Expression and Significance of Plasma miR-1181 in Patients with Type 2 Diabetes Mellitus
-
摘要:
目的 miRNA可作为预测糖尿病发生和发展的生物标志物，探索miR-1181在2型糖尿病（Type 2 Diabetes Mellitus，T2DM)患者的表达情况。 方法 运用Agilent miRNA芯片对T2DM患者（n = 5）和正常对照组（n = 5）血浆样本进行差异筛选，荧光定量PCR技术（quantitative Real Time PCR，qRT-PCR）验证出差异表达的miRNA；通过生物信息学方法预测其靶基因并绘制miRNA-靶基因-代谢通路关系网络图，扩大样本检测血浆中差异表达的miRNA：miR-1181和靶基因MAP2K2、MAPK12表达水平。 结果 miRNA芯片筛选和qRT-PCR验证出与T2DM相关的差异表达miRNA：miR-1181，生物信息学分析得出miR-1181靶基因有CCND1、PI3KR2、MAP2K2和MAPK12；T2DM患者血浆中 miR-1181的表达水平明显下降（P < 0.001），而靶基因MAPK12 mRNA的表达水平明显升高（P < 0.01）。 结论 2型糖尿病患者血浆miR-1181水平降低，可能与其抑制靶基因MAPK12对MAPK通路影响有关。 Abstract:Objective To verify that miRNA can be used as biomarkers to predict the occurrence and development of diabetes mellitus （DM）, and to explore the expression of miR-1181 in patients with type 2 diabetes mellitus （Type 2 Diabetes Mellitus）. Methods Agilent miRNA chip was used to screen plasma samples from patients with T2DM （n = 5） and normal control group （n = 5）. The differentially expressed miRNA were verified by fluorescence quantitative PCR （qRT-PCR）. The target genes were predicted by bioinformatics methods, and the relationship network diagram of miRNA - target gene - metabolic pathway was drawn. The differentially expressed miRNA: miR-1181, MAP2K2 and MAPK12 in plasma were detected by expanding samples. Results miRNA chip screening and qRT-PCR verified the differentially expressed miRNA associated with T2DM: miR-1181.Bioinformatics analysis showed that the target genes of miR-1181 were CCND1, PI3KR2, MAP2K2 and MAPK12. The expression of miR-1181 in the plasma of T2DM was significantly decreased （P < 0.001）. While expression of MAPK12 mRNA was increased （P < 0.01）. Conclusion The decrease of plasma miR-1181 in T2DM patients may be related to inhibiting effect of target gene MAPK12 on MAPK pathway. -
Key words:
- miR-1181 /
- Type 2 Diabetes /
- Target Genes /
- MAPK12
-
