The Expression of C/EBPδ in Colorectal Cancer and Its Effect on the Proliferation of Cancer Cells
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摘要:
目的 研究C/EBPδ在结直肠癌中的表达情况及其对结直肠癌细胞增殖能力的影响和相关机制。 方法 选取2017年至2018年于云南省第二人民医院行结肠癌根治术的40例患者的肠癌组织以及对应的癌旁组织和正常肠组织，采用免疫组织化学法检测组织中的C/EBPδ蛋白质表达情况。采用免疫共沉淀方法检测结直肠癌组织中C/EBPδ与Siah2的相互作用。构建C/EBPδ过表达及干扰的病毒载体，分别感染结直肠癌Caco-2细胞，通过CCK8、流式细胞仪检测、平板克隆形成实验观察C/EBPδ过表达和干扰对细胞增殖、凋亡及周期的影响。采用卡方检验对阳性表达率相关因素进行统计学分析。 结果 （1）从正常肠组织到癌旁组织再到结直肠癌组织中C/EBPδ的表达依次升高，差异均有统计学意义（P < 0.05），C/EBPδ蛋白表达量在伴有肝转移的结直肠癌患者中更为显著；（2）C/EBPδ升高的结直肠癌组织中伴有Saih2的升高，但二者没有直接的相互作用；（3）C/EBPδ过表达能显著提高Caco-2细胞的增殖，而C/EBPδ的shRNA干扰使结直肠癌细胞增殖明显减少；（4）与对照组相比，C/EBPδ的shRNA干扰显著抑制了结直肠癌细胞Caco-2细胞的体外迁移和侵袭能力（P < 0.05）。 结论 C/EBPδ在结直肠癌组织中存在异常，过表达的C/EBPδ通过与Saih2 相互作用促进结直肠癌细胞的侵袭和转转，其与结直肠癌的不良预后可能相关。 -
关键词:
- CCAAT增强子结合蛋白 /
- Siah2 /
- 结直肠癌 /
- 肝转移
Abstract:Objective To investigate the expression of C/EBPδ in colorectal cancer and its effect on the proliferation of colorectal cancer cells. Methods The expression of C/EBPδ protein in 40 patients undergoing the radical resection of colon cancer in the Second People’ s Hospital of Yunnan province from 2017 to 2018 was detected by immunohistochemistry. The interaction between C/EBPδ and Siah2 in colorectal cancer tissues was detected by immunoprecipitation. Viral vectors with C/EBPδ overexpression and interference were constructed to infect colorectal cancer caco-2 cells, respectively. The effects of C/EBPδ expression and interference on cell proliferation, apoptosis and cycle were observed through CCK8, flow cytometry detection and plate cloning formation experiments. Chi-square test was used to analyze the correlation factors of positive expression rate. Results Ⅰ The expression of C/EBPδ increased successively from the normal intestinal tissues to paracellular tissues and then to colorectal cancer tissues, and the differences were statistically significant （all P < 0.05）. The expression of C/EBPδ protein was more significant in colorectal cancer patients with liver metastasis; Ⅱ The C/EBPδ increased colorectal cancer tissues were accompanied by the increase of Saih2, and there was an interaction between the two; Ⅲ C/EBPδ overexpression significantly increased the proliferation of caco-2 cells, while the shRNA interference of C/EBP significantly reduced the proliferation of colorectal cancer cells; Ⅳ Compared with the control group, the shRNA interference of C/EBPδ significantly inhibited the in vitro migration and invasion of colorectal cancer cells caco-2. Conclusion C/EBPδ is abnormal in colorectal cancer tissues, and the overexpressed C/EBPδ promotes the invasion and rotation of colorectal cancer cells by interacting with Saih2, which may be related to the poor prognosis of colorectal cancer. -
