Expression and Significance of Plasma miR-1181 in Patients with Type 2 Diabetes Mellitus
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摘要:
目的 miRNA可作为预测糖尿病发生和发展的生物标志物,探索miR-1181在2型糖尿病(Type 2 Diabetes Mellitus,T2DM)患者的表达情况。 方法 运用Agilent miRNA芯片对T2DM患者(n = 5)和正常对照组(n = 5)血浆样本进行差异筛选,荧光定量PCR技术(quantitative Real Time PCR,qRT-PCR)验证出差异表达的miRNA;通过生物信息学方法预测其靶基因并绘制miRNA-靶基因-代谢通路关系网络图,扩大样本检测血浆中差异表达的miRNA:miR-1181和靶基因MAP2K2、MAPK12表达水平。 结果 miRNA芯片筛选和qRT-PCR验证出与T2DM相关的差异表达miRNA:miR-1181,生物信息学分析得出miR-1181靶基因有CCND1、PI3KR2、MAP2K2和MAPK12;T2DM患者血浆中 miR-1181的表达水平明显下降(P < 0.001),而靶基因MAPK12 mRNA的表达水平明显升高(P < 0.01)。 结论 2型糖尿病患者血浆miR-1181水平降低,可能与其抑制靶基因MAPK12对MAPK通路影响有关。 Abstract:Objective To verify that miRNA can be used as biomarkers to predict the occurrence and development of diabetes mellitus (DM), and to explore the expression of miR-1181 in patients with type 2 diabetes mellitus (Type 2 Diabetes Mellitus). Methods Agilent miRNA chip was used to screen plasma samples from patients with T2DM (n = 5) and normal control group (n = 5). The differentially expressed miRNA were verified by fluorescence quantitative PCR (qRT-PCR). The target genes were predicted by bioinformatics methods, and the relationship network diagram of miRNA - target gene - metabolic pathway was drawn. The differentially expressed miRNA: miR-1181, MAP2K2 and MAPK12 in plasma were detected by expanding samples. Results miRNA chip screening and qRT-PCR verified the differentially expressed miRNA associated with T2DM: miR-1181.Bioinformatics analysis showed that the target genes of miR-1181 were CCND1, PI3KR2, MAP2K2 and MAPK12. The expression of miR-1181 in the plasma of T2DM was significantly decreased (P < 0.001). While expression of MAPK12 mRNA was increased (P < 0.01). Conclusion The decrease of plasma miR-1181 in T2DM patients may be related to inhibiting effect of target gene MAPK12 on MAPK pathway. -
Key words:
- miR-1181 /
- Type 2 Diabetes /
- Target Genes /
- MAPK12