神经根型颈椎病（cervical spondylotic radiculopathy，CSR）是因颈椎间盘、钩椎关节、关节突关节增生肥大的骨赘向侧方突出，刺激或压迫颈神经根而出现的一系列相应节段的感觉、运动功能障碍的一类疾病，以颈肩部、上肢及手指的麻木、疼痛、无力为主要临床表现。CSR经正规保守治疗后仍有不能忍受的根性疼痛和（或）感觉运动功能受损时，需要手术治疗。目前手术治疗CSR应用最多的术式有前路椎间盘切除椎间融合术（anterior cervical discectomy fusion，ACDF）及后路椎间孔成型术（posterior cervical laminoforaminotomy，PLF）[1]。近期有文献报道，后路手术及前路手术术后短期临床效果相当[2-3]。ACDF手术对颈部软组织破坏小、术后手术部位疼痛少，可以更好地恢复颈椎生理曲度，但存在脊髓、食管、颈部神经损伤及远期邻近融合节段退变加速等问题；PLF手术脊髓损伤风险及颈部其他组织损伤的风险较小，大部分地保留了前方椎间盘及韧带结构、减少邻近节段退变风险，治疗费用较低，但手术对后方肌肉剥离较多、术后容易出现颈部轴性疼痛，手术无法通过椎间隙撑开以减压神经根管等缺点。鉴于此，笔者尝试采用经后路部分侧块切除、神经根管扩大减压联合椎弓根钉固定术治疗单节段CSR。术中部分切除相应节段单侧椎板、关节突，采用单侧椎弓根钉固定适当撑开椎间隙、椎间孔提升椎间孔容积，并防止后方结构破坏带来的不稳，减少术后轴性颈痛的发生，初期观察获得较好临床效果，现报告如下。
1. 资料与方法
1.1 纳入与排除标准
纳入标准[1-3]：（1）退变所致的神经根型颈椎病；（2）存在单节段椎间盘突出或关节突关节退变导致的神经根管狭窄并有单侧相应根性疼痛症状；（3）采用经后路减压单侧椎弓根固定术；（4）保守治疗6个月以上无效。排除标准：（1）伴严重骨质疏松；（2）双侧根性疼痛症状；（3）伴后纵韧带骨化；（4）术前颈椎CT扫描证实颈椎椎弓根细小无置钉条件。
1.2 一般资料
选取2016年1月至2018年12月收治的单节段神经根颈椎病患者共26例。其中，男16例，女10例；年龄39～62岁，平均50.5岁。患者临床表现为颈肩部疼痛伴有单侧上肢的神经根分布区域的疼痛、麻木、感觉过敏，可同时存在肌力障碍或腱反射异常，椎间孔挤压试验、臂丛神经牵拉实验阳性。术前颈椎神经根性疼痛视觉模拟（visual analogue scale，VAS）评分，评分6～8分，平均（6.9±0.8）分，术前颈椎功能残障指数量表（neck disability index，NDI）评分，评分25～39分，平均（32.4±4.3）分。手术节段C6/77例、C5/612例、C4/57例。术前常规行颈椎正侧位X线、CT、MRI检查。
1.3 手术方法
气管插管全身麻醉，患者取俯卧位，面部置于Mayfield托上。根据术前根性疼痛症状范围及影像学检查资料明确责任节段。颈部屈曲，消除颈部生理前屈，后正中切口，显露相应节段单侧椎板及关节突关节。参照Zheng等[4]方法进行椎弓根置钉，具体步骤：C4、C5进钉点定位，侧块侧边缘与上关节突基底下缘3 mm交点；C6进钉点定位，侧块侧边缘与上关节突基底下缘2 mm交点；C7进钉点定位，侧块中份与上关节突基底下缘2 mm交点，进钉点确定后，用高速磨钻磨除进钉点骨皮质，显露椎弓根入口，手钻开道，头尾倾角度参照术中C臂透视，内倾角根据术前CT测量，探查钉道及透视监测位置良好后置入直径3.5 mm，长度18～24 mm万向螺钉。使用超声骨刀切除减压节段单侧椎板，用椎板咬骨钳去除上位椎体的部分下关节突，暴露出下位椎体的上关节突后用磨钻打磨后再行椎板咬骨钳咬除，暴露出神经根后，结合术前颈椎MRI、CT，若同时存在椎间盘突出、钩椎关节增生，用神经剥离子向上轻轻牵开神经根，显露突出的组织，若需要更多的显露，最好切除更多的骨质，避免牵拉神经根，用髓核钳咬除突出的组织。减压完成后使用神经探钩探查确认神经根已彻底减压。塑形矫形棒后植入，适当撑开后锁紧螺帽。冲洗术区，留置橡胶引流管后，逐层关闭切口。
1.4 术后处理
术后密切观察神经功能情况，术后2 d静脉给予甘露醇125 mL每日两次静滴、甲泼尼龙80 mg每日两次静滴，口服镇痛、神经营养药物治疗。术后24 h拔除引流管，同时佩戴颈托保护下地活动。
1.5 评价指标
记录手术时间、术中出血量及手术相关并发症，术后2 d复查颈椎正侧位X线片及颈椎CT，在颈椎侧位X线片上测量病变节段椎间隙高度（disc height，DH）。术后1个月、2个月、3个月、6个月、1 a复查颈椎X线、CT、MRI，测量病变节段DH以评估随访时间内有无椎间隙不稳、塌陷，评估根性疼痛VAS评分、NDI评分，根据患者术后主观感受行Odom分级。
1.6 统计学处理
采用SPSS软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差表示，手术前、后VAS评分、NDI评分比较采用配对t检验；术后2 d及末次随访时间DH值比较采用自身配对t检查，P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
