Expression and Significance of Plasma miR-1181 in Patients with Type 2 Diabetes Mellitus
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摘要:
目的 miRNA可作为预测糖尿病发生和发展的生物标志物，探索miR-1181在2型糖尿病（Type 2 Diabetes Mellitus，T2DM)患者的表达情况。 方法 运用Agilent miRNA芯片对T2DM患者（n = 5）和正常对照组（n = 5）血浆样本进行差异筛选，荧光定量PCR技术（quantitative Real Time PCR，qRT-PCR）验证出差异表达的miRNA；通过生物信息学方法预测其靶基因并绘制miRNA-靶基因-代谢通路关系网络图，扩大样本检测血浆中差异表达的miRNA：miR-1181和靶基因MAP2K2、MAPK12表达水平。 结果 miRNA芯片筛选和qRT-PCR验证出与T2DM相关的差异表达miRNA：miR-1181，生物信息学分析得出miR-1181靶基因有CCND1、PI3KR2、MAP2K2和MAPK12；T2DM患者血浆中 miR-1181的表达水平明显下降（P < 0.001），而靶基因MAPK12 mRNA的表达水平明显升高（P < 0.01）。 结论 2型糖尿病患者血浆miR-1181水平降低，可能与其抑制靶基因MAPK12对MAPK通路影响有关。 Abstract:Objective To verify that miRNA can be used as biomarkers to predict the occurrence and development of diabetes mellitus （DM）, and to explore the expression of miR-1181 in patients with type 2 diabetes mellitus （Type 2 Diabetes Mellitus）. Methods Agilent miRNA chip was used to screen plasma samples from patients with T2DM （n = 5） and normal control group （n = 5）. The differentially expressed miRNA were verified by fluorescence quantitative PCR （qRT-PCR）. The target genes were predicted by bioinformatics methods, and the relationship network diagram of miRNA - target gene - metabolic pathway was drawn. The differentially expressed miRNA: miR-1181, MAP2K2 and MAPK12 in plasma were detected by expanding samples. Results miRNA chip screening and qRT-PCR verified the differentially expressed miRNA associated with T2DM: miR-1181.Bioinformatics analysis showed that the target genes of miR-1181 were CCND1, PI3KR2, MAP2K2 and MAPK12. The expression of miR-1181 in the plasma of T2DM was significantly decreased （P < 0.001）. While expression of MAPK12 mRNA was increased （P < 0.01）. Conclusion The decrease of plasma miR-1181 in T2DM patients may be related to inhibiting effect of target gene MAPK12 on MAPK pathway. -
Key words:
- miR-1181 /
- Type 2 Diabetes /
- Target Genes /
- MAPK12
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近年来发现的miRNA已逐渐成为一种包括糖尿病在内，肿瘤、心脏疾病、卒中、药物性肝损伤、败血症以及妊娠生理状态改变等多种疾病特异性的、 新型的生物标志物。已有多项研究[1-3]提示miRNA可以作为糖尿病发病的预测因子，可作为预测糖尿病发生和发展的生物标志物，为我们提供了新的预测疾病的指标和干预靶点。一些特定miRNA的表达水平在许多疾病的早期就与正常对照之间存在明显差异，并被证实参与了某些疾病的发生、发展，对特定miRNA的靶向沉默操作也被证实可对疾病发生发展产生影响。
本研究运用Agilent miRNA芯片差异筛选并用荧光定量PCR技术（qRT- PCR）验证出差异表达的miRNA：miR-1181，通过生物信息学方法预测靶基因并绘制miRNA-靶基因-代谢通路关系网络图，探索并鉴定miR-1181可能介导MAPK通路在2型糖尿病（T2DM）中的分子机制，旨在为2型糖尿病发病机理提供新的理论依据，为临床干预及诊治提供新思路。
1. 资料与方法
1.1 研究对象
