Serological Study to Self-assembled Nanoparticle Influenza Vaccine with the M2e-HA2 Epitopes
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摘要:
目的 构建M2e-HA2串联表位的自组装纳米颗粒通用流感疫苗,并进行免疫血清学检测。 方法 将流感病毒M2e和HA2抗原表位与Ferritin蛋白串联表达,非变性条件下提取并经亲和层析纯化获得纳米自组装颗粒,经Western blot和电镜验证后免疫小鼠。2次免疫后采集小鼠血清,使用Western blot进行抗原性检测,使用ELISA进行抗体水平检测。 结果 成功制备M2e-HA2串联表位的自组装纳米颗粒,将其免疫小鼠后血清中产生高水平的M2e和HA2特异性抗体。 结论 M2e-HA2串联表位的自组装纳米颗粒可以刺激小鼠产生高水平的M2e和HA2特异性抗体,为通用流感疫苗研发奠定基础。 -
关键词:
- M2e-HA2串联表位 /
- 自组装纳米颗粒 /
- 流感疫苗 /
- 血清学
Abstract:Objective To construct the self-assembled nanoparticle influenza vaccine with the M2e-HA2 epitopes, and detect the immunological serology. Methods The M2e and HA2 antigen epitopes of influenza viruses were expressed in tandem with Ferritin protein, and the nanometer self-assembled particles were extracted under the condition of non-denatured and purified by affinity chromatography. The mice were immunized for two times, after the two immunizations, serum of mice was collected, western blot was used for antigenicity detection, and ELISA was used for antibody level detection. Results M2e-HA2self-assembled nanoparticles were successfully prepared, and high levels of M2e and HA2 specific antibodies were produced in the serum of immunized mice. Conclusion M2e-HA2 self-assembled nanoparticles can stimulate the production of high levels of M2e and HA2 specific antibodies in mice, laying the foundation for the development of a universal influenza vaccine. -
Key words:
- M2e-HA2 epitopes /
- Self-assembled nanoparticles /
- Influenza vaccine /
- Serological study
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流感病毒因其高发的点突变率和基因重排使疫苗和抗病毒药物很容易失去作用[1-2],一旦遇到高耐药性、突变位点特殊的流行株很难实现及时高效的人为干预,可能导致流感大流行,给人类健康和社会稳定带来极大挑战。季节性流感在全球范围内每年可引起1000000000人发病,650000人死亡[3]。上个世纪以来曾发生至少 4次流感大流行,即1918年西班牙H1N1流感、1957年亚洲 H2N2流感、1968年香港H3N2流感和2009年H1N1猪流感[4]。近几年H7N9禽流感[5]和H5N1猪流感[4]流感病毒感染人类的爆发已经形成了公共卫生和社会经济的负担,并且提示了建立积极应对预防的紧迫性和必要性。加强建立快速的疫情控制手段,最有效最直接的方式就是快速研制针对不同亚型均具有保护性的广谱性疫苗。
