The Rapid Detection of Nucleic Acid in SARS-CoV-2 by Reverse Transcription Loop Mediated Isothermal Amplification
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摘要:
目的 利用逆转录环介导恒温扩增技术建立新型冠状病毒核酸快速检测方法。 方法 针对新型冠状病毒的特征核壳蛋白N基因和开放阅读框1ab（ORF1ab）基因序列保守区设计引物，获得了 RT-LAMP 检测体系，并评价该体系的特异性、最低检测限、抗干扰能力和最佳反应时间。 结果 经检测新型冠状病毒核酸标准物质，其结果与预期相符，证实了该检测体系的可行性。 结论 利用逆转录环介导恒温扩增技术快速检测新型冠状病毒核酸的反应体系特异性好、灵敏度高，适用于边境条件有限地区。 -
关键词:
- 新型冠状病毒 /
- 核酸检测 /
- 逆转录环介导恒温扩增技术
Abstract:Objective To establish a rapid detection method for the nucleic acid of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 （SARS-CoV-2） based on the reverse transcription loop mediated isothermal amplification （RT-LAMP）. Method The RT-LAMP primers were designed according to the conservative region of N and ORF1ab gene of SARS-CoV-2. And the specificity, the minimum detection limit, the anti-interference ability and the best reaction time of the system were evaluated. Result Artificial synthesized SARS-CoV-2 nucleic acid samples were tested, and the results were consistent with the expected results.It confirmed the feasibility of the detection system. Conclusion The reaction system using RT-LAMP for the rapid detection of SARS-CoV-2 nucleic acid has the high specificity and sensitivity, and is suitable for the border areas with limited conditions. -
冠心病近年来已经发展成为威胁人类健康的主要疾病之一。查询《中国心血管健康与疾病报告2019》[1]，我国现阶段动脉粥样硬化性心血管病（arteriosclerosis cardiovascular disease，ASCVD）高危/极高危人群的降脂治疗率、达标率现状堪忧，中国心血管病患病率处于持续上升阶段。推算心血管病现患人数 3.30 亿，冠心病1 100万。综上所述，目前我国冠心病方面的情况十分严峻，急需更好的检测指标及有效的药物。
磷脂酶相关脂蛋白A2（lipoprotein-associated phospholipaseA2，Lp-PLA2）是磷脂酶A2超家族成员之一，是一个新型的炎症标志物与斑块的不稳定和破裂有直接关系[2]。目前认为Lp-PLA2是冠心病的独立危险因素，降低Lp-PLA2可以有效的防治冠心病。2015年美国FDA已经批准将该指标用于预测冠心病和缺血性脑卒中[3]。Lp-PLA2作为一个较新的炎性标志物，可能受到诸多因素的影响，因此本文将评估所选取研究对象的性别，年龄，有无高血压，有无糖尿病及有无吸烟对患者Lp-PLA2的影响。阿托伐他汀和瑞舒伐他汀是目前应用最广泛的他汀类药物，广泛用于防治冠心病和降低高血脂患者的血脂。Lp-PLA2与冠心病的发生及预后都有较好的相关性，但Lp-PLA2与他汀类药物疗效的相关性尚不明确。因此，本文将初步探讨Lp-PLA2是否可作为阿托伐他汀和瑞舒伐他汀疗效监测的指标。
