The Preliminary Application of Whole Blood Interferon-Gamma Release Assay Combined with T Lymphocyte Subset Detection in Diagnosis of Pulmonary Tuberculosis
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摘要:
目的 探讨全血γ-干扰素释放试验（Interferon-gamma release assay，IGRA）联合T淋巴细胞亚群检测在肺结核诊断中的价值。 方法 纳入2015年9月至2016年2月在中国人民解放军联勤保障部队第九二〇医院感染科住院诊断为肺结核的全部患者58例，其中痰涂阳活动性肺结核或肺穿刺活检组织学确诊为肺结核患者41例，痰涂阴性而临床诊断为肺结核（且经临床抗结核治疗有效）的肺结核患者17例。同时选择中国人民解放军联勤保障部队第九二〇医院同期健康体检的自愿者48例作为对照组。所有受试者进行全血IGRA检测、T淋巴细胞亚群检测。 结果 IGRA检查诊断肺结核的灵敏度为86.2%（50 / 58），特异度为95.8%（46 /48），漏诊率为13.8%（8 / 58），误诊率为4.2%（2/ 48），ROC曲线下面积AUC = 0.816（P = 0.001）。治疗前肺结核组患者CD3（+）、CD4（+）及CD4（+）/CD8（+）较正常组明显下降，CD8（+）较正常组明显升高，并与正常组比较差异均具有统计学意义（P < 0.05）。IGRA检查联合T淋巴细胞亚群检测诊断肺结核的灵敏度为96.6%（56/ 58），特异度为91.7%（44/ 48），漏诊率为3.4%（2/ 58），误诊率为8.3%（4/48），IGRA实验联合T淋巴细胞亚群检测ROC曲线下面积AUC = 0.911（P < 0.001）。 结论 IGRA检查联合T淋巴细胞亚群检测诊断肺结核具有较高灵敏度和特异性，漏诊率较单一IGRA检测明显降低，具有较高诊断价值，值得临床推广。 Abstract:Objective To evaluate the clinical application value of whole blood interferon-gamma release assay （IGRA） combined with T lymphocyte subset detection in diagnosis of pulmonary tuberculosis （TB）. Methods A total of 58 consecutive patients diagnosed with pulmonary tuberculosis who were hospitalized in our hospital from September 2015 to February 2016 in our hospital were enrolled, including 41 patients with sputum-coated positive pulmonary tuberculosis or confirmed as the pulmonary tuberculosis by pulmonary fine needle aspiration biopsy, and 17 patients with sputum-coated negative and clinically diagnosed as the pulmonary tuberculosis by effective anti-tuberculosis treatment. 48 healthy volunteers were randomly selected in our hospital as the control group. All subjects underwent blood γ- interferon release assay, and T lymphocyte subsets test. Results The sensitivity of IGRA diagnosis of tuberculosis was 86.2% （50/58）, the specificity was 95.8% （46/48）, the underdiagnosis rate was 13.8% （8/58）, and the misdiagnosis rate was 4.2% （2/48）, and the area under the ROC curve （AUC） was 0.816 （P = 0.001）. CD3+, CD4+ and CD4+/CD8+ were significantly decreased