收集昆明医科大学第一附属医院老年内分泌科、内分泌一科和内分泌二科 2016 年 5 月至 2017年 12 月就诊的 2 型糖尿病住院患者血浆样本共计65 例（其中5例为Agilent miRNA芯片病例组），同时纳入正常健康对照组 65例（其中5例为Agilent miRNA芯片正常对照组）.所有研究对象均排除有 1 型糖尿病和特殊类型糖尿病，近1月内发生过糖尿病急性并发症，合并其他急慢性肾脏疾病、急性感染及肿瘤。
1.2 主要试剂和仪器
Aglient芯片实验，使用人Human Agilent Human miRNA V19.0 （8*60K）芯片，可检测2006个人成熟miRNA，信息来源于Sanger miRBase V19.0。analytikjena-qTOWER2.2型荧光定量PCR仪（德国）、SCILOGEX D3024R离心机（美国）、普通PCR仪analytikjena-Easycycler（德国）；Trizol提取试剂盒；反转录试剂盒（TUREscript 1st Stand cDNA SYNTHESIS Kit）（艾德来）；2×SYBR® Green预混液（德国DBI）和第一链cDNA合成试剂盒（RevertAid Premium Reverse Transcriptase） （Thermo Scientific™ EP0733）。
1.3 方法
血浆miR-1181和MAP2K2、MAPK12检测，用K2EDTA抗凝管取空腹静脉血3 mL，3 h内行3 000 r/min离心10 min，分离血浆分装至标记好序号的EP管后置于-80℃冰箱中保存备用。待样本收集后血浆样品总RNA的提取，统一采用qRT-PCR的实验方法检测各组血浆中miR-1181和MAP2K2、MAPK12表达水平，以cel-miR-39和U6为miR-1181的外源性内参和内源性内参，GAPDH为MAP2K2和MAPK12内源性内参，引物均由上海生工技术有限公司合成，严格按照反转录试剂盒和cDNA第一链合成试剂盒说明书进行操作，最后应用2-ΔΔCT法分析结果，见表1。
表 1 qRT-PCR 引物及退火温度列表Table 1. qRT-PCR Primer and annealing temperature list引物名称 序列（5′to3′） 退火温度Tm（℃） U6-F CTCGCTTCGGCAGCACATATACT 58 U6 -R ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC cel-miR-39-5p-RT GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTATTAC cel-miR-39-5p-F TGGGAGCTGATTTCGTCTTG 59.7 hsa-mir-1181-RT GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCGGCTC hsa-mir-1181-F AATAACCGTCGCCGCCACCCG 72.5 GAPDH-F: GGTTGTCTCCTGCGACTTCA 58.2 GAPDH-R TGGTCCAGGGTTTCTTACTCC 58.2 MAP2K2-F: CACTATCAACCCTACCATCGC 57.3 MAP2K2-R: CGCTTCCTTTGCTGCTCAT 58.8 MAPK12-F TCTGTCCTGACCAACGCAA 57.6 MAPK12-R AAGGGACTCAAAGTATGGATGG 57.6 靶基因预测方法对验证与芯片结果一致并表达差异的miRNA，采用Target Scan（http://www.targetscan.org）、miRanda（www.microrna.org）、PITA （http://genie.weizmann.ac.il/pubs/mir07/mir07_data.html）、miRDB（http://mirdb.org/cgi-bin/search.cgi）4个软件在线预测miR-1181的靶基因，从miRNA靶基因结果中，对所有候选靶基因进行Gene Ontology（GO）功能分类和KEGG pathway富集分析，利用igraph包绘制核心基因的网络连接图。
1.4 统计学处理
采用SPSS软件进行数据处理，所有数据均进行正态性检验，正态性分布计量资料以均数±标准差（
${{\bar x}}\pm s$ ）表示，非正态性分布计量资料以中位数和四分位数M（P25，P75）表示。正态性分布资料，2组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差齐性检验，若为非正态性分布资料，采用非参数检验。所有统计分析均为双侧，检验水准α= 0.05，P < 0.05为差异有统计学意义。2. 结果
2.1 入组受试者临床资料比较：
正常对照组、T2DM组间临床基线资料比较，T2DM组在年龄、BMI、TG、LDL均高于正常对照组（P < 0.05）；而TC、HDL低于正常对照组，见表2。
