Effects of Silencing RND3 Expression on the Inflammatory Response and Apoptosis of Hippocampal Neurons Injured by Oxygen Glucose Deprivation/Reoxygenation
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摘要:
目的 探讨沉默Rho家族GTP酶3（RND3）表达对氧糖缺失/复氧复糖（OGD/R）损伤海马神经细胞炎症反应和细胞凋亡的影响。 方法 使用包有沉默RND3表达的短发夹RNA（shRND3）及其阴性对照（shRND3-NC）序列的慢病毒载体分别对海马神经细胞进行转染。转染成功后对细胞进行2 h的缺氧缺糖培养再行复氧复糖建立OGD/R模型。CCK-8法检测细胞活力，RT-qPCR检测RND3及炎症和凋亡相关分子的mRNA表达，Elisa检测细胞上清液中炎症因子的浓度，Western Blot检测RND3和凋亡蛋白以及胞核内NF-κB的蛋白表达，Annexin V-FITC / PI染色和流式细胞仪检测细胞的凋亡率。 结果 与正常细胞相比，OGD/R损伤后细胞活力降低（P < 0.001），炎症因子（TNF-α、IL-6和IL-1β）和NF-κB表达升高（P < 0.001），促凋亡蛋白（Caspase-3和Bax）表达升高（P < 0.001），抗凋亡蛋白（Bcl-2）表达降低（P < 0.001），细胞的凋亡率升高（P < 0.001）。与沉默RND3阴性组相比，沉默RND3后，细胞活力增加（P < 0.01），炎症因子（TNF-α、IL-6和IL-1β）和NF-κB表达降低（P < 0.001），促凋亡蛋白（Caspase-3和Bax）表达降低（P < 0.001），抗凋亡蛋白（Bcl-2）表达升高（P < 0.001），细胞的凋亡率下降（P < 0.001）。 结论 沉默RND3表达通过抑制炎症反应和细胞凋亡减轻海马神经细胞的OGD/R损伤，沉默RND3抑制炎症反应的机制可能与抑制NF-κB通路有关。 -
关键词:
- Rho家族GTP酶3 /
- 氧糖缺失/复氧复糖 /
- 炎症反应 /
- 细胞凋亡 /
- NF-κB通路
Abstract:Objective To investigate the protective effect of silencing Rho family GTPase3 （RND3） expression against oxygen glucose deprivation/reoxygenation （OGD/R） injury in hippocampal neurons via inhibiting inflammation and apoptosis and its mechanism. Methods The OGD/R model was established after transfecting cells with lentiviral vectors containing the short hairpin RNA of silencing RND3 gene expression （shRND3） and its negative control （shRND3-NC） sequence. CCK-8 assay was used to detect cell viability. RT-qPCR was used to detect the gene expression of RND3 and inflammation-related and apoptotic molecules. ELISA was used to detect the protein concentration of inflammatory factors in the supernatant of cell culture. Western blot was used to detect the protein expression of RND3, apoptotic proteins and NF-κB of cell nucleus.Cell apoptosis rate was determined by Annexin V-FITC/PI staining and flow cytometry. Results Compared with normal cells, the cell viability was decreased after OGD/R injury, the expression of inflammatory factors and NF-κB was increased, the expression of pro-apoptotic proteins was increased, the expression of anti-apoptotic proteins was decreased, and the apoptosis rate of cells was increased. While