and CD8+ was significantly increased in the TB group at the baseline, and the differences were statistically significant compared with the control group （P < 0.05）. The sensitivity of IGRA combined with T lymphocyte subsets detection for the diagnosis of tuberculosis was 96.6% （56/58）, the specificity was 91.7% （44/48）, the underdiagnosis rate was 3.4% （2/58） and the misdiagnosis rate was 8.3% （4/48）. The AUC of IGRA test combined with T lymphocyte subsets detection was 0.911 （P < 0.001）. Conclusion The IGRA combined with T lymphocyte subsets test has the high sensitivity and specificity in the diagnosis of the pulmonary tuberculosis, and the rate of missed diagnosis is significantly lower than that of single IGRA test, which has the high diagnostic value and is worthy of clinical promotion. -
结核病（tuberculosis，TB）是一种由结核分枝杆菌感染引起的严重危害人类健康和生命的传染病，是全球主要的公共卫生问题之一[1]。目前在结核病的防治中，最大的难题依然是结核病的诊断问题，尤其是涂阴肺结核和肺外结核的诊断[2]。
γ-干扰素释放试验（interferon-gamma release assay，IGRA）因其检测方便、诊断迅速、定量检测的特点，已作为诊断结核分枝杆菌感染的辅助手段[3]，被WHO和美国疾病预防控制中心推荐[4-5]。但这种方法存在难以区分活动性结核病和潜伏性结核分枝杆菌感染的不足[6]。已有研究显示在病原学证据不足时，IGRA联合肿瘤标志物CA-125可明显提高活动性肺结核的诊断准确率[7]。联合人类白细胞分化抗原G检测可提高IGRA诊断肺结核的特异性[8]。
研究表明，T淋巴细胞亚群参与肺结核的发生、发展[9]，肺结核患者的细胞免疫功能低下是宿主诱发感染的结核菌的原因之一。肺结核患者存在以CD4（+）T淋巴细胞亚群明显减少为特征的淋巴细胞免疫缺陷[10]，病变越广泛，下降越严重[11]。尚未见IGRA联合外周血T淋巴细胞亚群检测的报道。T淋巴细胞亚群检测为肺结核患者临床常规检测，检测方法较经济简便，笔者拟通过IGRA联合外周血T淋巴细胞亚群检测，探讨二者联合是否可提高肺结核的诊断效率。
1. 资料与方法
1.1 一般资料
选择2018年3月至2019年6月在中国人民解放军联勤保障部队第九二〇医院感染科住院诊断为肺结核的所有连续患者58例，男性39例，女性19例。纳入标准：（1）年龄≥18岁；（2）为初治痰涂阳或肺穿刺病理诊断的肺结核患者和初治痰涂阴临床诊断为肺结核患者[2]。其中痰涂阳性患者共41例，痰涂阴性患者共17例。排除标准：（1）乙肝、丙肝病毒或HIV阳性的患者；（2）复发性肺结核患者；（3）慢性阻塞性肺病、支气管扩张、支气管哮喘、肺部感染、冠心病、高血压、糖尿病、脑卒中等慢性疾病者；其他病毒性感染者；恶性肿瘤患者；肝肾功能异常者；妊娠期或哺乳期妇女；（4）3个月内使用全身糖皮质激素或其他免疫抑制剂治疗。根据美国结核及呼吸协会的肺结核分类标准[12]，将肺结核分为：轻度肺结核（10例）、中度肺结核（6例）和重度肺结核（15例）。同时选择作者单位中国人民解放军联勤保障部队第九二〇医院同期健康体检的自愿者48例作为对照组。该研究获得了中国人民解放军联勤保障部队第九二〇医院伦理委员会批准。所有患者参与研究前均签署了知情同意书。
1.2 实验材料
1.2.1 试剂
（1）全血γ-干扰素释放试验试剂（主要试剂均来自北京万泰生物药业股份有限公司）：TB-IGRA酶标板，TB-IGRA测试培养管（T），TB-IGRA本底对照培养管（N），TB-IGRA阳性对照培养管（P），TB-IGRA校准品（冻干粉），TB-IGRA酶标试剂，TB-IGRA样品稀释液，TB-IGRA校准品稀释液，浓缩洗涤液20X，显色剂A液，显色剂B液，终止液，自封袋，封板膜及生理盐水等；（2）T淋巴细胞亚群检测试剂均由美国BD公司生产，包括CD3-PE、CD4-FITC、CD8-APC、CD16-FITC等。