1. 资料与方法
1.1 一般资料
选取2020年2月至2021年4月在云南新昆华医院住院且入院之前确诊为冠心病以及初次经冠脉检测诊断为冠心病的患者，共58例。根据患者是否服用过他汀类药物分为2组。观察组为住院且入院之前确诊为冠心病并服用他汀类药物3月以上的患者29例，年龄：28～88岁，平均（67.0±13.6）岁。其中，男性24例，女性5例；有高血压病史22例，有糖尿病史13例，有吸烟史19例。 对照组为住院且初次经冠脉检测诊断为冠心病的患者29例，年龄：42～86岁，平均（62.9±10.0）岁。其中，男性23例，女性5例，有高血压病史14例有糖尿病史9例，有吸烟史19例。观察组和对照组除高血压外（P = 0.029），在性别、年龄、糖尿病史、吸烟史等方面，差异无统计学意义（P > 0.05），见表1。
表 1 2组研究对象的临床资料对比[n（%）]Table 1. Comparison of clinical information between the two groups [n（%）]组别 n 男 青年人 高血压 糖尿病 吸烟 对照组 29 23（79.3） 19（65.5） 14（48.3）* 9（31.0） 19（65.5） 观察组 29 24（82.8） 12（41.4） 22（75.7） 13（44.8） 19（65.5） χ2 1.000 0.113 0.057 0.417 1.000 P 0.500 0.057 0.029 0.209 0.609 0～17岁为未成年人，18～65岁为青年人，66～79岁为中年人，80～99岁为老年人。与对照组比较，*P < 0.05。 1.2 纳入和排除标准
课题组设计了纳入和排除标准。观察组纳入标准：（1）入院之前已确诊冠心病；（2）服用他汀类药物3月以上。排除标准：（1）无确切诊断冠心病的依据；（2）他汀类药物服用时长未满3月；（3）有先天性心脏病，心肌病，恶性肿瘤等其他疾患。用药情况 （1）瑞舒伐他汀钙片10 mg，1次/d：17例；（2）阿托伐他汀钙片（北京）20 mg，1次/d：12例。
对照组纳入标准：经冠脉检测确定为冠心病。排除标准：（1）入院之前在服用他汀类药物；（2）有先天性心脏病，心肌病，恶性肿瘤等其他疾患。
1.3 研究方法
1.3.1 Lp-PLA2的检测
用含促凝剂的橙色真空采血管准确采集研究对象的空腹静脉血4 mL，室温下静置60 min后，3 000 r/min，离心15 min，用上层血清测定LP-PLA2。加载试剂后，用相应定标品定标成功后运行质控，在质控在控的情况下运行研究对象的血清标本，Lp-PLA2用胶乳增强免疫比浊法进行测定。
1.3.2 评估相关因素对Lp-PLA2的影响
研究对象的临床资料 ：性别，年龄，高血压史，糖尿病史，吸烟史 。
1.3.3 Lp-PLA2对他汀类药物疗效监测的作用
根据相关因素对Lp-PLA2影响的评估结果，对观察组和对照组的Lp-PLA2进行统计学分析和比较。
1.4 仪器与试剂
（1）仪器：佳能TBA-Fx8全自动生化分析仪（日本佳能医疗系统有限公司生产），医用血管造影X射线系统（飞利浦投资有限公司生产）；（2）试剂：安徽伊普诺康生物技术股份有限公司提供的Lp-PLA2检测试剂盒、定标品及质控品。
1.5 统计学处理
采用软件SPSS16.0进行数据分析。计数资料用频数（%）表示，组间比较用卡方检验。正态分布数据用(
$\bar x \pm {\rm{s}}$ )表示，2组数据用独立样本t检验进行分析；非正态分布的定量检测数据用[M （P25，P75）]描述，2组间比较采用Mann-Whitney U非参数检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。2. 结果
2.1 相关因素对Lp-PLA2的影响
2.1.1 性别对Lp-PLA2的影响
通过对观察组和对照组中的男性组和女性组的Lp-PLA2分别进行统计分析，U 检验，结果显示，各组男女之间的Lp-PLA2，差异无统计学意义（P > 0.05），见表2。
表 2 不同性别的Lp-PLA2比较[M（P25，P75）]Table 2. Comparison of Lp-PLA2 of different genders[M（P25，P75）]组别 男 女
Z
P对照组（ng/mL） 279.6
（225.4，347.1）234.8
（179.4，398.1）−1.023 0.306 观察组（ng/mL） 142.0
（095.3，183.8）095.5