compared with the negative RND3 silencing group, the cell viability was increased, the expression of inflammatory factors and NF-κB were decreased, the expression of pro-apoptotic protein was decreased, the expression of anti-apoptotic protein was increased, and the apoptosis rate of cells was decreased. Conclusion Silencing RND3 alleviates OGD/R injury in hippocampal neurons via inhibiting inflammatory response and apoptosis and the mechanism of inhibiting the inflammatory response by silencing RND3 may be related to the inhibition of NF-κB pathway. -
脑缺血再灌注损伤是继发于缺血性脑卒中的一种严重的脑组织损伤，往往对患者的神经功能造成不可逆的损害[1]。炎症反应和细胞凋亡被认为是脑缺血再灌注早期加重神经细胞损伤的主要因素[2-3]。研究发现，抑制炎症反应和细胞凋亡能减轻脑缺血再灌注损伤[4-5]。Rho家族GTP酶3（Rho family GTPase 3，RND3），也被称为RhoE，是一种小GTP结合蛋白，在中枢神经系统能大量表达[6]。近年研究发现，RND3能以一种依赖于细胞类型和微环境的方式促进细胞凋亡，此外，RND3的高表达还能激活炎症相关信号通路，加重神经系统的炎症反应[7-8]。然而，在脑缺血再灌注损伤方面有关RND3的相关作用研究未见报道，并且机制尚未阐明。本研究通过氧糖缺失/复氧复糖（oxygen glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R）损伤的海马神经细胞模型，体外模拟脑缺血再灌注损伤病理状态，探讨沉默RND3表达对OGD/R损伤海马神经细胞炎症反应和细胞凋亡的影响及其可能的作用机制，为临床治疗脑缺血再灌注损伤提供理论依据和参考。
1. 材料与方法
1.1 实验方法
1.1.1 海马神经细胞原代培养与鉴定
根据文献报道[9]的方法，对新生SD大鼠海马神经细胞进行原代培养。将获取的新生大鼠海马组织置入0.25%的胰蛋白酶-EDTA溶液中进行充分消化并离心后得到海马神经细胞。细胞附着后，在添加了谷氨酰胺和2% B-27（含葡萄糖，4.5 g/L）的神经基础培养基（Thermo Fisher Scientific公司，美国）中培养7 d。之后，在添加了15 mM葡萄糖、5%胎牛血清（Sigma-Aldrich公司，德国）和5%FBS的培养基中继续培养14 d，培养箱环境为95%空气+5% CO2，温度37 ℃。制作细胞爬片后采用NeuN免疫组化染色进行鉴定并用于后续实验。
1.1.2 慢病毒转染
利用Ploybrene慢病毒（上海吉凯基因科技有限公司，中国），参照说明书对海马神经细胞进行转染。将包装有沉默RND3表达的短发夹RNA序列（shRND3）及其阴性对照序列（shRND3-NC）的慢病毒转染入细胞，序列：shRND3：GGCAGACTCCTGTGTCATA，shRND3-NC：ACAGAAGCGATTGTTGATC（广州复能基因有限公司，中国），转染24 h后于荧光显微镜下观察细胞荧光，检测转染效率。
1.1.3 氧糖缺失/复氧复糖（OGD/R）模型的制备
根据文献报道[10]的方法，将海马神经细胞接种于无糖培养基，在37 ℃低氧的三气培养箱（1% O2+94% N2+5% CO2）中培养（即氧糖缺失）2 h后将培养基更换为正常培养基，于37 ℃培养箱（95%空气+5%CO2）中继续培养（即复氧复糖）相应时间后，即成功制备OGD/R模型。
1.1.4 实验分组与处理
实验1：采用随机数字表法将细胞分为5组，每组取3个复孔：正常组、复氧复糖3 h、6 h、9 h和12 h组。正常组细胞进行正常培养，复氧复糖3 h、6 h、9 h和12 h组进行2 h的氧糖缺失后分别复氧复糖3 h、6 h、9 h和12 h制备OGD/R模型。实验2：采用随机数字表法将细胞分为4组，每组取3个复孔：正常组、OGD/R组、沉默RND3阴性组和沉默RND3组。正常组细胞进行正常培养；OGD/R组细胞根据相应时间点进行复氧复糖后制备OGD/R模型；沉默RND3阴性组和沉默RND3组分别用包被有shRND3-NC和shRND3序列的Ploybrea慢病毒转染细胞后根据相应时间点复氧复糖后制备OGD/R模型。
1.1.5 CCK-8检测细胞活力
海马神经细胞以10×103/孔的密度接种到96孔板，37 ℃培养过夜。次日，每孔加入预制的CCK-8溶液（10 μL /孔，同仁株式会社，日本），37 ℃孵育1 h。另取6孔未接种细胞的空白孔加入100 μL无糖基础培养基作为空白组。用酶标仪（BioTek公司，美国）测量实验2各组细胞450 nm处的光密度值后计算各组细胞的细胞活力。