表 2 患者和对照组临床资料比较[（$\bar x \pm s$ ），M（P25，P75）]Table 2. Clinical data of patients between two groups项目 对照组（n = 65） T2DM组（n = 65） 性别（男/女） 34/31 36/29 年龄（岁） 33.5 ± 11.69 56.27 ± 12.28▲ BMI（kg/m2） 22.09 ± 3.18 23.80 ± 3.58▲ FPG（mmol/L） 5.0（4.72，5.44） 7.05（5.45，9.7） ▲ TC（mmol/L） 4.47 ± 0.52 4.21 ± 1.0▲ TG（mmol/L） 1.1（0.79，1.64） 1.61 （1.3，2.4） ▲ LDL（mmol/L） 2.48 ± 0.44 2.88 （2.41，3.11） ▲ HDL（mmol/L） 1.37（1.21，1.68） 0.98 （0.83，1.12） ▲ UA（μmol/L） 344.01（300.25，382.5） 320.3（284.4，354.15） Cr（μmol/L） 76.0（62.5，85.25） 62.75 （52.03，70.7） eGFR（ml/min*1.73m2） 106.76 ± 17.04 108.97 ± 28.15 UACR（mg/g） - 26.8（12.34，50.86） 注：正态性分布资料以（${{\bar x} } \pm s$）表示，非正态性资料以M（P25，P75）表示，与对照组比较，▲P < 0.05。BMI：体重指数；FPG：空腹血糖；TC：总胆固醇；TG：甘油三酯；LDL：低密度脂蛋白；HDL：高密度脂蛋白；UA：尿酸；Cr：肌酐；eGFR：估计肾小球滤过率；UACR：尿白蛋白肌酐比。 2.2 miRNA芯片筛选及血浆学中扩大样本验证
T2DM组与正常对照组芯片结果，在筛选差异 miRNA之前，先进行探针过滤，用于比较的每组样本中至少有一组100%标记为Detected的探针留下进行后续分析.对于有生物学重复的分析，利用 T 检验得到的差异显著性P值和标准化信号值的差异倍数Fold change值进行筛选，标准为Fold change≥2.0且P≤0.05。比较发现差异表达miRNA 88条，其中上调47条，下调41条.火山图中（蓝色和红色点表示为差异表达的miRNA）。Agilent miRNA芯片T2DM与对照组比较差异表达的miRNA（X轴是差异倍数以2为底取对数的值，Y轴是p-value值以10为底取负对数的值），见图1。根据Agilent miRNA芯片两两比较差异筛选出miR-1181，并在扩大样本验证（n = 65 vs 65）中证明：miR-1181在T2DM组血浆中表达较正常组明显降低（P = 0.047），见图2。
图 1 T2DM组与正常对照组的Agilent miRNA芯片结果Figure 1. Agilent miRNA microarray results of T2DM group and normal control group
图 2 miR-1181在T2DM组和正常对照组表达水平A：以cel-miR-39为miR-1181外源性内参的表达水平；B：以U6为miR-1181内源性内参的表达水平。Figure 2. The expression levels of miR-1181 in T2DM group and normal control group2.3 ROC曲线分析
发现miR-1181表达水平在T2DM与正常对照2组间ROC曲线的AUC = 0.794，P = 0.000，95%CI = 0.664～0.924，见图3。
图 3 miR-1181在T2DM组与和正常对照组ROC 曲线Figure 3. ROC Curve of miR-1181 in T2DM group and normal control group2.4 生物信息学预测和分析
对验证与芯片结果一致并表达差异的miRNA，利用应用miRWalk、miRanda、PITA和Targetscan软件预测的生物信息学的方法，从miRNA靶基因结果中，对所有候选靶基因进行Gene Ontology（GO）功能分类和KEGG pathway富集分析，发现至少被4个预测工具同时预测到的靶基因miR-1181的靶基因有CCND1、PI3KR2、MAP2K2和MAPK12，选择至少被4个预测工具预测到的靶基因进行富集.根据KEGG富集结果，利用 igraph 包绘制核心基因的网络连接图绘制了miR-1181-靶基因-代谢通路关系网络图，见图4。在该网络图中MAPK通路的Enrichment Score = 2.358，P = 0.0068，说明miR-1181可能通过MAP2K2和MAPK12对MAPK通路有影响。
图 4 KEGG富集miRNA-靶基因-代谢通路关系网络注：黄色V代表miRNA，红色方块代表代谢通路，蓝色圆点代表基因。基因和代谢通路越大，表示连接度越高，值得重点关注。miR-1181的靶向作用关系用红线着重标出。Figure 4. The miRNA Target Gene-Metabolic Pathway Network enriched by KEGG通过miRanda软件，绘制miR-1181与NEUROD2、ZBTB4、ARHGAP39、SOX2、CCND1、PI3KR2、MAP2K2、MAPK12以及根据文献报道与自身免疫性糖尿病相关的靶基因STAT3基因的3′UTR互补序列分析，仅发现miR-1181分别与ZBTB4，MAP2K2和MAPK12间可能存在靶向关系，miR-1181靶基因预测结果见表3，预测序列互补见图5，图6。
表 3 miR-1181靶基因预测结果Table 3. Prediction Results of miR-1181 Target GenesmiRNA Transcript Total score Total energy Max score Max energy Strand miRNA
lengthTranscript
lengthTranscript
PostionmiR-1181 ZBTB4 150 −18.25 150 −18.25 3 21 5961 5584 miR-1181 MAP2K2 157 −25.76 157 −25.76 1 21 1759 1645 miR-1181 MAPK12 156 −15.92 143 −15.92 2 21 1778 1644 