Key words:
- CCAAT enhancer binding protein /
- Siah2 /
- Colorectal cancer /
- Liver metastasis
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新生儿重症肺炎在床旁超声的监测下发现常合并肺实变[1-2]。新生儿肺实变使患儿处于持续低氧状态、进而影响呼吸循环系统的稳定性，是导致新生儿死亡的重要原因[3-5]。在新生儿重症肺炎的治疗中，氧疗、机械通气，恰当的抗生素的使用等治疗固然占据主导地位，但合适的护理措施也对重症肺炎的恢复起到至关重要的作用[6-8]。在常规的重症肺炎护理中，所有患儿无论肺部病变程度、性质如何，均给以固定时间间隔的翻身、拍背、吸痰等措施，以促进气道分泌物排出[9-10]。但由于新生儿气道清洁能力不足，自主活动能力差，常规护理往往收效甚微[11-12]。因此，为了提高新生儿重症肺炎并肺实变的疗效，需要制定针对不同肺部病变性质的精准护理措施[13]。随着肺脏超声在新生儿领域的广泛应用，该技术为新生儿重症肺炎并肺实变的精准护理提供了一种有效的方法，对缩短病程和提高疗效有重要价值。
1. 资料与方法
1.1 一般资料
选取2021年1月至12月昆明市儿童医院新生儿重症监护室（NICU）收治的60例重症肺炎新生儿为研究对象，该研究获得了昆明市儿童医院伦理委员会的批准（2022-03-130-K01）。纳入标准：新生儿重症肺炎的诊断标准符合第5版《实用新生儿学》中的诊断标准；患儿除咳嗽、鼻塞等呼吸道症状外，合并明显呼吸困难或循环不稳定者定义为重症肺炎[14]。排除标准：（1）伴有先天性疾病；（2）确诊脓毒血症；（3）放弃治疗。采用随机数字法随机分为研究组和对照组2组，每组各30例。研究组男 13 例，女 17例；年龄中位数1.5（8.0，18.5 ） d；体重中位数3.2（2.6，3.8 ）kg；胎龄中位数38.5（36.8，40.3）周；剖宫产14例，阴道分娩16例；均有咳嗽咳痰等呼吸道症状，其中机械通气者12例（40%），普通吸氧者18例（60%）。 对照组患儿男 12例，女18例；年龄中位数11（ 8.0，21.3） d；体重中位数3.0（ 2.5，3.7） kg；胎龄中位数39（37，40）周；剖宫产 10例，阴道分娩 20例；均有咳嗽咳痰等呼吸道症状，其中机械通气者10例（30%），普通吸氧者20例（70%）。2组一般资料差异无统计学意义（P > 0.05），见 表1。
表 1 一般资料比较[M（P25，P75）/n（%）]Table 1. Comparison of general information [M（P25，P75）/n（%）]组别 胎龄（周） 日龄（d） 体重（kg） 咳嗽 腹胀 心衰 休克 中毒性脑病 机械通气 研究组 38.5（36.8，40.3） 11.5
（8.0，18.5 ）3.2
（2.6，3.8 ）30
（100）6（20） 10（30） 13（43） 2（7） 18（60） 对照组 39
（37，40）11
（ 8.0，21.3）3.0
（ 2.5，3.7）30
（100）8（27） 12（40 11（37） 1（3） 20（66） Z/χ2 −0.630 −0.220 −0.430 0.570 0.640 0.490 0.680 P 0.530 0.824 0.667 0.678 0.584 0.801 0.433 1.2 研究方法
2组患儿均采取普通吸氧或机械通气、抗感染、雾化、维持循环系统稳定等常规治疗。对照组给予常规护理干预：（1）基础护理: 保持病房清洁、常规口、脐、臀、皮肤护理，发热者及时降温处理，施与袋鼠式护理；（2）呼吸道护理：定时翻身、拍背、根据痰多少给予相应频次的吸痰。
研究组在对照组常规护理的基础上，每天使用床旁超声检查肺脏2～4次，根据超声发现采取不同护理干预措施，具体如下：（1）超声提示肺实变征象，见图1：实变面积较大时予纤维支气管镜下或气管插管下肺泡灌洗术；实变局限于胸膜线下，呈虫蚀样改变时以叩背、机械振动、手法震颤以及吸痰为主，根据严重程度选择一种或多种方式进行排痰，扣背、机械振动、手法震颤等措施位置主要为实变区域，并将患儿体位管理为实变对侧卧位为主。（2）超声提示肺间质综合征征象，见图2：予固定时间翻身，不常规行拍背吸痰。
1.3 观察指标
（1）接受机械通气的患儿撤离呼吸机的时间；（2）接受普通给氧的患儿停氧的时间；（3）咳嗽咳痰、肺部啰音、少吃少动症状体征消失的时间；（4）住院时间。
1.4 统计学处理