1.2.2 主要设备
303-O型台式培养箱，TDZ4-WS台式低速自动平衡离心机，DEM-3型自动洗板机，KHB ST-360酶标仪，EPICS XL流式细胞仪。
1.3 研究方法
1.3.1 全血γ-干扰素释放试验检测
受试者于入院第2天清晨空腹下抽取静脉血5 mL于肝素抗凝管真空中，按照说明书分别进行抗原刺激及ELISA法血浆IFN-γ浓度测定。检测结果根据说明书分为“阳性”、“阴性”和“不确定”。
1.3.2 T淋巴细胞亚群检测
受试者入院第2天空腹时采集静脉血4 mL 于乙二胺四乙酸抗凝管和枸橼酸钠促凝管中。采用流式细胞仪抗体双标法对抗凝管中的CD4（+）T、CD8（+）T淋巴细胞亚群表达率进行测定。
1.4 统计学处理
研究数据采用SPSS19.0统计软件进行数据分析，计量资料数据以均数±标准差（
$\bar x$ ±s）表示，2组计量资料的比较采用t检验。计数资料的比较采用卡方检验，理论频数小于1时使用Fisher确切概率法。采用受试者工作特征曲线分析（ROC曲线）评价不同诊断试验（指标）对肺结核的诊断价值和诊断效能。统计学检验水准取0.05。2. 结果
2.1 受试者基本情况
本研究共纳入肺结核患者58例，健康对照者48例，见表1。肺结核组与对照组性别分布、年龄情况差异无统计学意义（P > 0.05）。在痰涂阳性肺结核组和痰涂阴性肺结核组中，轻、中、重不同严重程度肺结核病例数总体差异无统计学意义（P > 0.05）。肺结核组与对照组比较，肺结核组IGRA试验阳性例数明显高于对照组，差异具有统计学意义（P < 0.05）。T细胞表达率经t检验，2组间差异具有统计学意义（P < 0.05）。
表 1 受试者基线资料 [$\bar x \pm s$ /n（%）]Table 1. Baseline characteristics of subjects [$\bar x \pm s$ /n（%）]类别 肺结核组（n = 58） 健康对照组（n = 48） t χ2 P 性别n（%） 男 39（67.2） 30（62.5） \ 0.260 0.610 女 19（32.8） 18（37.5） 年龄（$\bar x$ ± s）（岁） 38 ± 15.8 40 ± 10.1 最大年龄 70 68 0.564 \ 0.575 最小年龄 19 19 痰涂阳性肺结核n（%） 41（70.7） \ 轻度肺结核 15（36.6） 中度肺结核 8（19.5） 重度肺结核 18（43.9） \ 0.054 0.973 痰涂阴性肺结核n（%） 17（29.3） \ 轻度肺结核 6（.3） 中度肺结核 3（17.7） 重度肺结核 8（47） IGRA n（%） 阳性 50（86.2） 2（4.2） 70.73 < 0.001* 阴性 8（13.8） 46（95.8） T淋巴细胞表达率 CD3（+） 63.1 ± 7.6 70.5 ± 8 3.796 \ < 0.001* CD4（+） 29.6 ± 8.5 37.4 ± 5.3 4.142 \ < 0.001* CD8（+） 28.1 ± 5.1 24.4 ± 3.7 3.158 \ 0.002* CD4（+）/CD8（+） 1.3 ± 0.3 1.6 ± 0.4 3.966 \ < 0.001* *P < 0.05。 2.2 IGRA检查结果
2.2.1 不同组别IGRA检查结果比较
痰涂阳性肺结核组和痰涂阴性肺结核组分别与对照组比较，IGRA阳性例数均高于对照组（P < 0.05），见表2。
表 2 肺结核组和对照组IGRA结果 n（%）Table 2. Results of IGRA in TB group and control group n（%）分组 肺结核组 对照组 合计 χ21 P1 χ22 P2 痰涂阳性1 痰涂阴性2 IGRA（+） 33（80.5） 15（88.2） 2（4.2） 50 53.981 < 0.001* 45.939 < 0.001* IGRA（−） 8（19.5） 2（11.8） 46（95.8） 56 合计 41 17 48 106 注：。χ21 为痰涂阳性组与对照组比较，χ22 为痰涂阴性组与对照组比较；*表示P < 0.05。 2.2.2 IGRA检测肺结核的灵敏度和特异度
58例肺结核患者中，IGRA检查诊断肺结核的灵敏度为86.2%（50 / 58），漏诊率为13.8%（8 / 58）；48例健康对照者中，IGRA检查的特异度为95.8%（46 / 48），误诊率为4.2%（2 / 48），见表3。