图 5 miR-1181靶基因MAP2K2预测序列互补图Figure 5. Complementary map of MAP2K2 prediction sequence of miR-1181 Target Gene
图 6 miR-1181靶基因MAPK12预测序列互补图Figure 6. Complementary map of MAPK12 prediction sequence of miR-1181 Target Gene2.5 血浆MAP2K2和MAPK12 mRNA表达
T2DM组血浆中MAPK12 mRNA表达较正常对照组明显升高 （P = 0.047），见图7A，但MAP2K2mRNA表达较正常对照组无明显差别（P = 0.445），见图7B。
图 7 MAP2K2和MAPK12 mRNA在T2DM组和正常对照组表达Figure 7. MAP2K2 and MAPK12 mRNA Expressions in T2DM group and normal control group3. 讨论
miRNA是一种内源性的单链非编码RNA，其与靶mRNA的3′-UTR结合，调节基因转录后表达，影响相关蛋白质合成，从而调控细胞生物学行为，参与多种消化道疾病的发生、发展[4-5]。目前对miR-1181的研究很少，现有研究主要局限在肿瘤性疾病，机制还不完全清楚[6-7]。一项对胰腺癌的研究[8]发现，胰腺癌组织和细胞中均发现miR-1181表达水平较正常胰腺组织中明显降低，低水平的miR-1181与胰腺癌患者无论是总生存期和缓解后的生存期都明显短于高水平miR-1181表达者，miR-1181下调与肿瘤复发存在一定的关联。对CSC（肿瘤干细胞）和胰腺癌细胞体内研究发现，miR-1181表达均受到明显抑制，并发现 miR-1181能够直接抑制其靶基因SOX2 （sex determining region Y-box 2）和STAT3（signal transduction andactivation of transcription 3）基因表达，导致SOX2蛋白和STAT3蛋白表达下降。用Western bloting的方法发现，在miR-1181转染的AsPC-1和PANC-1细胞（两种人类胰腺肿瘤细胞株）中均能发现SOX2和STAT3表达降低，在抗miR-1181转染后，两种细胞中SOX2和STAT3表达水平升高[9]。另外的研究[10]在CD133 + 球形OVCAR3细胞亚型（一种CSC样表型的卵巢癌细胞）miRNA表达谱中，也发现miR-1181明显下调，说明miR-1181能够与CSC表型的多种肿瘤发生有关联，可能是一种治疗胰腺癌等肿瘤的潜在靶点[11]。体外实验发现miR-1181可能通过抑制 STAT3来抑制人胰腺癌细胞的侵袭转移能力[12]。
细胞外调节蛋白激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）2，即MAP2K2（ mitogen activated protein kinase kinase2）和MAPK12 （MAP kinase 12）是 MAPK途径的组成成员[13-14]，是MAPK-ERK信号通路的两个关键分子。多项研究表明，多数生长因子、细胞因子调控细胞增殖的重要途径与MAPK-ERK信号通路有关，该通路参与了细胞周期调控[15]。通过本研究发现T2DM患者较正常对照组的血浆miRNA表达谱存在特征性变化，血浆miR-1181的表达水平在2型糖尿病早期患者中明显降低，用miR-1181可作为特异性的2型糖尿病血浆学标志物，并通过靶基因预测及富集分析发现与miR-1181可能存在靶向调控的基因MAP2K2和MAPK12和与T2DM发病有密切关系的代谢通路MAPK。我们推测在2型糖尿病状态下，miR-1181存在靶向调控其靶基因MAP2K2和MAPK12，并介导调控MAPK代谢通路，miR-1181可能介导MAPK通路在2型糖尿病发病中的分子机制。本研究KEGG pathway富集分析发现miR-1181-靶基因-代谢通路关系网络图中MAPK通路的Enrichment Score = 2.358，P = 0.0068，说明miR-1181可能通过MAP2K2和MAPK12影响MAPK通路并与2型糖尿病发病有关。所以笔者认为2型糖尿病患者血浆miR-1181水平降低，可能与其抑制靶基因MAPK12对MAPK通路影响有关。
该研究结果具有一定的代表性，在一定程度上找到了新的2型糖尿病特异性表达的miRNA，但2型糖尿病的异质性和复杂性，仍需要进行大样本和前瞻性研究在2型糖尿病患者普通状态中去进一步验证。
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图 1 T2DM组与正常对照组的Agilent miRNA芯片结果
Figure 1. Agilent miRNA microarray results of T2DM group and normal control group
图 2 miR-1181在T2DM组和正常对照组表达水平
A：以cel-miR-39为miR-1181外源性内参的表达水平；B：以U6为miR-1181内源性内参的表达水平。
Figure 2. The expression levels of miR-1181 in T2DM group and normal control group
图 3 miR-1181在T2DM组与和正常对照组ROC 曲线
Figure 3. ROC Curve of miR-1181 in T2DM group and normal control group