鉴于传统裂解疫苗在流感病毒流行和爆发期间的预防在时效性和保护性方面并不非常理想,因此能够交叉中和不同型流感病毒的新型流感疫苗或通用型流感疫苗是当前疫苗发展的一个热点。新型流感疫苗设计的发展趋势包括选择更加保守的靶抗原、加快候选疫苗株的高效筛选及充分提高疫苗的保护效果。在甲型流感疫苗领域,高度保守的抗原结构域以及位于病毒囊膜表面的抗原特性决定了HA茎部[6-9]和M2e[10-11]可以作为广谱流感疫苗的主要靶点,也成为目前流感病毒通用疫苗研究的热点。
为了更为有效地展示这类亚单位抗原,将候选抗原与能发生自组装的蛋白分子嵌合表达,形成纳米蛋白颗粒。幽门螺杆菌转铁蛋白(Ferritin)是近年来开发运用于制备纳米颗粒疫苗的首选载体之一[12-14]。铁蛋白由24个铁蛋白亚基自组装而成,其中每3个亚基组成一个三聚体亚单位,8个三聚体再组装成一个外径12 nm,内径8 nm的球形空心纳米笼状结构[15]。2013年,Kanekiyo等[12]通过将H1亚型HA与幽门螺杆菌铁蛋白亚基N端融合表达,重组蛋白自发装配形成多聚体球状纳米颗粒结构[16-21],HA抗原表达展示于球状纳米粒的表面,产生了良好的免疫应答。
本项目基于流感病毒血凝素HA蛋白的茎部基因和基质蛋白基因的保守性,将研究幽门螺杆菌转铁蛋白Ferritin与A型流感病毒HA2、M2e串联表达在真核表达系统中,生成可以展示HA2和M2e抗原的自组装抗原颗粒,从蛋白结构、免疫抗原性等方面进行评估,为进行流感病毒新型疫苗的开发奠定基础。
1. 材料与方法
1.1 实验材料
实验用M2e基因来自于本实验室前期合成,HA与ferritin串联的基因序列由华大基因公司全基因合成。高保真Taq酶、In-fusion试剂、限制性内切酶Hind Ⅲ和Xho Ⅰ购自于TAKARA,转染试剂FuGENE HD Transfection Reagent购自于Promega,His、M2抗体购自于Abcam。
1.2 M2e-HA2自组装纳米颗粒载体构建
使用高保真Taq酶分别扩增得到M2e序列和HA2与Ferritin串联的基因序列,并在M2e的5′端和HA2-ferritin的3′端分别加上Hind Ⅲ和Xho I限制性内切酶位点。使用In-fusion将M2e、HA2-ferritin以及经上述两种限制性内切酶线性化的pcDNATM3.1质粒连接到一起。将阳性单克隆菌落提取质粒后进行测序和酶切验证。
1.3 M2e-HA2自组装纳米颗粒表达验证
使用FuGENEHD转染试剂将pcDNATM3.1-M2e-HA2-ferritin质粒转染293T细胞,转染48 h后收集细胞并进行非变性条件蛋白提取。细胞经反复冻融3次后,经6 s ON,3 s OFF超声破碎10 min,12000 r/min离心30 min后收集上清,获得M2e-HA2-ferritin纳米自组装颗粒蛋白。使用his和M2抗体进行非变性条件和变性条件下的Western blot验证。
1.4 M2e-HA2自组装纳米颗粒纯化及验证
使用Ni-NTA填料进行M2e-HA2-ferritin亲和层析纯化,进行梯度洗脱并收集200 mM咪唑和300 mM咪唑洗脱液洗脱样品,使用10 kD超滤管进行蛋白富集。使用2 mM PBS缓冲液将蛋白样品经2 mm透析袋透析过夜,BCA法测定蛋白浓度。使用his和M2抗体进行非变性条件和变性条件下的Western blot验证,并使用透射电镜观察蛋白样品。
1.5 M2e-HA2自组装纳米颗粒免疫血清学验证
每只Balb/c小鼠皮下注射免疫10 µg M2e-HA2纳米自组装颗粒,间隔2周后进行第2次加强免疫。采集小鼠血清,1∶200稀释血清作为一抗进行Western blot检测纳米颗粒的抗原性。使用人工合成的M2e和HA2的多肽进行ELISA检测,分析针对M2e和HA2特异性抗体水平。其中,M2e多肽序列为SLLTEVETPIRN,HA2多肽序列为MIDGWYGYHHQN。
2. 结果
2.1 M2e-HA2自组装纳米颗粒载体构建
PCR获得M2e序列大小139 bp,HA2-ferritin序列大小1210 bp。阳性单克隆菌落提取质粒测序验证没有发生碱基突变,并且使用Hind Ⅲ和Xho Ⅰ酶切验证得到1296 bp的阳性片段。DNA Marker为DL2000(TAKARA),见图1。
2.2 M2e-HA2自组装纳米颗粒表达验证
将M2e-HA2-ferritin载体转染293T 细胞,48 h后收样进行非变性和变性条件下的Western blot检测。非变性Western blot得到特异产物带在180 kD以上,证明M2e-HA2-ferritin在细胞内形成多聚体高级结构。变性Western blot产物即为M2e-HA2-ferritin单体,大小在48.355 kD,见图2。