本组26例患者均获得随访，平均随访时间16～25个月，平均（18.1±4.8）个月；平均手术时间60～100 min，平均（76.9±12.8） min；术中出血量70～120 mL，平增多（87.3±14.3） mL。末次随访时根性疼痛VAS评分平均0～3分，平均（1.4±0.6）分（表1），与术前根性疼痛VAS评分比较，差异有统计学意义（P < 0.05）；末次随访时NDI评分平均7～30分，平均（16.3±6.7）分（ 表1），与术前NDI评分比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。术后2 d平均DH为5.1～6.9 mm，平均（5.8±0.6） mm，末次随访时DH为4.9～6.3 mm，平均（5.7±0.4） mm，两者比较，差异无统计学意义（ P > 0.05）。术后颈椎病疗效Odom评级优8例（30.8%），良14例（53.8%），可4例（15.4%），优良率为84.6%。本组病例术中共置入椎弓根螺钉52枚，植置钉时未出现脊髓、神经根及椎动脉损伤情况；术后CT检查见：C 4椎弓根螺钉穿破内壁2枚，C5外壁穿破1枚。随访时间内均未出现感染、内植物松动、C5神经根麻痹等并发症。1例患者术后3个月残留颈肩部乏力、酸胀不适，给予局部理疗，口服乙哌立松片、塞来昔布胶囊2周后好转。典型病例见图1。
表 1 术前、末次随访神经根性疼痛VAS评分、颈部疼痛NDI评分[（$ \bar x \pm s$ ），n = 26]Table 1. VAS score for radiculopathy and NDI score for neck pain before operation and last follow-up[（$ \bar x \pm s$ ），n = 26]指标 术前 末次随访 t P VAS评分 6.9 ± 0.76 1.4 ± 0.9△ 20.6 < 0.05 NDI评分 32.4 ± 4.3 16.3 ± 6.7△ 9.4 < 0.05 与术前比较，△P < 0.05。 
图 1 女，61岁。反复颈肩痛3 a加重伴左手麻木、无力2周入院。诊断：神经根型颈椎病（C6/7）a～e：术前颈椎侧位、过屈过伸位及左右斜位X线片示：颈椎生理屈度变直；C6/7节段失稳，左侧后方钩锥关节处骨赘形成并椎间孔狭窄；f～g：术前颈椎CT、MRI示：C6/7左侧神经根明显受压；h～i：术后2 d颈椎正侧位X线示：颈椎生理曲度恢复正常，C6/7椎间高度及椎弓根钉固定良好；j～n：术后18个月颈椎正侧位X线、二维CT重建及横轴位CT、MRI示：颈椎生理曲度正常，C6/7椎间高度及内固定良好，同术后2 d；C6/7左侧减压充分，神经根管通畅。Figure 1. Female，61 years old. She had repeated neck and shoulder pain for 3 years，and was admitted to hospital for 2 weeks with aggravated left hand numbness and weakness. Diagnosis：Cervical Spondylopathy of Nerve Root Type （C6/7）3. 讨论
CSR选择何种术式治疗主要依据术前致压原因，病变位置、范围，颈椎生理曲度，神经根受压程度及疼痛程度等[5]。手术治疗的目的是：解除受压神经根的压迫，恢复颈椎生理曲度，重建病变节段的局部稳定性[6]。CSR的手术方式主要分为前路手术及后路手术两大类，即ACDF术式及PLF术式。ACDF术式能够较好地重建颈椎的生理曲度，恢复颈椎力线及稳定性。Peolsson等[7]的一项对95例接受ACDF患者的前瞻性研究报道，在平均76个月的随访时间内，症状的缓解率可达90%。Korinth等[8]报道了在平均72个月随访时间内，154例接受ACDF手术的颈椎间盘疾病患者术后优良率达到了93.6%。然而手术疗效取决于颈椎前路减压手术的减压范围，一般认为，横向减压范围需要达到15～18 mm，而神经根自椎管发出后位于钩椎关节侧后方，椎动脉后方，那么横向减压范围过大可能存在椎动脉损伤的风险，如果需要直接解除对神经根的压迫则需要扩大减压范围，需要以横突孔内侧壁为切入点，单椎动脉和横突孔内侧壁厚度仅约3 mm，减压过程中损伤椎动脉风险较大[9-10]。