表 3 IGRA检测肺结核的四格表（n）Table 3. The 2 × 2 table of IGRA detection of pulmonary tuberculosis （n）项目 肺结核 合计 + − IGRA + 50 2 52 − 8 46 54 合计 58 48 106 注：联合试验指IGRA联合T淋巴细胞亚群检测。 2.2.3 IGRA联合T淋巴细胞亚群检测肺结核的灵敏度和特异度
IGRA检查联合T淋巴细胞亚群检测诊断肺结核的灵敏度为96.6%（56/58），漏诊率为3.4%（2/58）；IGRA检查联合T淋巴细胞亚群检测的特异度为91.7%（44/48），误诊率为8.3%（4/48），见表4。
表 4 联合试验检测肺结核的四格表（n）Table 4. The 2 × 2 table of IGRA combined with T lymphocyte subset detection of pulmonary tuberculosis （n）项目 肺结核 合计 + − 联合试验 + 56 4 52 − 2 44 54 合计 58 48 106 注：联合试验指IGRA联合T淋巴细胞亚群检测。 IGRA 与联合试验灵敏度经卡方检验，差异具有统计学意义（Fisher确切概率法，P = 0.017），联合试验的灵敏度96.6%高于IGRA方法的86.2%。两种方法的特异度经卡方检验，差异亦具有统计学意义（Fisher确切概率法，P = 0.005），联合试验的特异度91.7%略低于IGRA试验的95.8%。
2.2.4 IGRA及IGRA联合T淋巴细胞亚群检测诊断涂阳和涂阴肺结核的ROC曲线
单独IGRA曲线下面积AUC = 0.816（P = 0.001），IGRA联合T淋巴细胞亚群检测曲线下面积AUC = 0.911（P = 0.000），见图1。IGRA实验联合T淋巴细胞亚群检测对涂阳或涂阴肺结核的诊断价值较高，而单一IGRA实验诊断价值中等。
图 1 IGRA及IGRA联合T淋巴细胞亚群检测诊断肺结核的ROC曲线Figure 1. The ROC curve of IGRA and IGRA combined with T lymphocyte subset detection in diagnosis of pulmonary tuberculosis3. 讨论
本研究通过全血γ-干扰素释放试验（IGRA）联合T淋巴细胞亚群检测，验证其在肺结核诊断中的作用。IGRA已广泛在临床中得到应用，既往不同研究显示，IGRA对活动性结核的敏感性在83%～100%之间[3, 13-14]，本研究单独IGRA的敏感性为86.2%，与既往研究基本一致。
本研究中纳入研究的实验组和对照组的男女比例、年龄均无明显差异。肺结核患者共计58例，痰涂阳性及痰涂阴性肺结核患者病情严重程度分布均衡。58例肺结核患者中，50例IGRA结果阳性，8例结果阴性；48例健康受试者中，2例IGRA结果阳性，46例IGRA结果阴性。IGRA可以很好区分肺结核患者及健康对照。但仍有2例误诊，笔者进一步追踪患者病史发现其既往有结核接触史，据此推测，如果患者既往有结核接触史或者有活动性结核，即使病情已经痊愈，其T细胞仍有免疫记忆，造成IGRA出现假阳性。而本研究中有5例患者漏诊，主要由于该类患者的病情较严重，出现严重的免疫抑制状态，受结核杆菌感染后的T细胞不能产生足够γ干扰素，故不能获得有效的统计量而出现假阴性。
结核感染后的机体内的免疫功能主要以T细胞介导的细胞免疫为主，根据其分子不同特征可分CD4（+）T细胞和CD8（+）T细胞，根据这两种细胞亚群在机体免疫中数量多少的动态平衡对结核病的发展和转归起着重要影响。研究证实，肺结核患者外周血的CD4+T细胞数较正常人明显减低[15]，同时，研究发现 CD4（+）/CD8（+）比值可作为疾病严重的一个重要指标，其比值下降明显，表示疾病较重，该比值上升，表示疾病恢复[16]。本研究中，肺结核患者在治疗前CD3（+）、CD4（+）T细胞及CD4（+）/CD8（+）与正常组比较明显下降，CD8（+）T细胞较正常组升高。因此联合外周血T淋巴细胞亚群检测可以进一步判断肺结核患者的病情。
如果IGRA阳性，患者临床上需考虑活动性肺结核、陈旧性肺结核、潜伏性结核杆菌感染。通过外周血T淋巴细胞亚群检测，如果出现CD4（+）细胞下降，CD4（+）/CD8（+）比值以及CD特别Th1细胞明显下降，提示患者可能已经为活动性肺结核或者即将转变为活动性肺结核，进而可以指导临床肺结核诊断和治疗。本研究通过IGRA检测联合T淋巴细胞亚群测定，发现对肺结核诊断的灵敏度为96.6%（56/ 58），特异度为91.7%（44/ 48），漏诊率为3.4%（2/ 58），误诊率为8.3%（4/48）。灵敏度及特异度均达到90以上，漏诊率也较单独IGRA检测（13.8%）明显下降。IGRA实验联合T淋巴细胞亚群检测ROC曲线下面积为0.911，进一步证实IGRA联合T淋巴细胞亚群检测与单独IGRA检测比较，可提高诊断的灵敏度，减少漏诊率，诊断价值明显提高。