1.1.6 RT-qPCR检测OGD/R不同时刻RND3及炎症因子和凋亡蛋白的mRNA表达
检测实验1各组细胞RND3的mRNA相对表达量，并选择表达差异最大的时间点作为实验2的复氧复糖时间点，然后按照实验2的分组检测各组细胞RND3、炎症相关因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）、NF-κB（p65）和凋亡相关蛋白分子（Caspase-3、Bax、Bcl-2）mRNA的相对表达量。使用Trizol法提取细胞总RNA，分光光度法测量RNA的浓度后-80 ℃冰箱保存备用。取1 μg RNA根据mRNA逆转录试剂盒（广州复能基因有限公司，中国）的说明书进行逆转录反应合成模板cDNA，然后进行qPCR扩增和检测。反应体系为：模板cDNA 4 μL，5X BlazeTaq qPCR Mix 2 μL，上下游引物各0.5 μL，双蒸水3 μL。反应条件为：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性10 s，退火60 ℃ 20 s和延伸72 ℃ 10 s，设置40个循环，以GADPH为内参，用2-△△Ct方法，计算各mRNA的相对表达量。所使用的引物序列，见表1。
表 1 引物序列Table 1. The primer sequences基因名称 上游引物序列（5′-3′） 下游引物序列（5′-3′） RND3 GCAAGATAGTAGTGGTGGGCG TCTGGGTAAGAGAGGGGACGG TNF-α CTCCTCACCCACACCGTCAG GAGCAGGTCCCCCTTCTCCA IL-1β TACAGTGGCAATGAGGATGAC CAAAGATGAAGGGAAAGAAGG IL-6 TTCGGTCCAGTTGCCTTCTC GTGCCTCTTTGCTGCTTTCA Caspase-3 CGGGCAAGCCAGATGTTTAT CAGCTCCGACTCTCCGAGAA Bax CCTTTTTGCTACAGGGTTTC TGTTGTTGTCCAGTTCATCG Bcl-2 GAGGGGCTACGAGTGGGATAC TCAGGCTGGAAGGAGAAGATG GAPDH CAAGTTCAACGGCACAGTCAAGG ACATACTCAGCACCAGCATCACC 1.1.7 ELISA检测细胞上清液中炎症因子的浓度
采用ELISA法，根据制造商的说明，使用商用TNF-α，IL-1β和IL-6的ELISA试剂盒（深圳欣博盛生物科技有限公司，中国）检测实验2各组细胞上清液中炎症相关因子TNF-α，IL-1β和IL-6的蛋白浓度。在450 nm处立即用酶标仪（Bioteck公司，美国）测定特异性结合光密度，利用标准品OD450拟合标准曲线，计算目标蛋白浓度。
1.1.8 Western Blot检测凋亡蛋白和胞核NF-κB（p65）蛋白的表达
按照实验2的分组，各组细胞中加入适量RIPA裂解液，于冰上充分裂解后取上清，用BCA法测定蛋白浓度。利用细胞浆与细胞核蛋白抽提试剂（上海碧云天生物技术有限公司，中国），按照说明步骤分离提取细胞核蛋白。在SDS-PAGE凝胶系统中电泳，进行转膜后，用5%的脱脂奶粉封闭2 h后加入一抗Cleaved-caspase-3（C-caspase-3，CST公司，美国）（浓度1∶1000）、Bax（Abcam公司，美国）（浓度1∶1000）、Bcl-2（GeneTex公司，美国）（浓度1∶1000）、p65（Abcam公司，美国）（浓度1∶500），4 ℃过夜。TBST洗膜后，加入二抗（Sigma公司，美国）（浓度1∶5000），室温孵育2 h，ECL显影。于凝胶成像仪（BIO-RAD公司，美国）采集图像信息，得到各蛋白及内参β-actin和Histone的灰度图像。
1.1.9 Annexin V-FITC / PI+流式细胞仪检测细胞凋亡
采用Annexin V-FITC凋亡试剂盒（556547，BD，美国）检测细胞凋亡。收集大约1×105个细胞，加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI进行双重染色，轻轻混匀细胞后，置于室温避光反应15 min。添加400 μl的1X Binding Buffer，在流式细胞仪（Millipore公司，美国）上进行检测。
1.2 统计学处理
采用SPSS22.0统计软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差表示，不同组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较进一步采用事后LSD检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 海马神经细胞的形态与鉴定
在显微镜下观察得到海马神经细胞的典型形态见图1A。NeuN染色呈阳性，见图1B，证实海马神经细胞原代培养成功。
