冠心病是严重威胁人类健康的重要疾病之一，其发病机制与冠状动脉粥样硬化性狭窄密切相关^[1]。尽管过去10 a中冠心病总体死亡率下降约1/4，但仍构成全球死亡主要因素，在美国约2 010万人患有冠心病^[2]，而中国约3.3亿人患有心血管疾病，其中冠心病约1 139万人^[3]。此外，冠状动脉疾病导致心肌缺血缺氧，引起心肌细胞结构和功能发生改变，同时对心肌微循环系统产生严重影响。心肌微循环系统的完整性和功能状态对于维系心肌细胞代谢和收缩至关重要^[4]。心肌微循环系统的主要结构是心肌毛细血管网，而心肌微血管内皮细胞（cardiac microvascular endothelial cell，CMECs）是构成微血管的关键细胞类型，线粒体则作为主要能量来源，其质量在内皮细胞中占2%～6%，在心肌细胞中约占32%^[5]。一方面，CMECs参与调控血流动力学和微血管的通透性，另一方面，自身可分泌多种活性因子，以及通过释放或摄入外泌体^[6]，传递多种类型的RNAs，进而调节心肌细胞的功能。因此，CMECs在冠心病，尤其是心肌缺血性损伤中扮演着非常重要的角色。

多项研究表明^[7−9]，缺血缺氧可导致CMECs发生一系列病理生理变化，如形态学改变、细胞凋亡增加、炎症因子NLRP3激活、血管生成因子VEGF表达改变等。这些变化不仅会破坏CMECs的正常结构和功能，也会直接影响心肌细胞，从而进一步加重缺血缺氧损伤。然而，目前针对CMECs在心肌缺血病理生理过程中的具体作用机制仍有待进一步深入的研究。本研究拟通过构建大鼠缺血性心肌损伤模型和体外短时间及长时间CMECs缺氧模型，以在体和体外2个层面系统性分析在缺氧条件下，冠脉微循环的主要构成部分在结构和生物学特性方面的变化，包括CMECs的生长、存活、炎症及血管生成相关因子的变化，并进一步探讨这些变化对冠脉微循环的影响。

1.   材料与方法

1.1   实验动物

SPF级雄性SD大鼠，6～8周龄，体重150～200 g，普通光照、基础饲料喂养，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号：SCXK（湘）2019-0004。

1.2   主要试剂

戊巴比妥钠购自Sigma。大鼠心脏微血管内皮细胞完全培养基购自Procell。DMEM培养基购自Gibco。胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素、链霉素购自VivaCell。CCK8试剂盒购自Biomiky。ELISA试剂盒VEGF、IL-6购自NeoBioscience；IL-1β、TNF-α购自Proteintech；Ang-2购自abmart。培养皿、细胞培养板等耗材购自Nest。

1.3   实验方法

1.3.1   大鼠心肌缺血模型的建立

购买的大鼠预适应喂养1周，标准饮食和水。使用2%戊巴比妥钠将大鼠腹腔麻醉，确保其进入无痛觉状态。仰卧位，头后仰固定，四肢伸展固定，行气管切开，接小动物呼吸机，吸呼比1∶1.5，胸部碘伏消毒，在胸骨左侧3～4肋间，顺肋间隙斜行切口，切开胸壁皮肤，钝性分离肌肉层，纵行剪开胸骨，暴露心脏，小心分离并固定心包。在左心耳下缘3～4 mm处，定位冠脉左前降支，用7-0带线缝合针部分结扎，结扎线远端组织变白则判断为急性心肌缺血模型成功。逐层闭合胸腔，挤压胸廓，将胸腔内空气挤出，切口附近涂擦青霉素钠预防感染。待大鼠恢复自主呼吸，拔除气管插管，放置保温垫内待完全清醒，连续3 d肌注青霉素钠20万U/d预防感染。

