s disease[J]. Int J Neurosci,2016,126(11):955-962. [4] Zhang Q,Chen W,Tan S,et al. Stem cells for modeling and therapy of parkinson’ s disease[J]. Hum Gene Ther,2017,28(1):85-98. doi: 10.1089/hum.2016.116 [5] 刘罡,吴毅,贾杰,等. 神经干细胞体外分化抗原表达的研究[J]. 中国运动医学杂志,2009,28(1):55-59. [6] Li K, Li J, Zheng J, Qin S. Reactive astrocytes in neurodegenerative diseases[J]. Aging Dis. 2019; 10(3): 664-675. [7] Barker R A,Drouin Ooellet J,Parmar M. Cell-based therapies for Parkinson disease-past insights and future potential[J]. Nat Rev Neurol,2015,11(9):492-503. doi: 10.1038/nrneurol.2015.123 [8] 徐蛟天,陈孝祥,王威,等. Nurr1对小胶质细胞联合神经干细胞共培养促进神经干细胞向多巴胺神经元分化作用研究[J]. 国际神经病学神经外科学杂志,2018,45(01):52-57. [9] Liu W,Gao Y,Chang N. Nurr1 overexpression exerts neuroprotective and anti-inflammatory roles via down-regulating CCL2 expression in both in vivo and in vitro Parkinson’ s disease models[J]. Biochem Biophys Res Commun,2017,482(4):1312-1319. doi: 10.1016/j.bbrc.2016.12.034 [10] Kadkhodaei B,Ito T,Joodmardi E,et al. Nurr1 is required for maintenance of maturing and adult midbrain dopamine neurons[J]. J Neurosci,2009,29(50):15923-15932. doi: 10.1523/JNEUROSCI.3910-09.2009 [11] Radad K,Moldzio R,AL-Shraim M,et al. Recent advances on the role of neurogenesis in the adult brain:Therapeutic potential in parkinson’ s and Alzheimer’ s diseases[J]. CNS Neurol Disord Drug Targets,2017,16(7):740-748. [12] O’ sullivan S S,Johnson M,Williams D R,et al. The effect of drug treatment on neurogenesis in parkinson's disease[J]. Mov Disord,2011,26(1):45-50. doi: 10.1002/mds.23340 [13] Madhavan L,Daley B F,Paumier K L,et al. Transplantation of subventricular zone neural precursors induces an endogenous precursor cell response in a rat model of Parkinson’ s disease[J]. J Comp Neurol,2009,515(1):102-115. doi: 10.1002/cne.22033 [14] Dong J,Liu X,Wang Y,et al. Nurr1(Cd11bcre) conditional knockout mice display inflammatory injury to nigrostriatal dopaminergic neurons[J]. Glia,2020,68(10):2057-2069. doi: 10.1002/glia.23826 [15] Wang X,Zhuang W,Fu W,et al. The lentiviral-mediated Nurr1 genetic engineering mesenchymal stem cells protect dopaminergic neurons in a rat model of Parkinson’ s disease[J]. Am J Transl Res,2018,10(6):1583-1599. [16] Smith G A,Rocha E M,Rooney T,et al. A Nurr1 agonist causes neuroprotection in a Parkinson’ s disease lesion model primed with the toll-like receptor 3 dsRNA inflammatory stimulant poly (I:C)[J]. PLoS One,2015,10(3):e0121072. doi: 10.1371/journal.pone.0121072 [17] Ahmed A,Isaksen T J,Yamashita T. Protocol for mouse adult neural stem cell isolation and culture[J]. STAR Protoc,2021,2(2):100522. doi: 10.1016/j.xpro.2021.100522 [18] Raina A,Mahajani S,Bahr M,et al. Neuronal trans-differentiation by traNCSription factors ascl1 and Nurr1:Induction of a dopaminergic neurotransmitter phenotype in cortical GABAergic neurons[J]. Mol Neurobiol,2020,57(1):249-260. doi: 10.1007/s12035-019-01701-x 期刊类型引用(2)
1. 张震海，曾慧斌，王健，许丽萍，张浩. 出生后1周肺部超声评分在32周内早产儿支气管肺发育不良预测中的作用价值. 中国卫生标准管理. 2024(13): 27-30 . 
百度学术2. 张小萍. 强化家长监督下的行为转变护理对肺炎住院儿童遵医行为及预后的影响. 中国医药指南. 2024(22): 115-117 . 百度学术其他类型引用(0)
-
下载:
下载:
点击查看大图
计量
- 文章访问数: 4349
- HTML全文浏览量: 2277
- PDF下载量: 42
- 被引次数: 2