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近年来发现的miRNA已逐渐成为一种包括糖尿病在内,肿瘤、心脏疾病、卒中、药物性肝损伤、败血症以及妊娠生理状态改变等多种疾病特异性的、 新型的生物标志物。已有多项研究[1-3]提示miRNA可以作为糖尿病发病的预测因子,可作为预测糖尿病发生和发展的生物标志物,为我们提供了新的预测疾病的指标和干预靶点。一些特定miRNA的表达水平在许多疾病的早期就与正常对照之间存在明显差异,并被证实参与了某些疾病的发生、发展,对特定miRNA的靶向沉默操作也被证实可对疾病发生发展产生影响。
本研究运用Agilent miRNA芯片差异筛选并用荧光定量PCR技术(qRT- PCR)验证出差异表达的miRNA:miR-1181,通过生物信息学方法预测靶基因并绘制miRNA-靶基因-代谢通路关系网络图,探索并鉴定miR-1181可能介导MAPK通路在2型糖尿病(T2DM)中的分子机制,旨在为2型糖尿病发病机理提供新的理论依据,为临床干预及诊治提供新思路。
1. 资料与方法
1.1 研究对象
收集昆明医科大学第一附属医院老年内分泌科、内分泌一科和内分泌二科 2016 年 5 月至 2017年 12 月就诊的 2 型糖尿病住院患者血浆样本共计65 例(其中5例为Agilent miRNA芯片病例组),同时纳入正常健康对照组 65例(其中5例为Agilent miRNA芯片正常对照组).所有研究对象均排除有 1 型糖尿病和特殊类型糖尿病,近1月内发生过糖尿病急性并发症,合并其他急慢性肾脏疾病、急性感染及肿瘤。
1.2 主要试剂和仪器
Aglient芯片实验,使用人Human Agilent Human miRNA V19.0 (8*60K)芯片,可检测2006个人成熟miRNA,信息来源于Sanger miRBase V19.0。analytikjena-qTOWER2.2型荧光定量PCR仪(德国)、SCILOGEX D3024R离心机(美国)、普通PCR仪analytikjena-Easycycler(德国);Trizol提取试剂盒;反转录试剂盒(TUREscript 1st Stand cDNA SYNTHESIS Kit)(艾德来);2×SYBR® Green预混液(德国DBI)和第一链cDNA合成试剂盒(RevertAid Premium Reverse Transcriptase) (Thermo Scientific™ EP0733)。
1.3 方法
血浆miR-1181和MAP2K2、MAPK12检测,用K2EDTA抗凝管取空腹静脉血3 mL,3 h内行3 000 r/min离心10 min,分离血浆分装至标记好序号的EP管后置于-80℃冰箱中保存备用。待样本收集后血浆样品总RNA的提取,统一采用qRT-PCR的实验方法检测各组血浆中miR-1181和MAP2K2、MAPK12表达水平,以cel-miR-39和U6为miR-1181的外源性内参和内源性内参,GAPDH为MAP2K2和MAPK12内源性内参,引物均由上海生工技术有限公司合成,严格按照反转录试剂盒和cDNA第一链合成试剂盒说明书进行操作,最后应用2-ΔΔCT法分析结果,见表1。
表 1 qRT-PCR 引物及退火温度列表Table 1. qRT-PCR Primer and annealing temperature list引物名称 序列(5′to3′) 退火温度Tm(℃) U6-F CTCGCTTCGGCAGCACATATACT 58 U6 -R ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC cel-miR-39-5p-RT GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTATTAC cel-miR-39-5p-F TGGGAGCTGATTTCGTCTTG 59.7 hsa-mir-1181-RT GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCGGCTC hsa-mir-1181-F AATAACCGTCGCCGCCACCCG 72.5 GAPDH-F: GGTTGTCTCCTGCGACTTCA 58.2 GAPDH-R TGGTCCAGGGTTTCTTACTCC 58.2 MAP2K2-F: CACTATCAACCCTACCATCGC 57.3 MAP2K2-R: CGCTTCCTTTGCTGCTCAT 58.8 MAPK12-F TCTGTCCTGACCAACGCAA 57.6 MAPK12-R AAGGGACTCAAAGTATGGATGG 57.6 靶基因预测方法对验证与芯片结果一致并表达差异的miRNA,采用Target Scan(http://www.targetscan.org)、miRanda(www.microrna.org)、PITA (http://genie.weizmann.ac.il/pubs/mir07/mir07_data.html)、miRDB(http://mirdb.org/cgi-bin/search.cgi)4个软件在线预测miR-1181的靶基因,从miRNA靶基因结果中,对所有候选靶基因进行Gene Ontology(GO)功能分类和KEGG pathway富集分析,利用igraph包绘制核心基因的网络连接图。