1.3.2   组织病理学（HE染色）

于术后72 h，取大鼠心脏，剔除心包、结缔组织、脂肪等，取结扎线以下心肌组织，预冷含双抗PBS冲洗3次去除血迹，迅速置于4%多聚甲醛中固定组织，依次70%、80%、95%、100%乙醇梯度组织脱水，将脱水好的组织依次浸泡梯度二甲苯进行透明，石蜡包埋，5 μm厚度切片，中性树胶封片后置于光学显微镜下观察心肌组织病理学改变。

1.3.3   组织病理学（Masson染色）

取大鼠心肌组织，同上处理，置于4%多聚甲醛中固定24 h，依次70%、80%、95%、100%乙醇梯度组织脱水，石蜡包埋，5 μm厚度切片，置于预涂玻片上，二甲苯梯度浸泡透明、脱蜡，梯度乙醇复水，在Masson染液中浸泡，脱色并洗涤，中性树胶封片后置于光学显微镜下观察心肌组织病理学结构。

1.3.4   透射电镜观察超微结构

取大鼠新鲜心肌组织，置于预冷的电镜固定液中切成1 mm³的立方体，0.1 M磷酸缓冲溶液PB（pH=7.4）漂洗，随后置于1%锇酸避光室温固定，依次30%、50%、70%、80%、95%、100%乙醇梯度组织脱水，渗透后置入包埋板，树脂聚合48 h，60～80 nm超薄切片，2%醋酸铀+2.6%枸橼酸铅溶液双染色，随后，置于HT7800透射电镜下观察心肌细胞超微结构。

1.3.5   大鼠CMECs的分离与培养

取SD大鼠断颈处死，75%酒精浸泡5 min，转移至超净工作台，仰卧位固定大鼠，沿胸骨正中剪开皮肤，打开胸腔，去除心包组织，剪下左心室，将左心室剪成1 mm³碎块，放入含双抗的PBS中，清洗后放入离心管，加入胰酶消化液，37 ℃恒温振荡水浴，消化1 h，加入FBS终止胰酶反应，经100目细胞筛过滤，经1000 r/min离心5 min，去除上清，保留细胞沉淀。用大鼠心肌微血管内皮细胞完全培养基重悬细胞，接种于多聚赖氨酸预包被的培养皿中，37 ℃，5%CO₂恒温培养箱中静置培养，24 h更换培养基，每3 d换液至细胞长满。

1.3.6   CMECs缺氧模型的建立

将培养好的CMECs置于缺氧条件下，模拟缺氧环境。将细胞培养器皿放置在预先充填5% CO₂和95% N₂混合气体的缺氧箱中。根据实验设计，将CMECs置于缺氧条件下的特定时间。分组如下：对照组：将CMECs保持在正常氧气条件下处理，缺氧组：将CMECs置于缺氧条件下处理0 h、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h、72 h。将24 h以内定义为短期缺氧，24 h以上定义为长期缺氧。

1.3.7   CCK-8法测定CMECs的增殖状态

将待检测的CMECs铺96孔板，2×10³每孔，待细胞贴壁后，每孔100 μL培养基中加入10 μL的CCK-8，37 ℃ 5%CO₂培养箱中孵育，450 nm处读取OD值，分别读取0 h、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h、72 h细胞增殖情况。

1.3.8   CMECs存活率的测定

将对照组和缺氧组分别置于培养皿上，加入消化酶，使细胞均匀分布。采用台盼蓝染色细胞计数法，使用相差显微镜观察细胞的形态。根据培养的细胞类型，选择放大倍数。进行定性和定量评估细胞的存活率。定性评估可以判断细胞是否存在形态异常和脱落，以及细胞聚集情况。定量评估使用计数方法来统计形态正常的细胞数目，以及形态异常的细胞数目，计算存活率。