应用SPSS 22.0统计软件，计量资料中，对于符合正态分布的数据采用（ $\bar x \pm s $）表示，2组间用独立样本t 检验进行比较；对于不符合正态分布的数据采用中位数和四分位间距即M（P25，P75）表示，2组间采用非参数秩和检验（Wilcoxon’s signed rank）比较。计数资料以n（%）表示，行χ2检验，P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 2组超声图像比较
超声下，对照组与研究组均显示肺炎征象，包括胸膜线下虫蚀样改变、实变位置深、至少累及2个肋间，胸腔积液、肺不张和支气管充液征，且以累及2个以上肋间以上的深度实变为主，多合并胸腔积液和肺不张，提示重症肺炎的患儿肺脏感染重，渗出液多，存在因炎性分泌物导致的中小气道堵塞。2组超声图像特征均差异无统计学意义（P > 0.05），见 表2。
表 2 2组超声图像比较[n（%）]Table 2. Comparison of two groups of ultrasound images [n（%）]组别 实变范围 胸腔积液 肺不张 支气管
充液征虫蚀样 深，累及2个及
以上肋间对照组 8（27） 22（73） 19（63） 5（17） 30（100） 研究组 6（20） 24（80） 22（73） 4（13） 30（100） χ2 0.740 0.834 0.830 0.670 P 0.564 0.681 0.632 0.547 2.2 2组临床症状缓解时间及住院时间比较
研究组咳嗽咳痰、肺部啰音、少吃少动症状消失的时间中位数分别为8（6.5，10.0）d及（4.5，10.0）d，住院时间中位数10（8.0，11.0）d；对照组咳嗽咳痰、肺部啰音、少吃少动症状消失的时间中位数分别为11（10.0，12.3）d及15（7.0，18.0）d，住院时间中位数14（12.0，15.3）d。研究组患儿咳嗽咳痰、肺部啰音消、少吃少动消失时间及住院时间均较对照组缩短（P < 0.05），见 表3。
表 3 2组临床征象缓解时间及住院时间比较[M（P25，P75），d]Table 3. Comparison of clinical remission time and hospitalization time between two groups [M（P25，P75），d]组别 临床症状消失 住院时间 咳嗽咳痰 肺部啰音 少吃少动 腹胀 心衰 休克 研究组 8
（6.5，10.0）4
（3.5，11.07
（4.5，10）3（1，5） 2（1，4） 3（1.5，5） 10（8.0，11.0） 对照组 11
（10.0，12.3）10
（9，13）15
（7，18）7（13，9） 5（2，7） 4（2，6） 14（12.0，15.3） Z −4.642 11.031 8.983 9.043 10.031 9.532 −5.642 P < 0.001* < 0.001* < 0.001* < 0.001* < 0.001* < 0.001* < 0.001* *P < 0.05。 2.3 2组撤离呼吸机或停氧时间比较
研究组撤离呼吸机时间中位数为5（4.0，6.3）d，停氧时间中位数7（5.1，9.5）d；对照组撤离呼吸机时间中位数为8（6.0，9.3）d，停氧时间中位数10（8.0，12）d。研究组患儿撤离呼吸机或停氧时间均较对照组短（P < 0.05） ，见 表4。
表 4 2组撤离呼吸机或停氧时间比较[M（P25，P75），d]Table 4. Comparison of extubation time or deaeration time between two groups [M（P25，P75），d]组别 撤离呼吸机 停氧 研究组 5（4.0，6.3） 7（5.1，9.5） 对照组 8（6.0，9.3） 10（8.0，12） Z −4.812 −4.674 P < 0.001* < 0.001* *P < 0.05。 3. 讨论
3.1 新生儿肺实变的特点
新生儿肺实变好发部位与成人和儿童有很大差别 很少有报道新生儿肺实变的好发部位，成人和儿童重症肺炎时发生肺实变常见部位为肺下段，但新生儿发生肺实变的常见部位为脊柱两侧以及肩甲骨区域部位[15]。分析发现与体位有关，成人和儿童当患重症肺炎时，卧床期间，肺下段处于低位，而新生儿卧床期间，一般下肢处于卷曲状态，导致身体处于低位的部位为后备及胸廓段，由于重力的原因，痰液集聚在处于低位的肺段处，故存在新生儿肺实变的区域与成人和儿童不同。
3.2 超声引导精准护理治疗肺实变的价值
新生儿肺实变隐匿且治疗困难 新生儿实变区域多数在脊柱两侧及肩胛骨区域，床旁X-线片很难发现脊柱两侧细小的实变区，但在B超下能明显显示实变[16]。且该区域被骨组织覆盖，在治疗时考虑到施力后导致骨折的原因，导致在进行扣背、手法震颤等护理措施时力度不敢过大，加之震颤的穿透力在透过骨组织时会被大大的削弱，导致治疗效果相对差[17-19]。故发生在新生儿脊柱两侧及肩甲骨区域的肺实变精准护理的时间相对长方能有效。
3.3 体位管理在新生儿肺实变精准护理中的价值
体位引流与儿童及成人差异较大 儿童和成年人建立翻身卡能明确左、右侧卧位以及俯卧位，这类人群能自主维持相应的体位；但新生儿除了俯卧有明确的更换体位外，达到完全的侧卧极为困难，新生儿不能自主维持任何体位，当新生儿处于俯卧位时，如果体位摆放不规范，可能会有“婴儿猝死综合征”的危险[20]。当新生儿摆放侧卧位时，因为新生儿本身处于卷曲状态，侧卧位不能完全实现，导致体位引流效果不如成人及儿童，所以在施以新生儿体位管理时，需要有相应的辅助支撑的用具方能提高体位管理的效果。
床旁肺脏超声在新生儿肺实变临床诊断上有非常大的敏感性[21]。精准化护理措施在超声动态监视下能动态监测肺实变的治疗效果，但在精准化护理措施实施过程中，医护协助极为重要，且治疗过程中力度的掌握、病情的监护极为重要。