图 4 KEGG富集miRNA-靶基因-代谢通路关系网络
注：黄色V代表miRNA，红色方块代表代谢通路，蓝色圆点代表基因。基因和代谢通路越大，表示连接度越高，值得重点关注。miR-1181的靶向作用关系用红线着重标出。
Figure 4. The miRNA Target Gene-Metabolic Pathway Network enriched by KEGG
图 5 miR-1181靶基因MAP2K2预测序列互补图
Figure 5. Complementary map of MAP2K2 prediction sequence of miR-1181 Target Gene
图 6 miR-1181靶基因MAPK12预测序列互补图
Figure 6. Complementary map of MAPK12 prediction sequence of miR-1181 Target Gene
图 7 MAP2K2和MAPK12 mRNA在T2DM组和正常对照组表达
Figure 7. MAP2K2 and MAPK12 mRNA Expressions in T2DM group and normal control group
表 1 qRT-PCR 引物及退火温度列表
Table 1. qRT-PCR Primer and annealing temperature list
引物名称 序列（5′to3′） 退火温度Tm（℃） U6-F CTCGCTTCGGCAGCACATATACT 58 U6 -R ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC cel-miR-39-5p-RT GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTATTAC cel-miR-39-5p-F TGGGAGCTGATTTCGTCTTG 59.7 hsa-mir-1181-RT GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCGGCTC hsa-mir-1181-F AATAACCGTCGCCGCCACCCG 72.5 GAPDH-F: GGTTGTCTCCTGCGACTTCA 58.2 GAPDH-R TGGTCCAGGGTTTCTTACTCC 58.2 MAP2K2-F: CACTATCAACCCTACCATCGC 57.3 MAP2K2-R: CGCTTCCTTTGCTGCTCAT 58.8 MAPK12-F TCTGTCCTGACCAACGCAA 57.6 MAPK12-R AAGGGACTCAAAGTATGGATGG 57.6 
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表 2 患者和对照组临床资料比较[（
$\bar x \pm s$ ），M（P25，P75）]Table 2. Clinical data of patients between two groups
项目 对照组（n = 65） T2DM组（n = 65） 性别（男/女） 34/31 36/29 年龄（岁） 33.5 ± 11.69 56.27 ± 12.28▲ BMI（kg/m2） 22.09 ± 3.18 23.80 ± 3.58▲ FPG（mmol/L） 5.0（4.72，5.44） 7.05（5.45，9.7） ▲ TC（mmol/L） 4.47 ± 0.52 4.21 ± 1.0▲ TG（mmol/L） 1.1（0.79，1.64） 1.61 （1.3，2.4） ▲ LDL（mmol/L） 2.48 ± 0.44 2.88 （2.41，3.11） ▲ HDL（mmol/L） 1.37（1.21，1.68） 0.98 （0.83，1.12） ▲ UA（μmol/L） 344.01（300.25，382.5） 320.3（284.4，354.15） Cr（μmol/L） 76.0（62.5，85.25） 62.75 （52.03，70.7） eGFR（ml/min*1.73m2） 106.76 ± 17.04 108.97 ± 28.15 UACR（mg/g） - 26.8（12.34，50.86） 注：正态性分布资料以（${{\bar x} } \pm s$）表示，非正态性资料以M（P25，P75）表示，与对照组比较，▲P < 0.05。BMI：体重指数；FPG：空腹血糖；TC：总胆固醇；TG：甘油三酯；LDL：低密度脂蛋白；HDL：高密度脂蛋白；UA：尿酸；Cr：肌酐；eGFR：估计肾小球滤过率；UACR：尿白蛋白肌酐比。
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表 3 miR-1181靶基因预测结果
Table 3. Prediction Results of miR-1181 Target Genes
miRNA Transcript Total score Total energy Max score Max energy Strand miRNA
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PostionmiR-1181 ZBTB4 150 −18.25 150 −18.25 3 21 5961 5584 miR-1181 MAP2K2 157 −25.76 157 −25.76 1 21 1759 1645 miR-1181 MAPK12 156 −15.92 143 −15.92 2 21 1778 1644
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