1.4 统计学处理
采用SPSS软件进行数据处理,所有数据均进行正态性检验,正态性分布计量资料以均数±标准差(
${{\bar x}}\pm s$ )表示,非正态性分布计量资料以中位数和四分位数M(P25,P75)表示。正态性分布资料,2组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差齐性检验,若为非正态性分布资料,采用非参数检验。所有统计分析均为双侧,检验水准α= 0.05,P < 0.05为差异有统计学意义。2. 结果
2.1 入组受试者临床资料比较:
正常对照组、T2DM组间临床基线资料比较,T2DM组在年龄、BMI、TG、LDL均高于正常对照组(P < 0.05);而TC、HDL低于正常对照组,见表2。
表 2 患者和对照组临床资料比较[($\bar x \pm s$ ),M(P25,P75)]Table 2. Clinical data of patients between two groups项目 对照组(n = 65) T2DM组(n = 65) 性别(男/女) 34/31 36/29 年龄(岁) 33.5 ± 11.69 56.27 ± 12.28▲ BMI(kg/m2) 22.09 ± 3.18 23.80 ± 3.58▲ FPG(mmol/L) 5.0(4.72,5.44) 7.05(5.45,9.7) ▲ TC(mmol/L) 4.47 ± 0.52 4.21 ± 1.0▲ TG(mmol/L) 1.1(0.79,1.64) 1.61 (1.3,2.4) ▲ LDL(mmol/L) 2.48 ± 0.44 2.88 (2.41,3.11) ▲ HDL(mmol/L) 1.37(1.21,1.68) 0.98 (0.83,1.12) ▲ UA(μmol/L) 344.01(300.25,382.5) 320.3(284.4,354.15) Cr(μmol/L) 76.0(62.5,85.25) 62.75 (52.03,70.7) eGFR(ml/min*1.73m2) 106.76 ± 17.04 108.97 ± 28.15 UACR(mg/g) - 26.8(12.34,50.86) 注:正态性分布资料以(${{\bar x} } \pm s$)表示,非正态性资料以M(P25,P75)表示,与对照组比较,▲P < 0.05。BMI:体重指数;FPG:空腹血糖;TC:总胆固醇;TG:甘油三酯;LDL:低密度脂蛋白;HDL:高密度脂蛋白;UA:尿酸;Cr:肌酐;eGFR:估计肾小球滤过率;UACR:尿白蛋白肌酐比。 2.2 miRNA芯片筛选及血浆学中扩大样本验证
T2DM组与正常对照组芯片结果,在筛选差异 miRNA之前,先进行探针过滤,用于比较的每组样本中至少有一组100%标记为Detected的探针留下进行后续分析.对于有生物学重复的分析,利用 T 检验得到的差异显著性P值和标准化信号值的差异倍数Fold change值进行筛选,标准为Fold change≥2.0且P≤0.05。比较发现差异表达miRNA 88条,其中上调47条,下调41条.火山图中(蓝色和红色点表示为差异表达的miRNA)。Agilent miRNA芯片T2DM与对照组比较差异表达的miRNA(X轴是差异倍数以2为底取对数的值,Y轴是p-value值以10为底取负对数的值),见图1。根据Agilent miRNA芯片两两比较差异筛选出miR-1181,并在扩大样本验证(n = 65 vs 65)中证明:miR-1181在T2DM组血浆中表达较正常组明显降低(P = 0.047),见图2。
2.3 ROC曲线分析
发现miR-1181表达水平在T2DM与正常对照2组间ROC曲线的AUC = 0.794,P = 0.000,95%CI = 0.664~0.924,见图3。
2.4 生物信息学预测和分析
对验证与芯片结果一致并表达差异的miRNA,利用应用miRWalk、miRanda、PITA和Targetscan软件预测的生物信息学的方法,从miRNA靶基因结果中,对所有候选靶基因进行Gene Ontology(GO)功能分类和KEGG pathway富集分析,发现至少被4个预测工具同时预测到的靶基因miR-1181的靶基因有CCND1、PI3KR2、MAP2K2和MAPK12,选择至少被4个预测工具预测到的靶基因进行富集.根据KEGG富集结果,利用 igraph 包绘制核心基因的网络连接图绘制了miR-1181-靶基因-代谢通路关系网络图,见图4。在该网络图中MAPK通路的Enrichment Score = 2.358,P = 0.0068,说明miR-1181可能通过MAP2K2和MAPK12对MAPK通路有影响。