（077.8，194.5）−0.635 0.525 2.1.2 年龄对Lp-PLA2的影响
根据联合国世界卫生组织对人类年龄段划分的规定，本研究对观察组和对照组的青年组和中老年组Lp-PLA2分别进行统计分析，U 检验，结果显示，青年组和中老年组之间的Lp-PLA2，差异无统计学意义（P > 0.05），见表3。
表 3 不同年龄段的Lp-PLA2比较[M（P25，P75）]Table 3. Comparison of Lp-PLA2 in different age groups[M（P25，P75）]组别 青年人 中老年人 Z
P对照组
（ng/mL）297.7
（206.4，409.3）263.5
（204.0，285.3）−1.560 0.119 观察组
（ng/mL）145.9
（095.8，185.1）137.1
（77.9，181.1）−0.753 0.452 2.1.3 有无高血压对Lp-PLA2的影响
根据对纳入的高血压组和无高血压组患者Lp-PLA2进行统计分析，U 检验，结果显示，2组之间的差异无统计学意义（P > 0.05），见表4。
表 4 有无高血压的Lp-PLA2比较[M（P25，P75）]Table 4. Comparison of Lp-PLA2 with or without hypertension [M（P25，P75）]
组别有高血压 没有高血压
Z
P对照组
（ng/mL）287.7
（221.0，398.1）274.1
（205.5，312.3）−0.873 0.383 观察组
（ng/mL）143.5
（094.3，194.6）96.8
（089.7，168.1）−0.968 0.333 2.1.4 有无糖尿病对Lp-PLA2的影响
对纳入对照组和对照观察组中的糖尿病组和无糖尿病组患者的Lp-PLA2进行统计分析，对照组的没有糖尿病组为非正态分布数据，用中位数（四分位数）表示；观察组的2组数据为正态分布数据，用（
$\bar x \pm s $ ）表示。结果显示，2组之间的差异无统计学意义（P > 0.05），对照组见表5，观察组见表6。表 5 对照组有无糖尿病的Lp-PLA2比较[M（P25，P75）]Table 5. Comparison of Lp-PLA2 with or without diabetes in the control group [M（P25，P75）]组别 有糖尿病 没有糖尿病
Z
P对照组
（ng/mL）271.3
（216.5，401.8）287.7
（205.7，357.4）−0.873 0.383 表 6 观察组有无糖尿病的Lp-PLA2比较 （$\bar x \pm s $ ）Table 6. Comparison of Lp-PLA2 with or without diabetes in the observation group （$\bar x \pm s $ ）组别 有糖尿病 没有糖尿病 t P 观察组
（ng/mL）129.0±53.8 161.5±82.3 0.734 0.399 2.1.5 是否吸烟对Lp-PLA2的影响
对纳入观察组和对照组中的吸烟组和不吸烟组患者的Lp-PLA2进行统计分析，U 检验，结果显示，2组之间的差异无统计学意义（P > 0.05），见表7。
表 7 是否吸烟的Lp-PLA2比较[M（P25，P75）]Table 7. Comparison of Lp-PLA2 for smoking or not [M（P25，P75）]组别 吸烟 不吸烟
Z
P对照组
（ng/mL）279.6
（207.6，369.4）194.9
（143.6，355.0）−0.780 0.435 观察组
（ng/mL）144.4
（94.9，186.6）128.5
（78.2，183.7）−0.413 0.680 2.2 Lp-PLA2对他汀类药物疗效监测的作用
在上述结果的基础上，本研究对纳入观察组和对照组的所有患者的Lp-PLA2进行了统计学分析，结果显示，观察组的Lp-PLA2中位数明显低于对照组[分别为139.6（94.0～181.1）ng/mL和278.6（207.0～358.3）ng/mL]，2组差异有统计学意义（P < 0.001），见表8。
表 8 Lp-PLA2对他汀类药物疗效监测的作用[M（P25，P75）]Table 8. The effect of Lp-PLA2 on monitoring the efficacy of statins [M（P25，P75）]项目 对照组 观察组
Z