2.3 M2e-HA2自组装纳米颗粒纯化及验证
将非变性提取蛋白使用Ni-NTA亲和层析纯化并进行过夜透析后,进行非变性和变性条件下的Western blot检测。非变性考马斯亮蓝染色和Western blot得到特异产物带在180 kD以上,变性Western blot产物大小在48.355 kD。透射电镜观察M2e-HA2纯化产物可以看到结构稳定大小在100 nm左右的纳米颗粒。测定蛋白浓度为204 ng/μL,见图3。
2.4 M2e-HA2自组装纳米颗粒免疫血清学验证
使用免疫小鼠血清在变性和非变性条件下检测M2e-HA2纳米自组装颗粒抗原性,使用M2e-HA2二免小鼠血清1∶200稀释作为一抗,变性条件下得到48.355 kD的阳性带,非变性条件下得到180 kD以上的特异带。ELISA检测M2e-HA2二免小鼠血清中特异性抗体水平,针对M2e的抗体水平达到1∶1066.667,针对HA2的抗体水平达到1∶1333.333,见图4。
3. 讨论
新型流感疫苗设计的发展趋势包括选择更加保守的靶抗原、加快候选疫苗株的高效筛选及充分提高疫苗的保护效果。与重配技术或VLPs流感疫苗研究相比,保守抗原的自组装颗粒最显著地区别在于流感病毒主要血清抗原保守区域与特定生物分子嵌合表达后,能够在真核表达系统中自行组装成纳米球体。在甲型流感疫苗领域,高度保守的抗原结构域以及位于病毒囊膜表面的抗原特性决定了HA2和M2e作为广谱流感疫苗的主要靶点。本项目通过M2e-HA2抗原的新型流感疫苗抗原自组装技术制备平台,为迅速有效的研发和生产具有时效性的流感通用疫苗提供具体的技术参考、技术储备和产品后备。
常规流感疫苗的研发主要有以下几种策略:(1)由WHO及各国CDC监测年度流行株,提交至WHO分析后给出推荐疫苗株,由各个国家生产疫苗;(2)通过从确诊为甲流病毒感染病人的样本中分离获得病毒,接种至鸡胚培养病毒,通过大量鸡胚培养获得用于疫苗生产;(3)通过特定细胞株的适应培养,使流行株在细胞培养传代后成为减毒株,扩增后制备成疫苗;(4)通过反向遗传技术获得人工重配的特定重组病毒,并经细胞适应后筛选株制备的疫苗。流感疫苗HA-M2e抗原颗粒技术与重配技术或VLPs流感疫苗研究相比,自组装颗粒最显著地区别在于流感病毒主要血清抗原保守区域与特定生物分子嵌合表达后,能够在真核表达系统中自行组装成纳米球体,并在球体表面展示HA2和M2e抗原,嵌合表达纳米蛋白颗粒具有较强烈的免疫刺激作用,能有效激活体液免疫,产生高效价的抗体。
本项目基于流感病毒血凝素HA蛋白的茎部基因和基质蛋白基因的保守性,构建可以展示M2e和HA2抗原的自组装抗原颗粒,从蛋白结构、免疫抗原性等方面进行评估,证明M2e-HA2串联的自组装纳米颗粒可以刺激小鼠产生高水平的M2e和HA2特异性抗体,为通用流感疫苗研发奠定基础。
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图 3 M2e-HA2自组装纳米颗粒纯化产物验证
a:非变性PAGE胶考马斯亮蓝染色检测M2e-HA2多聚体,证明产物条带单一;b:非变性Western blot检测M2e-HA2纯化产物,使用M2抗体,大小在180 kD以上;c:变性Western blot检测M2e-HA2纯化产物,使用M2抗体,大小在48.355 kD;d:透射电镜观察M2e-HA2纯化产物,可看到结构稳定大小在100 nm左右的纳米颗粒,标尺大小为200 nm。
Figure 3. Validation of purified products of M2e-HA2 self-assembled nanoparticles
图 4 M2e-HA2自组装纳米颗粒免疫血清学验证
a:变性western blot检测M2e-HA2纯化产物,使用M2e-HA2二免小鼠血清1∶200稀释作为一抗,大小在48.355 kD;b:非变性western blot检测M2e-HA2纯化产物,使用M2e-HA2二免小鼠血清1∶200稀释作为一抗,大小在180 kD以上;c:ELISA检测M2e-HA2二免小鼠血清中特异性抗体水平。分别使用人工合成的M2e多肽片段和HA2多肽片段孵育酶标板检测血清中抗体水平,平均血清稀释度分别为1∶1 066.667 和 1∶1 333.333。
Figure 4. Immune serological validation of M2e-HA2 self-assembled nanoparticles
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