1.3.9   ELISA法测定CMECs炎症因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）的水平

将待检测的CMECs铺6孔板，收集培养上清液，根据ELISA试剂盒使用说明书，测定炎症因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）的水平。使用酶标仪测量450 nm时的OD值，通过绘制OD值与标准浓度的关系来制定标准曲线，随后确定样品的浓度。

1.3.10   ELISA法测定CMECs血管生成因子（VEGF、Ang-2）的水平

上清液的收集方法同上，根据ELISA试剂盒使用说明书，测定血管生成因子（VEGF、Ang-2）的水平。样品浓度的测定方法同上。

1.4   统计学处理

数据均采用Graph-Pad Prism 9.0和SPSS 19.0软件进行统计分析和图像制作，并以均数±标准差（SD）表示。通过Student t 检验分析2组之间的差异，自身对照采用配对样本t检验，使用方差分析进行随机区组设计的比较；以P < 0.05表示差异有统计学意义。

2.   结果

2.1   冠脉结扎诱导后引起缺血心肌组织的HE染色改变

HE染色结果显示：术后72 h，对照组心肌组织横纹清晰且排列整齐，心肌细胞完整且排列规则。模型组可见心肌组织横纹轻度排列紊乱，但可见细胞肿胀，心肌间质可见较多炎性细胞浸润，未见显著的心肌细胞坏死、溶解及瘢痕增生，见图1。

图  1  心肌组织HE染色

A：对照组（200×）；B：对照组（400×）；C：模型组（200×）；D：模型组（400×）。　　　　　　　　　　

Figure  1.  HE staining of myocardial tissue

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2.2   心肌组织短期缺血下的Masson染色改变

Masson染色结果显示：术后72 h，对照组未见明显病理性改变，模型组可见轻度间质增生，未见显著的纤维化性改变，见图2。

图  2  心肌组织Masson染色

A：对照组（200×）；B：对照组（400×）；C：模型组（200×）；D：模型组（400×）。　　　　　　　　　

Figure  2.  Masson staining of myocardial tissue

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2.3   心肌组织短期缺血下的超微结构改变

透射电镜结果显示：术后72 h，与对照组相比，模型组心肌细胞超微结构尚完整，表现为线粒体肿胀和形态不规则改变，肌质网破坏并数量减少，肌间微小血管上皮细胞肿胀，管腔内可见大量有形物质，但血管壁结构尚完整，见图3。

图  3  透射电镜观察心肌组织超微结构

A：对照组；B：模型组。

Figure  3.  The ultrastructure of myocardial tissue under transmitting electron microscope

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2.4   CMECs的形态特征及生长特点

原代CMECs经分离后呈圆形、椭圆形、短梭型，细胞质透明状。在4～6 h后呈贴壁式生长，边缘光滑，24 h后呈簇状生长，显示出细胞间连接，48 h后偶有呈多边形扁平状、长梭形等，72 h后扁平状细胞开始增多，或称“铺路石”样。P1～ 3代细胞生长较为缓慢，但贴壁状况良好，短时间（20 min）内贴壁约50%，见图4。

图  4  CMECs显微镜普通视野下形态特征（100×）

A：对照组0 h；B：模型组0 h；C：对照组24 h；D：模型组24；E:对照组48 h；F:模型组48 h；G:对照组72 h；H:模型组72 h。

Figure  4.  The morphological characteristics of CMECS under general microscope（100×）

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2.5   CMECs的增殖状态

增殖率结果显示：随时间延长，在12 h内2组OD值无显著变化，在24 h时升高较为显著，但组间差异并无统计学意义（P > 0.05）。与对照组比较，缺氧组在48 h和72 h时增殖速率下降，P分别=0.0426和0.003，见图5。