Pn 29 29 − − Lp-PLA2（ng/mL） 278.6（207.0，358.3） 139.6（94.0，181.1） −5.412 < 0.001 3. 讨论
此次的研究表明性别、年龄、是否有糖尿病、是否吸烟的不同冠心病患者的Lp-PLA2中位数存在一定的差异，但差异均无统计学意义（P > 0.05）。由于笔者此次的研究是回顾性研究，所以在纳入的研究对象中对照组和观察组的有无高血压的病例人数在统计学上有差异，但是笔者在后续的分析中得出高血压对Lp-PLA2的影响无统计学差异，进一步增强了笔者最终结论的说服力。在排除大部分因素对患者Lp-PLA2影响后，比较冠心病患者的Lp-PLA2在服用他汀类药物前后的差异发现他汀类药物可以有效地降低冠心病患者的Lp-PLA2，即Lp-PLA2可作为使用他汀类药物治疗的冠心病患者的有效监测指标。
随着我国生活水平的提高，冠心病的发病率，病死率处于一个相当高的水平，冠心病严重降低了患者的生活水平[4]。在冠心病血管炎性过程中，Lp-PLA2可以通过水解氧化的低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）形成理论斑块中的促炎物质，加速动脉粥样硬化的进程[2]，故Lp-PLA2在冠心病的发生发展及治疗过程中都扮演着非常重要的角色。虽然这个指标在冠心病患者中的应用具有较好的研究前景，但是其影响因素较多。有报道称[5]，性别和种族可以影响Lp-PLA2的血清浓度。因此，使用Lp-PLA2来评价冠心病患者的治疗效果及预后时需要把这些因素考虑进去。但Lp-PLA2作为一个比较新的指标，上述因素对其到底有何影响、影响有多大等情况的研究数据较少，所以本研究的一大创新之处在评估Lp-PLA2作为他汀类药物的疗效监测指标适用性之前先分析了研究对象的一般临床情况（性别，年龄，是否有高血压，是否有糖尿病，是否吸烟）对Lp-PLA2的影响，一方面提供了这方面研究的数据，另一方面也很好地排除了这些因素对Lp-PLA2的影响，让笔者后续的研究结果更有说服力。但由于本研究纳入病例数尚少，本结果还需扩大病例进行验证。冠心病的预防是目前大多数人关注的一个重点，他汀类降脂药物广泛用于冠心病的一级、二级预防[6]。云南新昆华医院用的他汀降脂药是阿托伐他汀和瑞舒伐他汀。张恒亮等[7]的研究证实了Lp-PLA2可以作为评价冠心病患者疾病风险的有效指标，周菊芬等[8]的研究表明Lp-PLA2水平是冠心病患者发生不良心血管事件的较好的预测指标。因此，本研究证实了阿托伐他汀与瑞舒伐他汀能够有效地降低冠心病患者Lp-PLA2水平，可以有效地降低其发生不良心血管事件的概率，Lp-PLA2可用于监测冠心病患者的他汀类药物治疗情况。综上所述，本研究不仅证实了阿托伐他汀或瑞舒伐他汀对冠心病患者的预防及预后起到了很好的作用，也是冠心病患者预防和治疗过程中不可缺少的一类药物，而且提示了Lp-PLA2可作为冠心病患者服用他汀类药物后判断疗效的监测指标。此外Wangd等[9]的研究证实患者的Lp-PLA2是和冠状动脉病变支数相关的，研究[10]还发现Lp-PLA2还与Gensini积分密切相关，这说明Lp-PLA2在冠心病患者的病情严重程度方面有较好地预警作用。
综上所述，Lp-PLA2在冠心病的诊疗中是一个非常有效的指标，对临床具有较好的指导意义。本次研究也存在一些不足之处，主要在于笔者此次观察组的研究对象年龄偏大再加上大部分患者就诊医院太多，导致很难完整的收集其用药前的资料，在数据收集过程中因为病例的不完善，剔除了很多研究对象，导致此次纳入的研究对象较少，而且观察组没有区分患者是用阿托伐他汀还是瑞舒伐他汀，然而瑞舒伐他汀与阿托伐他汀对冠心病患者降脂效果是有差别的，主要原因在于两者的药理学机制有差异：阿托伐他汀能够调节机体微循环；而瑞舒伐他汀能够抑制血小板聚集，减轻机体炎性反应，维持血流通畅，发挥抗血栓作用[11]。在冠心病的治疗中，陈颖[12]的研究证实，比起阿托伐他汀来说瑞舒伐他汀的治疗效果更显著。此外，他汀药的剂量也会影响降脂效果，孙彦彦[13]的研究证实，80 mg剂量的阿托伐他汀较常规剂量组更能降低冠心病患者的Lp-PLA2。因此，笔者后续拟对使用阿托伐他汀和瑞舒伐他汀、药物不同剂量的患者进行分组研究和加大病例数进行研究验证，为Lp-PLA2在冠心病诊治和预防等方面的应用提供更有力的实验依据。
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图 1 特异性评价