此外，在本研究中2例健康对照出现IGRA假阳性，考虑与其陈旧性肺结核T细胞仍有免疫记忆有关，通过T淋巴细胞亚群检测，其结果正常，可排除活动性肺结核诊断。本研究还存在一些不足：（1）本研究的样本量较小，IGRA检测联合T淋巴细胞亚群测定时，漏诊率增加，考虑与样本量较小有关，但联合检测时灵敏度由86.2%上升至96.6%具有临床意义，特异度虽有下降，但仍高于90%，后期可增加样本量进一步验证试验结果；（2）研究为单中心研究，还需扩大研究范围，排除人群间差异。
综上，本研究提出的IGRA检查联合T淋巴细胞亚群检测诊断肺结核具有较高灵敏度和特异性，可以明显减少漏诊率，具有较高诊断价值，值得临床推广，是对活动性肺结核诊断的有效补充。
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图 1 IGRA及IGRA联合T淋巴细胞亚群检测诊断肺结核的ROC曲线
Figure 1. The ROC curve of IGRA and IGRA combined with T lymphocyte subset detection in diagnosis of pulmonary tuberculosis
表 1 受试者基线资料 [
$\bar x \pm s$ /n（%）]Table 1. Baseline characteristics of subjects [
$\bar x \pm s$ /n（%）]类别 肺结核组（n = 58） 健康对照组（n = 48） t χ2 P 性别n（%） 男 39（67.2） 30（62.5） \ 0.260 0.610 女 19（32.8） 18（37.5） 年龄（$\bar x$ ± s）（岁） 38 ± 15.8 40 ± 10.1 最大年龄 70 68 0.564 \ 0.575 最小年龄 19 19 痰涂阳性肺结核n（%） 41（70.7） \ 轻度肺结核 15（36.6） 中度肺结核 8（19.5） 重度肺结核 18（43.9） \ 0.054 0.973 痰涂阴性肺结核n（%） 17（29.3） \ 轻度肺结核 6（.3） 中度肺结核 3（17.7） 重度肺结核 8（47） IGRA n（%） 阳性 50（86.2） 2（4.2） 70.73 < 0.001* 阴性 8（13.8） 46（95.8） T淋巴细胞表达率 CD3（+） 63.1 ± 7.6 70.5 ± 8 3.796 \ < 0.001* CD4（+） 29.6 ± 8.5 37.4 ± 5.3 4.142 \ < 0.001* CD8（+） 28.1 ± 5.1 24.4 ± 3.7 3.158 \ 0.002* CD4（+）/CD8（+） 1.3 ± 0.3 1.6 ± 0.4 3.966 \ < 0.001* *P < 0.05。 
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表 2 肺结核组和对照组IGRA结果 n（%）
Table 2. Results of IGRA in TB group and control group n（%）
分组 肺结核组 对照组 合计 χ21 P1 χ22 P2 痰涂阳性1 痰涂阴性2 IGRA（+） 33（80.5） 15（88.2） 2（4.2） 50 53.981 < 0.001* 45.939 < 0.001* IGRA（−） 8（19.5） 2（11.8） 46（95.8） 56 合计 41 17 48 106 注：。χ21 为痰涂阳性组与对照组比较，χ22 为痰涂阴性组与对照组比较；*表示P < 0.05。
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表 3 IGRA检测肺结核的四格表（n）
Table 3. The 2 × 2 table of IGRA detection of pulmonary tuberculosis （n）
项目 肺结核 合计 + − IGRA + 50 2 52 − 8 46 54 合计 58 48 106 注：联合试验指IGRA联合T淋巴细胞亚群检测。
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表 4 联合试验检测肺结核的四格表（n）
Table 4. The 2 × 2 table of IGRA combined with T lymphocyte subset detection of pulmonary tuberculosis （n）
项目 肺结核 合计 + − 联合试验 + 56 4 52 − 2 44 54 合计 58 48 106 注：联合试验指IGRA联合T淋巴细胞亚群检测。
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