通过miRanda软件,绘制miR-1181与NEUROD2、ZBTB4、ARHGAP39、SOX2、CCND1、PI3KR2、MAP2K2、MAPK12以及根据文献报道与自身免疫性糖尿病相关的靶基因STAT3基因的3′UTR互补序列分析,仅发现miR-1181分别与ZBTB4,MAP2K2和MAPK12间可能存在靶向关系,miR-1181靶基因预测结果见表3,预测序列互补见图5,图6。
表 3 miR-1181靶基因预测结果Table 3. Prediction Results of miR-1181 Target GenesmiRNA Transcript Total score Total energy Max score Max energy Strand miRNA
lengthTranscript
lengthTranscript
PostionmiR-1181 ZBTB4 150 −18.25 150 −18.25 3 21 5961 5584 miR-1181 MAP2K2 157 −25.76 157 −25.76 1 21 1759 1645 miR-1181 MAPK12 156 −15.92 143 −15.92 2 21 1778 1644 2.5 血浆MAP2K2和MAPK12 mRNA表达
T2DM组血浆中MAPK12 mRNA表达较正常对照组明显升高 (P = 0.047),见图7A,但MAP2K2mRNA表达较正常对照组无明显差别(P = 0.445),见图7B。
3. 讨论
miRNA是一种内源性的单链非编码RNA,其与靶mRNA的3′-UTR结合,调节基因转录后表达,影响相关蛋白质合成,从而调控细胞生物学行为,参与多种消化道疾病的发生、发展[4-5]。目前对miR-1181的研究很少,现有研究主要局限在肿瘤性疾病,机制还不完全清楚[6-7]。一项对胰腺癌的研究[8]发现,胰腺癌组织和细胞中均发现miR-1181表达水平较正常胰腺组织中明显降低,低水平的miR-1181与胰腺癌患者无论是总生存期和缓解后的生存期都明显短于高水平miR-1181表达者,miR-1181下调与肿瘤复发存在一定的关联。对CSC(肿瘤干细胞)和胰腺癌细胞体内研究发现,miR-1181表达均受到明显抑制,并发现 miR-1181能够直接抑制其靶基因SOX2 (sex determining region Y-box 2)和STAT3(signal transduction andactivation of transcription 3)基因表达,导致SOX2蛋白和STAT3蛋白表达下降。用Western bloting的方法发现,在miR-1181转染的AsPC-1和PANC-1细胞(两种人类胰腺肿瘤细胞株)中均能发现SOX2和STAT3表达降低,在抗miR-1181转染后,两种细胞中SOX2和STAT3表达水平升高[9]。另外的研究[10]在CD133 + 球形OVCAR3细胞亚型(一种CSC样表型的卵巢癌细胞)miRNA表达谱中,也发现miR-1181明显下调,说明miR-1181能够与CSC表型的多种肿瘤发生有关联,可能是一种治疗胰腺癌等肿瘤的潜在靶点[11]。体外实验发现miR-1181可能通过抑制 STAT3来抑制人胰腺癌细胞的侵袭转移能力[12]。
细胞外调节蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)2,即MAP2K2( mitogen activated protein kinase kinase2)和MAPK12 (MAP kinase 12)是 MAPK途径的组成成员[13-14],是MAPK-ERK信号通路的两个关键分子。多项研究表明,多数生长因子、细胞因子调控细胞增殖的重要途径与MAPK-ERK信号通路有关,该通路参与了细胞周期调控[15]。通过本研究发现T2DM患者较正常对照组的血浆miRNA表达谱存在特征性变化,血浆miR-1181的表达水平在2型糖尿病早期患者中明显降低,用miR-1181可作为特异性的2型糖尿病血浆学标志物,并通过靶基因预测及富集分析发现与miR-1181可能存在靶向调控的基因MAP2K2和MAPK12和与T2DM发病有密切关系的代谢通路MAPK。我们推测在2型糖尿病状态下,miR-1181存在靶向调控其靶基因MAP2K2和MAPK12,并介导调控MAPK代谢通路,miR-1181可能介导MAPK通路在2型糖尿病发病中的分子机制。本研究KEGG pathway富集分析发现miR-1181-靶基因-代谢通路关系网络图中MAPK通路的Enrichment Score = 2.358,P = 0.0068,说明miR-1181可能通过MAP2K2和MAPK12影响MAPK通路并与2型糖尿病发病有关。所以笔者认为2型糖尿病患者血浆miR-1181水平降低,可能与其抑制靶基因MAPK12对MAPK通路影响有关。