图 1 海马神经细胞的形态与鉴定A：海马神经细胞典型形态（×200）；B：海马神经细胞NeuN染色（比例尺：50 μm）。Figure 1. Morphology and identification of hippocampal neurons2.2 OGD/R后不同时刻海马神经细胞中RND3 mRNA的表达
与正常组相比，复氧复糖3 h组RND3 mRNA的表达量无明显变化（P > 0.05），复氧复糖6 h、9 h和12 h组RND3 mRNA的表达量均显著升高（P < 0.05）。组间比较时，复氧复糖12 h组RND3 mRNA的表达量最高（P < 0.05）。因此，后续实验2中选择OGD/R后12 h时间点进行研究，见图2。
图 2 OGD/R后不同时刻海马神经细胞中RND3 mRNA的表达量与正常组相比，*P < 0.05；与复氧复糖6 h组相比，#P < 0.05；与复氧复糖9 h组相比，&P < 0.05。Figure 2. mRNA expression of RND3 in hippocampal neurons at different times after OGD/R2.3 沉默RND3对OGD/R损伤海马神经细胞RND3的表达和细胞活力的影响
与正常组相比，OGD/R组RND3的mRNA和蛋白表达量均显著升高（P < 0.001）；与沉默RND3阴性组相比，沉默RND3组RND3的mRNA和蛋白表达量均显著降低（P < 0.001），见图3A。与正常组相比，OGD/R组细胞活力显著下降（P < 0.001）；与沉默RND3阴性组相比，沉默RND3组细胞活力显著升高（P < 0.01），见图3B。
图 3 沉默RND3对OGD/R损伤海马神经细胞RND3 mRNA表达和细胞活力的影响A：各组细胞RND的mRNA表达量；B：各组细胞的细胞活力；与正常组相比，***P < 0.001；与沉默RND3阴性组相比，##P < 0.01，###P < 0.001。Figure 3. Effects of RND3 silencing on RND3 mRNA expression and cell viability of OGD/ R-injured hippocampal neurons2.4 沉默RND3对OGD/R损伤海马神经细胞炎症因子表达的影响
与正常组相比，OGD/R组炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表达量均显著升高（P < 0.001）；与沉默RND3阴性组相比，沉默RND3组TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表达量均显著降低（P < 0.001），见图4A。细胞上清液中，与正常组相比，OGD/R组炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6的蛋白浓度均显著升高（P < 0.001）；与沉默RND3阴性组相比，沉默RND3组TNF-α、IL-1β和IL-6的蛋白浓度均显著降低（P < 0.001），见图4B。
图 4 沉默RND3对OGD/R损伤海马神经细胞炎症因子表达的影响A：各组细胞炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表达量；B：各组细胞上清液中炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6的蛋白浓度；与正常组相比，***P < 0.001；与沉默RND3阴性组相比，###P < 0.001。Figure 4. The effect of silencing RND3 on the expression of inflammatory cytokines in OGD/R injured hippocampal neurons2.5 沉默RND3对OGD/R损伤海马神经细胞凋亡的影响
与正常组相比，OGD/R组促凋亡蛋白Caspase-3和Bax的mRNA表达量、C-caspase-3和Bax蛋白表达量均显著升高（P < 0.001）；与沉默RND3阴性组相比，沉默RND3组Caspase-3和Bax的mRNA表达量、C-caspase-3和Bax蛋白表达量均显著降低（P < 0.001）；与正常组相比，OGD/R组抗凋亡蛋白Bcl-2的mRNA和蛋白的表达量均显著降低（P < 0.001）；与沉默RND3阴性组相比，沉默RND3组Bcl-2的mRNA和蛋白表达量均显著升高（P < 0.001），见图5A、5B、5C。与正常组相比，OGD/R组细胞凋亡率显著升高（P < 0.001）；与沉默RND3阴性组相比，沉默RND3组细胞凋亡率显著下降（P < 0.001），见图5D、5E。