相对于前路手术，PLF术式通过暴露病变节段的椎板以及关节突关节，切除部分椎板以及部分关节突关节后，可直视下根据神经根受压情况进行适度减压。Koc等[11]认为，后路减压的优势在于直接暴露神经根对其进行减压、保留椎间盘同时保留了节段运动功能、减少融合带来的相关并发症。Korinth等[8]回顾性分析了168例颈椎间盘退变患者接受后路单纯减压术后症状改善优良率为85.8%，并且与154例接受前路手术患者术后的优良率比较差异无统计学意义。虽然后路手术较前路损伤周围组织风险较低，但仍然存在局限，术后因为肌肉剥离、后方结构不稳定引起的轴性颈痛[12]，以及术后随患者年龄增长出现的鹅颈畸形，并且若神经根受压范围较大，需要切除的后方骨性结构较多，单纯减压后可能导致节段不稳。Chang等[13]采用后路椎间孔切开减压的技术治疗了26例单发或多发颈椎椎间孔狭窄导致的神经根型颈椎病患者，分别在26例（76%）和8例（24%）中看到了完全和部分神经根疼痛症状的改变。并且后路减压术式，可以保留更多的小关节和囊膜。因此，前路或后路手术的选择主要取决于影像学检查的表现、患者的症状以及患者的一般情况。若压迫来源于中央偏一侧的软性或硬性椎间盘及骨赘，宜选择前路椎间盘切除椎间融合术；若压迫来源于侧方脱出的椎间盘或椎间孔边缘的骨赘，则宜选择后路椎间孔扩大减压术[3]。
本组病例均为椎间盘向侧方突出、钩椎关节、关节突关节周围骨质增生导致的神经根管狭窄。选择后路手术的原因是：因侧后方的椎间盘突出，钩椎关节侧后方、上关节突内侧缘的骨质增生通过前路的减压，较难达到直接解除神经根管入出口，后方骨赘压迫的目的。并且考虑到单纯内窥镜下后路PLF术中切除范围相对有限，难于彻底减压；术后存在远期节段不稳，轴性疼痛以及椎间隙塌陷的问题[12]。若为了术后的稳定，始终保留超过50%的小关节将导致减压不彻底，特别是在需要进一步增加切除范围的严重的神经根管、椎间孔狭窄病例，为了避免术后颈椎失稳，减压后给与减压节段单边椎弓根内固定。通过适当地对椎间隙的撑开扩大神经根管容积，进一步达到神经根管间接减压的目的。本组病例在手术中采取头高脚低位，控制性降压，可减少术中椎管内静脉丛出血，首先在神经根管入口处用超声骨刀切除上位椎体下关节突，暴露出下位椎体的上关节突后再使用磨钻打磨（务必控制转速、避免失手），用微型椎板咬骨钳辅助咬除上关节突，从而扩大神经根管；用双极电凝沿神经根周围仔细电凝，配合明胶海绵轻柔填塞可减少术野出血。用神经剥离子向上轻柔牵开神经根，用髓核钳咬除突出的前方组织。既达到了彻底直接减压的目的又维持了颈椎的稳定性。术后经过平均（18.1±4.8）个月随访，颈椎生理曲度以及椎间隙高度良好；均未出现继发性的轴性疼痛。
综上所述，经过本组病例随访研究，在严格掌握适应证的前提下，对于椎间盘侧方突出并椎间严重孔狭窄的CSR，经后路单侧减压椎弓钉棒固定是除前路手术外的另一种可选择术式；避免了ACDF术式颈椎前部的重要结构损伤的风险，以及单纯PLF术式后方减压范围受限、远期局部失稳等不足。然而，本研究病例数尚少，仅观察了初期的临床疗效，对该术式的长期临床疗效，有待进一步随访观察。
-
图 1 T2DM组与正常对照组的Agilent miRNA芯片结果
Figure 1. Agilent miRNA microarray results of T2DM group and normal control group
图 2 miR-1181在T2DM组和正常对照组表达水平
A：以cel-miR-39为miR-1181外源性内参的表达水平；B：以U6为miR-1181内源性内参的表达水平。
Figure 2. The expression levels of miR-1181 in T2DM group and normal control group
图 3 miR-1181在T2DM组与和正常对照组ROC 曲线
Figure 3. ROC Curve of miR-1181 in T2DM group and normal control group
图 4 KEGG富集miRNA-靶基因-代谢通路关系网络
注：黄色V代表miRNA，红色方块代表代谢通路，蓝色圆点代表基因。基因和代谢通路越大，表示连接度越高，值得重点关注。miR-1181的靶向作用关系用红线着重标出。
Figure 4. The miRNA Target Gene-Metabolic Pathway Network enriched by KEGG
图 5 miR-1181靶基因MAP2K2预测序列互补图
Figure 5. Complementary map of MAP2K2 prediction sequence of miR-1181 Target Gene
图 6 miR-1181靶基因MAPK12预测序列互补图
Figure 6. Complementary map of MAPK12 prediction sequence of miR-1181 Target Gene
图 7 MAP2K2和MAPK12 mRNA在T2DM组和正常对照组表达
Figure 7. MAP2K2 and MAPK12 mRNA Expressions in T2DM group and normal control group
表 1 qRT-PCR 引物及退火温度列表
Table 1. qRT-PCR Primer and annealing temperature list