图  5  CCK8法检测CMECs增殖状态

注：黑线代表对照组，红线代表缺氧组；^*P < 0.05，^**P < 0.01。

Figure  5.  Proliferation of CMECs detected by CCK8

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2.6   CMECs的存活率

结果显示：0～24 h内，对照组和缺氧组的细胞形态无明显变化；48 h呈簇状生长，缺氧组部分细胞体积开始缩小，细胞排列疏松，间隙增大；与对照组相比，缺氧组在72 h后细胞间连接断裂，大量细胞圆形化，大量游离细胞出现，出现较多空白区域。对照组中，健康CMECs所占比例均大于90%。缺氧组12 h内细胞存活率约90%，24 h后开始下降，72 h后细胞存活率约为50%。

图  6  CMECs的存活率

Figure  6.  Survival rate of CMECs

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2.7   CMECs的炎症因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）表达情况

结果显示：随缺氧时间延长，炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表达逐渐增高，其中IL-1β、IL-6在缺氧4 h后即开始表达，差异具有统计学意义（P < 0.05）。而TNF-α则在缺氧12 h后开始表达，差异具有统计学意义（P < 0.05），此外，长期缺氧较短期缺氧增加更为显著，见图7～图9。

图  7  ELISA法检测炎性因子IL-1β的浓度

与0 h组比较，^**P < 0.01。

Figure  7.  The concentration of inflammatory factor IL-1β detected by ELISA

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图  9  ELISA法检测炎性因子TNF-α的浓度

与0 h组比较，^**P < 0.01。

Figure  9.  The concentration of inflammatory factor TNF-α detected by ELISA

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图  8  ELISA法检测炎性因子IL-6的浓度

与0 h组比较，^**P < 0.01。

Figure  8.  The concentration of inflammatory factor IL-6 detected by ELISA

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2.8   CMECs的血管生成因子（VEGF、Ang-2）表达情况

结果显示：随缺氧时间延长，血管生成因子VEGF、Ang-2的表达逐渐增高，其中VEGF在缺氧8 h后表达具有显著差异（P < 0.05）；Ang-2在缺氧4 h～12 h期间表达下降（P < 0.05），在24 h后表达上升（P < 0.05）。此外，VEGF的表达在12 h至24 h期间表达降低（P < 0.05），在48 h后表达显著增加（P < 0.05），见图10～图11。

图  10  ELISA法检测血管生成因子VEGF的浓度

与0 h组比较，^**P < 0.01。

Figure  10.  The concentration of angiogenesis factor VEGF detected by ELISA

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图  11  ELISA法检测血管生成因子Ang-2的浓度

与0 h组比较，^*P < 0.05；^**P < 0.01。

Figure  11.  The concentration of angiogenesis factor Ang-2 detected by ELISA

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3.   讨论

冠状动脉血管系统构成组分包括心外膜动脉（>500 μm）、毛细血管前小动脉（200～500 μm）、小动脉（10～200 μm）和毛细血管（<10 μm），除心外膜动脉外，其他血管均参与冠脉微循环组成，其中微循环系统是维系心脏自身血液灌注的重要基础^[10]。本研究通过HE染色和Masson染色，证实了在限定时限的大鼠缺血性心肌损伤模型中，心肌细胞出现的病理学改变，包括心肌组织横纹轻度排列紊乱，细胞肿胀，心肌间质可见较多炎性细胞浸润及轻度增生等，这些改变都是典型的缺血缺氧损伤性表现。透射电镜进一步观察到，心肌细胞的细胞器如线粒体肿胀、肌质网破坏并数量减少，肌间微小血管上皮细胞肿胀，管腔内可见大量有形物质等超微结构发生的病理学改变。本研究结果与杨钤等^[11]报道的早期特征基本一致，受到实验方案、实验动物条件等客观因素的影响，可能引起结果上有所差异，本结果提示在72 h后开始显现。因此推测，缺血的持续时间决定了心肌损伤的程度，而梗塞的大小也由闭塞冠状动脉的数量和位置决定。特征性改变为本研究建立大鼠缺血性心肌损伤模型提供了可靠的依据，也为后续研究提供了基础。

