利用逆转录环介导恒温扩增技术建立新型冠状病毒核酸快速检测方法

李欢; 徐秋月; 王云娟; 苏洋; 唐睿珠

doi:10.12259/j.issn.2095-610X.S20210904

利用逆转录环介导恒温扩增技术建立新型冠状病毒核酸快速检测方法

doi: 10.12259/j.issn.2095-610X.S20210904

昆明医科大学第一附属医院医学检验科，云南省实验诊断研究所，云南省检验医学重点实验室，云南昆明　650032

基金项目: 云南省教育厅科学研究基金资助项目（2021J0237）

详细信息

作者简介:
李欢（1989～），女，云南保山人，医学硕士，主管技师，主要从事检验医学工作

通讯作者:
唐睿珠，E-mail：867046569@qq.com

中图分类号: R446.9
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出版历程
- 收稿日期: 2021-07-27
- 网络出版日期: 2021-09-09
- 刊出日期: 2021-09-30

The Rapid Detection of Nucleic Acid in SARS-CoV-2 by Reverse Transcription Loop Mediated Isothermal Amplification

Dept. of Clinical Laboratory，The 1st Affiliated Hospital of Kunming Medical University，Yunnan Institute of Experimental Diagnosis，Yunnan Key Laboratory of Laboratory Medicine，Kunming Yunnan 650032，China

摘要

摘要: 目的利用逆转录环介导恒温扩增技术建立新型冠状病毒核酸快速检测方法。方法针对新型冠状病毒的特征核壳蛋白N基因和开放阅读框1ab（ORF1ab）基因序列保守区设计引物，获得了 RT-LAMP 检测体系，并评价该体系的特异性、最低检测限、抗干扰能力和最佳反应时间。结果经检测新型冠状病毒核酸标准物质，其结果与预期相符，证实了该检测体系的可行性。结论利用逆转录环介导恒温扩增技术快速检测新型冠状病毒核酸的反应体系特异性好、灵敏度高，适用于边境条件有限地区。
- 新型冠状病毒 /
- 核酸检测 /
- 逆转录环介导恒温扩增技术
Abstract: Objective To establish a rapid detection method for the nucleic acid of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 （SARS-CoV-2） based on the reverse transcription loop mediated isothermal amplification （RT-LAMP）. Method The RT-LAMP primers were designed according to the conservative region of N and ORF1ab gene of SARS-CoV-2. And the specificity, the minimum detection limit, the anti-interference ability and the best reaction time of the system were evaluated. Result Artificial synthesized SARS-CoV-2 nucleic acid samples were tested, and the results were consistent with the expected results.It confirmed the feasibility of the detection system. Conclusion The reaction system using RT-LAMP for the rapid detection of SARS-CoV-2 nucleic acid has the high specificity and sensitivity, and is suitable for the border areas with limited conditions.
- Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 /
- Nucleic acid testing /
- Reverse transcription loop mediated isothermal amplification

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图 1 特异性评价

A：ORF1ab基因引物组的特异性评价；B：N基因引物组的特异性评价。图A以ORF1ab基因引物组为引物，加入不同物质为模板，进行RT-LAMP扩增的结果;图B以N基因引物组为引物，加入不同物质为模板，进行RT-LAMP扩增的结果。1：以新型冠状病毒标准物质为模板； 2：以甲型、乙型流感病毒质粒为模板； 3：以灭菌注射用水为模板； NC为阴性对照。

Figure 1. Evaluation of specificity

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图 2 ORF1ab基因的最低检测限评价

A：1～10：10个复孔，加入的新型冠状病毒标准物质浓度均为8.96×10²copies/μL；B：1～10：10个复孔，加入的新型冠状病毒标准物质浓度均为0.60×10³copies/μL；C：1～10：10个复孔，加入的新型冠状病毒标准物质浓度均为0.50×10³copies/μL；NC为阴性对照。

Figure 2. Evaluation of limit of detection of ORF1ab gene set

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图 3 N基因的最低检测限评价

以N基因引物组为引物，加入不同浓度的新型冠状病毒标准物质为模板，进行RT-LAMP扩增的结果。A：1-10：10个复孔，加入的新型冠状病毒标准物质浓度均为1.73×10³copies/uL；B：1-10：10个复孔，加入的新型冠状病毒标准物质浓度均为0.87×10³copies/uL；C：1-10：10个复孔，加入的新型冠状病毒标准物质浓度均为0.50×10³copies/uL；D：1-10：10个复孔，加入的新型冠状病毒标准物质浓度均为0.40×10³copies/uL；NC为阴性对照。

Figure 3. Evaluation of limit of detection of N gene set

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图 4 抗干扰能力评价

A：ORF1ab基因引物组的抗干扰能力评价；B：N基因引物组的抗干扰能力评价。图A以ORF1ab基因引物组为引物，在阳性、阴性模板中加入不同的干扰物质，进行RT-LAMP扩增的结果;图B以N基因引物组为引物，在阳性、阴性模板中加入不同的干扰物质，进行RT-LAMP扩增的结果。1：以新型冠状病毒标准物质和新鲜血液的混合物为模板； 2：以新型冠状病毒标准物质和鼻分泌物的混合物为模板； 3：以新型冠状病毒标准物质和样本保存液的混合物为模板； 4：以灭菌注射用水和新鲜血液的混合物为模板； 5：以灭菌注射用水和鼻分泌物的混合物为模板； 6：以灭菌注射用水和样本保存液的混合物为模板； NC为阴性对照。

Figure 4. Evaluation of anti-interference ability

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图 5 最佳反应时间评价

A：ORF1ab基因引物组的最佳反应时间评价；B：N基因引物组的最佳反应时间评价。

Figure 5. Evaluation of optimal reaction time

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表 1 RT-LAMP引物序列

Table 1. Primer sequences for RT-LAMP

基因名称	Primer名称	序列（5′-3′）
	F3	caaacgtaacaccaaccgc
	B3	ggcgagccttggggata
ORF1ab	FIP	cggcaacaggtaaactccaccacgcccacaggacgtcaag
	BIP	taagtgtgcgcgcgactatgtcgccttccacgagg
	LF	ggaagacttccgagcggt
	F3	tgcggaaccggtgagt
	B3	cacggtctacgagacctcc
N	FIP	ggccgggcatagagtgggtcaccggaattgccgggaag
	BIP	ccgcaagactgctagccgagcrccctatcaggcagtacca
	LB	tagcgttgggttgcgaaag

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表 2 RT-LAMP反应结果的判读

Table 2. Strategies for judging RT-LAMP results of SARS-COV-2

试验结果	结果判断
ORF1ab基因、N基因均（+）	SARS-CoV-2阳性
ORF1ab基因、N基因均（−）	SARS-CoV-2阴性
仅有ORF1ab基因（+）	重复检测，若仍为（+），则判为SARS-CoV-2阳性。
仅有N基因（+）	重复检测，若ORF1ab基因、N基因均（+），则判为SARS-CoV-2阳性。

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