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图 1 免疫组化检测CRC癌组织、对应癌旁组织和正常肠组织中C/EBPδ的表达（×400）
A：CRC组织中C/EBPδ的表达；B：癌旁组织中C/EBPδ的表达；C：正常肠组织中C/EBPδ的表达。
Figure 1. Immunohistochemical detection of C/EBPδ expression in CRC cancer tissues，corresponding adjacent tissues and normal intestinal tissues
图 2 免疫组化检测CRC癌组织、对应癌旁组织和正常肠组织中Siah2的表达（×400）
A：CRC组织中Siah2的表达；B：癌旁组织中Siah2的表达；C：正常肠组织中Siah2的表达。
Figure 2. Immunohistochemical detection of Siah2 expression in CRC cancer tissues，corresponding adjacent tissues and normal intestinal tissues
图 3 免疫共沉淀检测C/EBPδ与Siah2在结直肠癌组织中的表达及相互作用
Figure 3. Co-immunoprecipitation to detect the expression and interaction of C/EBPδ and Siah2 in colorectal cancer
图 4 流式检测C/EBPδ过表达和干扰对细胞凋亡的影响
A：正常对照组；B：C/EBPδ干扰组；C：C/EBPδ过表达组。注：Q1-UL：坏死细胞；Q1-UR：晚期凋亡细胞；Q1-LR：早期凋亡；Q1-LL：未发生凋亡的细胞计算细胞凋亡率，选择Q1-UR与Q1-LR象限百分率的和。
Figure 4. Flow cytometric detection of the effect of C/EBPδ overexpression and interference on cell apoptosis
图 5 平板克隆形成实验观察C/EBPδ过表达和干扰对细胞增殖的影响
全局图（10×）（A：正常对照组；B：干扰空载转染组；C：干扰转染组；D：过表达空载转染组；E：过表达转染组）；显微镜下图（40×）（a：正常对照组；b：干扰空载转染组；c：干扰转染组；d：过表达空载转染组；e：过表达转染组）
Figure 5. Plate clone formation experiment to observe the effect of C/EBPδ overexpression and interference on cell proliferation
表 1 C/EBPδ与Siah2在不同组织中阳性率比较n（%）
Table 1. Comparison of positive rates of C/EBPδ and Siah2 in different tissues n（%）
组织 C/EBPδ Siah2 χ2 P 癌组织（n = 40） 33（82.5） 30（75.0） - 0.375 癌旁组织（n = 40） 17（42.5） 10（25.0） - 0.065 正常组织（n = 40） 2（5.0） 1（2.5） - 1.000 χ2 99.798 112.670 P < 0.001 < 0.001 
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表 2 C/EBPδ在CRC患者癌组织中的表达与临床病例特征的关系
Table 2. The relationship between the expression of C/EBPδ in CRC and the characteristics of clinical cases
临床病理参数 例数 阳性n（%） χ2 P 性别 男 19 17（89.5） 女 21 16（76.2） 0.473 0.492 年龄（岁） > 60 20 18（90.0） ≤60 20 15（75.0） 0.693 0.405 TNM分期 1期 20 13（65.0） 2～4期 20 20（100.0） 6.234 0.013 伴肝转移 是 17 17（100.0） 否 23 16（75.0） 4.341 0.037 肿块大小 ≥2 cm 18 16（88.9） < 2 cm 22 17（77.3） 0.296 0.587
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表 3 CCK8检测C/EBPδ过表达和干扰对细胞增殖的影响
Table 3. CCK8 detects the effect of C/EBPδ overexpression and interference on cell proliferation
实验分组 平均OD值 绝对OD值 细胞活力（%） 空白孔 0.0416 正常对照组 1.0784 1.0368 100.00 过表达空载转染组 1.0614 1.0198 98.36 C/EBPδ干扰慢病毒转染组 0.9523 0.9107 87.84 干扰空载慢病毒转染组 1.0476 1.0060 97.03 C/EBPδ过表达病毒转染组 1.2518 1.2102 116.72
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