引物名称 序列（5′to3′） 退火温度Tm（℃） U6-F CTCGCTTCGGCAGCACATATACT 58 U6 -R ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC cel-miR-39-5p-RT GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTATTAC cel-miR-39-5p-F TGGGAGCTGATTTCGTCTTG 59.7 hsa-mir-1181-RT GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCGGCTC hsa-mir-1181-F AATAACCGTCGCCGCCACCCG 72.5 GAPDH-F: GGTTGTCTCCTGCGACTTCA 58.2 GAPDH-R TGGTCCAGGGTTTCTTACTCC 58.2 MAP2K2-F: CACTATCAACCCTACCATCGC 57.3 MAP2K2-R: CGCTTCCTTTGCTGCTCAT 58.8 MAPK12-F TCTGTCCTGACCAACGCAA 57.6 MAPK12-R AAGGGACTCAAAGTATGGATGG 57.6 
下载: 导出CSV
表 2 患者和对照组临床资料比较[（
$\bar x \pm s$ ），M（P25，P75）]Table 2. Clinical data of patients between two groups
项目 对照组（n = 65） T2DM组（n = 65） 性别（男/女） 34/31 36/29 年龄（岁） 33.5 ± 11.69 56.27 ± 12.28▲ BMI（kg/m2） 22.09 ± 3.18 23.80 ± 3.58▲ FPG（mmol/L） 5.0（4.72，5.44） 7.05（5.45，9.7） ▲ TC（mmol/L） 4.47 ± 0.52 4.21 ± 1.0▲ TG（mmol/L） 1.1（0.79，1.64） 1.61 （1.3，2.4） ▲ LDL（mmol/L） 2.48 ± 0.44 2.88 （2.41，3.11） ▲ HDL（mmol/L） 1.37（1.21，1.68） 0.98 （0.83，1.12） ▲ UA（μmol/L） 344.01（300.25，382.5） 320.3（284.4，354.15） Cr（μmol/L） 76.0（62.5，85.25） 62.75 （52.03，70.7） eGFR（ml/min*1.73m2） 106.76 ± 17.04 108.97 ± 28.15 UACR（mg/g） - 26.8（12.34，50.86） 注：正态性分布资料以（${{\bar x} } \pm s$）表示，非正态性资料以M（P25，P75）表示，与对照组比较，▲P < 0.05。BMI：体重指数；FPG：空腹血糖；TC：总胆固醇；TG：甘油三酯；LDL：低密度脂蛋白；HDL：高密度脂蛋白；UA：尿酸；Cr：肌酐；eGFR：估计肾小球滤过率；UACR：尿白蛋白肌酐比。
下载: 导出CSV
表 3 miR-1181靶基因预测结果
Table 3. Prediction Results of miR-1181 Target Genes
miRNA Transcript Total score Total energy Max score Max energy Strand miRNA
lengthTranscript
lengthTranscript
PostionmiR-1181 ZBTB4 150 −18.25 150 −18.25 3 21 5961 5584 miR-1181 MAP2K2 157 −25.76 157 −25.76 1 21 1759 1645 miR-1181 MAPK12 156 −15.92 143 −15.92 2 21 1778 1644
下载: 导出CSV
-
[1] 叶莺,刘小华,严延生. 2型糖尿病患者血浆microRNA差异表达及生物信息学分析[J]. 中华医学遗传学杂志,2021,38(6):536-540. [2] Ying S Y,Chang D C,Lin S L. The microRNA[J]. Methods MolBiol,2018,1733(10):1-25. [3] Zhang N. Protocols for the analysis of microRNA expression,biogenesis,and function in immune cells[J]. Curr Protoc Immunol,2019,126(1):e78. [4] 周建萍,毛振彪,吴信华. 