CMEC是调节微血管的舒缩功能，预防血栓形成，维持血管通透性，调节炎症，调节各种刺激因素引起的血管生成的重要生理基础^[12]。对于CMECs自身脆弱的生存状态来讲，置于缺氧环境下48 h以上属于长时缺氧。此外，Mishra等^[13]提供了评估心肌细胞死亡的指南，系统性地描述了识别、测量和评估心肌细胞死亡模式的最佳方法，对本研究的研究方案提供了理论依据。不同类型细胞间通讯是通过多种旁分泌、自分泌和内分泌因子实现协调的心脏微环境，与心肌细胞相比，冠状动脉微血管中的内皮细胞更不容易受到缺血性损伤，并且内皮细胞中的冠状微血管损伤可滞后于心肌细胞损伤^[14]。本研究结果显示，体外培养的原代CMECs在不同程度的缺氧时间下表现出显著的病理生理学改变，主要包括：提示随着缺氧时间的延长，48 h后细胞形态学开始发现变化（细胞体积开始缩小，细胞排列疏松，间隙增大等），而在72 h后，细胞形态学变化进一步显著（细胞间连接断裂，大量细胞圆形化，大量游离细胞出现，出现较多空白区域）、增殖活性受到抑制、存活率下降、炎症因子（IL -1β、IL-6、TNF-α）和血管生成相关因子（VEGF、Ang-2）释放。这些改变呈现出明显的时间依赖性，CMECs的损伤程度逐渐加重。

此外，本研究结果还表明，在体实验和体外实验随缺氧时间变化，能够较好的反应对冠脉微循环的显著影响，细胞形态改变、细胞增殖率下降和存活率降低等现象，说明了缺氧环境对CMECs的基本结构和功能造成了严重破坏。然而，缺氧诱导方法的不同会引起细胞增殖效率及细胞活力的差异。Wang等^[15]使用CoCl₂诱导冠脉内皮细胞缺氧模型，至72 h时细胞活力下降至约为60%，而本研究结果中这一数据约为50%。此外，炎症因子释放表明CMECs发生了严重的炎症反应，这不仅会加重自身损伤，也可能激发全身性的炎症级联反应的病理生理基础。而血管生成因子的释放，则提示了CMECs试图通过诱导新生血管来缓解自身缺氧状态，但同时也可能导致病理性血管增生。

炎症反应是心肌缺血再灌注损伤的重要发病机制之一^[16]。本研究结果对于分子水平上揭示导致缺血性心肌损伤的关键细胞及分子机制具有积极的意义。缺血缺氧可直接损伤心肌细胞，同时也会破坏心肌微循环系统中的CMECs^[5，12]。受损的CMECs不仅自身功能受损，还会释放大量有害因子，进一步加重心肌缺血缺氧损伤，形成恶性循环。这些发现为今后制定心血管疾病的早期诊断标志物和靶向治疗策略提供了新的思路。如监测CMECs相关的炎症（如IL -1β、IL-6、TNF-α）^[17−18]和血管生成标志物（如VEGF、Ang-2）^[7，9]，以判断缺血缺氧损伤程度；或者通过相关通路进一步深入的探索，以明确减轻心肌损伤的相关机制。此外，CMECs自身也可作为一个潜在的研究热点，如传递遗传物质、分泌活性因子等，有助于阐明缺血缺氧状态下CMECs的病理生理学变化及其对冠脉微循环的影响，进而揭示导致缺血性心肌损伤的关键环节。总的来说，本研究仍有一些值得改进完善的地方，如增加实验组数和重复次数、细胞水平与体内物质的关联性、增加标志物的鉴定方法等，将会在后续研究中深入探索。

综上所述，该研究有助于从微观角度阐明冠心病的病理基础和分子机制，也为不同年龄人群的缺血性心肌损伤发病机制研究、早期诊断和靶向治疗提供新的思路和依据，具有广阔的研究前景。