该研究结果具有一定的代表性,在一定程度上找到了新的2型糖尿病特异性表达的miRNA,但2型糖尿病的异质性和复杂性,仍需要进行大样本和前瞻性研究在2型糖尿病患者普通状态中去进一步验证。
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表 1 qRT-PCR 引物及退火温度列表
Table 1. qRT-PCR Primer and annealing temperature list
引物名称 序列(5′to3′) 退火温度Tm(℃) U6-F CTCGCTTCGGCAGCACATATACT 58 U6 -R ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC cel-miR-39-5p-RT GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTATTAC cel-miR-39-5p-F TGGGAGCTGATTTCGTCTTG 59.7 hsa-mir-1181-RT GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCGGCTC hsa-mir-1181-F AATAACCGTCGCCGCCACCCG 72.5 GAPDH-F: GGTTGTCTCCTGCGACTTCA 58.2 GAPDH-R TGGTCCAGGGTTTCTTACTCC 58.2 MAP2K2-F: CACTATCAACCCTACCATCGC 57.3 MAP2K2-R: CGCTTCCTTTGCTGCTCAT 58.8 MAPK12-F TCTGTCCTGACCAACGCAA 57.6 MAPK12-R AAGGGACTCAAAGTATGGATGG 57.6 表 2 患者和对照组临床资料比较[(
$\bar x \pm s$ ),M(P25,P75)]Table 2. Clinical data of patients between two groups
项目 对照组(n = 65) T2DM组(n = 65) 性别(男/女) 34/31 36/29 年龄(岁) 33.5 ± 11.69 56.27 ± 12.28▲ BMI(kg/m2) 22.09 ± 3.18 23.80 ± 3.58▲ FPG(mmol/L) 5.0(4.72,5.44) 7.05(5.45,9.7) ▲ TC(mmol/L) 4.47 ± 0.52 4.21 ± 1.0▲ TG(mmol/L) 1.1(0.79,1.64) 1.61 (1.3,2.4) ▲ LDL(mmol/L) 2.48 ± 0.44 2.88 (2.41,3.11) ▲ HDL(mmol/L) 1.37(1.21,1.68) 0.98 (0.83,1.12) ▲ UA(μmol/L) 344.01(300.25,382.5) 320.3(284.4,354.15) Cr(μmol/L) 76.0(62.5,85.25) 62.75 (52.03,70.7) eGFR(ml/min*1.73m2) 106.76 ± 17.04 108.97 ± 28.15 UACR(mg/g) - 26.8(12.34,50.86) 注:正态性分布资料以(${{\bar x} } \pm s$)表示,非正态性资料以M(P25,P75)表示,与对照组比较,▲P < 0.05。BMI:体重指数;FPG:空腹血糖;TC:总胆固醇;TG:甘油三酯;LDL:低密度脂蛋白;HDL:高密度脂蛋白;UA:尿酸;Cr:肌酐;eGFR:估计肾小球滤过率;UACR:尿白蛋白肌酐比。 表 3 miR-1181靶基因预测结果
Table 3. Prediction Results of miR-1181 Target Genes
miRNA Transcript Total score Total energy Max score Max energy Strand miRNA
lengthTranscript
lengthTranscript
PostionmiR-1181 ZBTB4 150 −18.25 150 −18.25 3 21 5961 5584 miR-1181 MAP2K2 157 −25.76 157 −25.76 1 21 1759 1645 miR-1181 MAPK12 156 −15.92 143 −15.92 2 21 1778 1644 -
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其他类型引用(1)
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