微RNA-9对胃癌细胞内CDX2基因表达的影响[J]. 国际消化病杂志,2018,38(5):314-319. doi: 10.3969/j.issn.1673-534X.2018.05.009 [5] 郭青松,王鹏,黄龑,等. 微小RNA-30b对胰腺癌干细胞迁移和侵袭的调控作用[J]. 中华医学杂志,2019,99(38):3019-3023. doi: 10.3760/cma.j.issn.0376-2491.2019.38.011 [6] Hua X,Fan K C. Down-regulation of miR-1181 indicates a dismal prognosis for nasopharyngeal carcinoma and promoted cell proliferation and metastasis by modulating Wnt/beta-catenin signaling[J]. Eur Rev Med Pharmacol Sci,2019,23(3):1077-1086. [7] Ruan L. Serum miR-1181 and miR-4314 associated with ovarian cancer:MiRNA microarray data analysis for a pilot study[J]. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol,2018,222(1):31-38. [8] Jiang J. MiR-1181 inhibits stem cell-like phenotypes and suppresses SOX2 and STAT3 in human pancreatic cancer[J]. Cancer Lett,2015,356(2PtB):962-70. [9] Wang J. miR-1181 inhibits invasion and proliferation via STAT3 in pancreatic cancer[J]. World J Gastroenterol,2017,23(9):1594-1601. doi: 10.3748/wjg.v23.i9.1594 [10] Nam E J. MicroRNA profiling of a CD133(+) spheroid-forming subpopulation of the OVCAR3 human ovarian cancer cell line[J]. BMC Med Genomics,2012,5(18):1-9. [11] Ruan L. Serum miR-1181 and miR-4314 associated with ovarian cancer:MiRNA microarray data analysis for a pilot study[J]. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol,2018,222(10):31-38. [12] 王杰. miRNA-1181通过抑制STAT3影响人胰腺癌细胞的侵袭转移能力[J]. 贵州医科大学学报,2016,41(12):1387-1392. [13] Van Allen EM,Wagle N,Sucker A,et al. The genetic landscape of clinical resistance to RAF inhibition in metastatic melanoma[J]. Cancer Discov,2014,4(1):94-109. doi: 10.1158/2159-8290.CD-13-0617 [14] Zhong W,Zhu H,Sheng F,et al. Activation of the MAPK11/12/13/14 (p38 MAPK) pathway regulates the transcription of autophagy genes in response to oxidative stress induced by a novel copper complex in HeLa cells[J]. Autophagy,2014,10(7):1285-1300. doi: 10.4161/auto.28789 [15] 窦艳,邱鹏,王丽. NEK2及ERK2在不同病理类型乳腺癌中的表达及意义[J]. 临床合理用药杂志,2019,12(14):120-121. 期刊类型引用(0)
其他类型引用(1)
-
下载:
点击查看大图
计量
- 文章访问数: 2996
- HTML全文浏览量: 1794
- PDF下载量: 18
- 被引次数: 1