图 5 沉默RND3对OGD/R损伤海马神经元RND3蛋白表达和细胞凋亡的影响A：各组细胞促凋亡蛋白Caspase-3、Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2的mRNA相对表达量；B：各组细胞RND3蛋白，促凋亡蛋白C-caspase-3、Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2的蛋白表达条带；C：各组细胞RND3蛋白，促凋亡蛋白C-caspase-3、Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2的蛋白相对表达量；D：Annexin V-FITC / PI+流式细胞仪检测细胞凋亡；E：各组细胞的细胞凋亡率；与正常组相比，**P < 0.01，***P < 0.001；与沉默RND3阴性组相比，##P < 0.01，###P < 0.001。Figure 5. Effects of silencing RND3 on RND3 protein expression and apoptosis in OGD/ R-injured hippocampal neurons2.6 沉默RND3对OGD/R损伤海马神经细胞NF-κB（p65）表达的影响
与正常组相比，OGD/R组NF-κB（p65）mRNA表达量和胞核内NF-κB（p65）蛋白表达量均显著升高（P < 0.001）；与沉默RND3阴性组相比，沉默RND3组NF-κB（p65）mRNA表达量和胞核内NF-κB（p65）蛋白表达量均显著降低（P < 0.001），见图6A、6B。
图 6 沉默RND3对OGD/R损伤海马神经元NF-κB（p65）表达的影响A：各组细胞NF-κB（p65）mRNA表达量；B：各组细胞胞核内NF-κB（p65）的蛋白表达量；与正常组比较，***P < 0.001；与沉默RND3阴性组比较，###P < 0.001。Figure 6. Effect of silencing RND3 on expression of NF-κB（p65）in OGD/ R-injured hippocampal neurons3. 讨论
脑缺血再灌注损伤加重了缺血性脑卒中患者的神经功能损伤，经常给患者带来不良的临床结局，目前有效的防治策略依然十分有限。氧糖缺失/复氧复糖（OGD/R）的细胞模型已被证实是可靠的模拟脑缺血再灌注损伤的体外模型，常被用于脑缺血再灌注损伤机制及治疗策略的实验研究[11-12]。本研究发现，海马神经元OGD/R损伤后，细胞的活力显著下降，同时，炎症因子的表达显著升高，细胞凋亡增加，这与以往的相关研究结果[13-14]一致，也证实了炎症反应和细胞凋亡对OGD/R所致的神经细胞损伤具有重要的促进作用。因此，尽早对脑缺血再灌注后的炎症反应和细胞凋亡进行有效干预将有望改善脑组织的进一步损伤。
在本研究中，随着神经细胞复氧复糖损伤时间的延长，RND3的基因表达呈上升趋势，表明RND3可能参与了加重神经细胞OGD/R损伤的过程。此外，笔者的结果显示，沉默RND3表达后，海马神经细胞RND3的表达显著降低，同时，细胞的活力显著增加，表明沉默RND3表达具有改善海马神经元OGD/R损伤的作用。神经炎症在脑缺血再灌注损伤的机制中起着重要作用，也是造成神经细胞不可逆损伤的重要因素之一[15]。TNF-α、IL-1β和IL-6是三种非常重要的促炎细胞因子，其生成的增加进一步加重了神经炎症反应[16]。已有研究表明，乙醇刺激能够使体外培养的星形胶质细胞中RND3的表达上调，进而加重了神经炎症反应[8]。笔者进一步检测炎症因子发现，沉默RND3表达后，TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA和蛋白表达均显著降低，表明沉默RND3在脑缺血再灌注损伤体外模型中也具有抗炎的作用。因此，在中枢神经系统，RND3的高表达可能是神经炎症的启动或促进因素之一。NF-κB通路是介导炎症反应主要的信号通路之一[17-18]。其中，NF-κB（p65）是一种非常重要的转录因子，常以未激活态存在于胞质中，当其由胞质转入胞核后即具有转录活性，会促进某些炎症因子，如TNF-α、IL-1β和IL-6等的表达[19]。已有研究表明，在星形胶质细胞中，RND3受乙醇刺激表达上调后能激活NF-κB通路促进炎症因子的产生[8]。本研究发现，沉默RND3能降低胞核内NF-κB（p65）的表达，说明在OGD/R模型中，沉默RND3抑制炎症反应的机制可能与抑制NF-κB通路有关。
半胱氨酸蛋白酶3（Cysteine protease-3，Caspase-3）是一种促进细胞凋亡的重要蛋白，参与了多条细胞凋亡途径[20]。B细胞淋巴瘤-2（B cell lymphoma-2，Bcl-2）家族蛋白在细胞凋亡的调控过程中也发挥了重要作用，包括抗凋亡蛋白（如Bcl-2和Bcl-XL）和促凋亡蛋白（如Bax和Bak）等[21]。研究表明，RND3的高表达具有促进细胞凋亡的作用[22]。最近的一项研究还表明，RND3基因敲除的小鼠神经细胞的凋亡率显著降低[23]。本研究发现，在OGD/R模型中，沉默RND3表达后，海马神经细胞的凋亡率显著下降，促凋亡蛋白C-caspase-3和Bax的表达降低，抗凋亡蛋白Bcl-2的表达升高。因此，沉默RND3减轻海马神经细胞OGD/R损伤的作用与抑制细胞凋亡有关。
综上所述，本研究表明沉默RND3表达通过抑制炎症反应和细胞凋亡减轻海马神经元的OGD/R损伤，沉默RND3抑制炎症反应的机制可能与抑制NF-κB通路有关。