A：ORF1ab基因引物组的特异性评价；B：N基因引物组的特异性评价。图A以ORF1ab基因引物组为引物，加入不同物质为模板，进行RT-LAMP扩增的结果;图B以N基因引物组为引物，加入不同物质为模板，进行RT-LAMP扩增的结果。1：以新型冠状病毒标准物质为模板； 2：以甲型、乙型流感病毒质粒为模板； 3：以灭菌注射用水为模板； NC为阴性对照。
Figure 1. Evaluation of specificity
图 2 ORF1ab基因的最低检测限评价
A：1～10：10个复孔，加入的新型冠状病毒标准物质浓度均为8.96×102 copies/μL；B：1～10：10个复孔，加入的新型冠状病毒标准物质浓度均为0.60×103 copies/μL；C：1～10：10个复孔，加入的新型冠状病毒标准物质浓度均为0.50×103 copies/μL；NC为阴性对照。
Figure 2. Evaluation of limit of detection of ORF1ab gene set
图 3 N基因的最低检测限评价
以N基因引物组为引物，加入不同浓度的新型冠状病毒标准物质为模板，进行RT-LAMP扩增的结果。A：1-10：10个复孔，加入的新型冠状病毒标准物质浓度均为1.73×103 copies/uL；B：1-10：10个复孔，加入的新型冠状病毒标准物质浓度均为0.87×103 copies/uL；C：1-10：10个复孔，加入的新型冠状病毒标准物质浓度均为0.50×103 copies/uL；D：1-10：10个复孔，加入的新型冠状病毒标准物质浓度均为0.40×103 copies/uL；NC为阴性对照。
Figure 3. Evaluation of limit of detection of N gene set
图 4 抗干扰能力评价
A：ORF1ab基因引物组的抗干扰能力评价；B：N基因引物组的抗干扰能力评价。图A以ORF1ab基因引物组为引物，在阳性、阴性模板中加入不同的干扰物质，进行RT-LAMP扩增的结果;图B以N基因引物组为引物，在阳性、阴性模板中加入不同的干扰物质，进行RT-LAMP扩增的结果。1：以新型冠状病毒标准物质和新鲜血液的混合物为模板； 2：以新型冠状病毒标准物质和鼻分泌物的混合物为模板； 3：以新型冠状病毒标准物质和样本保存液的混合物为模板； 4：以灭菌注射用水和新鲜血液的混合物为模板； 5：以灭菌注射用水和鼻分泌物的混合物为模板； 6：以灭菌注射用水和样本保存液的混合物为模板； NC为阴性对照。
Figure 4. Evaluation of anti-interference ability
图 5 最佳反应时间评价
A：ORF1ab基因引物组的最佳反应时间评价；B：N基因引物组的最佳反应时间评价。
Figure 5. Evaluation of optimal reaction time
表 1 RT-LAMP引物序列
Table 1. Primer sequences for RT-LAMP
基因名称 Primer名称 序列（5′-3′） F3 caaacgtaacaccaaccgc B3 ggcgagccttggggata ORF1ab FIP cggcaacaggtaaactccaccacgcccacaggacgtcaag BIP taagtgtgcgcgcgactatgtcgccttccacgagg LF ggaagacttccgagcggt F3 tgcggaaccggtgagt B3 cacggtctacgagacctcc N FIP ggccgggcatagagtgggtcaccggaattgccgggaag BIP ccgcaagactgctagccgagcrccctatcaggcagtacca LB tagcgttgggttgcgaaag 
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表 2 RT-LAMP反应结果的判读
Table 2. Strategies for judging RT-LAMP results of SARS-COV-2
试验结果 结果判断 ORF1ab基因、N基因均（+） SARS-CoV-2阳性 ORF1ab基因、N基因均（−） SARS-CoV-2阴性 仅有ORF1ab基因（+） 重复检测，若仍为（+），则判为SARS-CoV-2阳性。 仅有N基因（+） 重复检测，若ORF1ab基因、N基因均（+），则判为SARS-CoV-2阳性。
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