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图 1 海马神经细胞的形态与鉴定
A：海马神经细胞典型形态（×200）；B：海马神经细胞NeuN染色（比例尺：50 μm）。
Figure 1. Morphology and identification of hippocampal neurons
图 2 OGD/R后不同时刻海马神经细胞中RND3 mRNA的表达量
与正常组相比，*P < 0.05；与复氧复糖6 h组相比，#P < 0.05；与复氧复糖9 h组相比，&P < 0.05。
Figure 2. mRNA expression of RND3 in hippocampal neurons at different times after OGD/R
图 3 沉默RND3对OGD/R损伤海马神经细胞RND3 mRNA表达和细胞活力的影响
A：各组细胞RND的mRNA表达量；B：各组细胞的细胞活力；与正常组相比，***P < 0.001；与沉默RND3阴性组相比，##P < 0.01，###P < 0.001。
Figure 3. Effects of RND3 silencing on RND3 mRNA expression and cell viability of OGD/ R-injured hippocampal neurons
图 4 沉默RND3对OGD/R损伤海马神经细胞炎症因子表达的影响
A：各组细胞炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表达量；B：各组细胞上清液中炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6的蛋白浓度；与正常组相比，***P < 0.001；与沉默RND3阴性组相比，###P < 0.001。
Figure 4. The effect of silencing RND3 on the expression of inflammatory cytokines in OGD/R injured hippocampal neurons
图 5 沉默RND3对OGD/R损伤海马神经元RND3蛋白表达和细胞凋亡的影响
A：各组细胞促凋亡蛋白Caspase-3、Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2的mRNA相对表达量；B：各组细胞RND3蛋白，促凋亡蛋白C-caspase-3、Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2的蛋白表达条带；C：各组细胞RND3蛋白，促凋亡蛋白C-caspase-3、Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2的蛋白相对表达量；D：Annexin V-FITC / PI+流式细胞仪检测细胞凋亡；E：各组细胞的细胞凋亡率；与正常组相比，**P < 0.01，***P < 0.001；与沉默RND3阴性组相比，##P < 0.01，###P < 0.001。
Figure 5. Effects of silencing RND3 on RND3 protein expression and apoptosis in OGD/ R-injured hippocampal neurons
图 6 沉默RND3对OGD/R损伤海马神经元NF-κB（p65）表达的影响
A：各组细胞NF-κB（p65）mRNA表达量；B：各组细胞胞核内NF-κB（p65）的蛋白表达量；与正常组比较，***P < 0.001；与沉默RND3阴性组比较，###P < 0.001。
Figure 6. Effect of silencing RND3 on expression of NF-κB（p65）in OGD/ R-injured hippocampal neurons
表 1 引物序列
Table 1. The primer sequences
基因名称 上游引物序列（5′-3′） 下游引物序列（5′-3′） RND3 GCAAGATAGTAGTGGTGGGCG TCTGGGTAAGAGAGGGGACGG TNF-α CTCCTCACCCACACCGTCAG GAGCAGGTCCCCCTTCTCCA IL-1β TACAGTGGCAATGAGGATGAC CAAAGATGAAGGGAAAGAAGG IL-6 TTCGGTCCAGTTGCCTTCTC GTGCCTCTTTGCTGCTTTCA Caspase-3 CGGGCAAGCCAGATGTTTAT CAGCTCCGACTCTCCGAGAA Bax CCTTTTTGCTACAGGGTTTC TGTTGTTGTCCAGTTCATCG Bcl-2 GAGGGGCTACGAGTGGGATAC TCAGGCTGGAAGGAGAAGATG GAPDH CAAGTTCAACGGCACAGTCAAGG ACATACTCAGCACCAGCATCACC 
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