Mechanism of miR-373 on Behaviors of Depression-mice via P2X7R
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摘要:
目的 探讨miR-373对抑郁症小鼠模型抑郁样行为，小胶质细胞激活和焦亡的影响。 方法 采用慢性不可预知应激构建抑郁症小鼠模型。蔗糖偏好，强迫游泳，尾部悬挂和社会实验评估小鼠的抑郁样行为。免疫荧光双染小胶质细胞标志物Iba-1和小胶质细胞活化标志物OX-42以评估小鼠海马层中小胶质细胞增殖和活化状态。TUNEL试剂盒检测小胶质细胞的凋亡。荧光定量PCR检测miR-373的表达水平。蛋白质印记检测P2X7R和细胞焦亡相关蛋白的表达水平。双荧光素酶报告基因实验验证miR-373和P2X7R的靶向关系。 结果 慢性不可预知应激处理的小鼠，蔗糖偏好度和社交时间显著下调，并且强迫游泳和尾部悬挂不动时间显著增加（P < 0.05）。miR-373在抑郁症模型小鼠中异常高表达，且能够缓解小鼠的抑郁样行为（P < 0.05）。miR-373靶向负调控小鼠海马层小胶质细胞中P2X7R的表达水平（P < 0.01）。miR-373抑制小鼠海马层中小胶质细胞增殖和激活（P < 0.01）。miR-373抑制小胶质细胞中Caspase-1，C-caspase-1，NLRP3，IL-1β和IL-18表达，并抑制小胶质细胞凋亡（P < 0.05）。 结论 miR-373通过靶向抑制P2X7R的表达，从而缓解抑郁症小鼠模型的抑郁样行为，并抑制其海马层中小胶质细胞活化和焦亡。 Abstract:Objective To explore the effect of miR-373 on depression-like behavior, microglia activation and pyrolysis in depression mice. Methods We Used chronic unpredictable stress to establish depression mice model. Sucrose preference, forced swimming, tail suspension, and Social interaction test were evaluate depression-like behaviors. Immunofluorescence double-stained microglia marker Iba-1 and microglia activation marker OX-42 were used to evaluate the proliferation and activation of microglia in the hippocampus of mice. TUNEL kit was used to detect microglia apoptosis. RT-qPCR was used to detect miR-373 expression. Western blotting was used to detect the expression of P2X7R and pyrolysis-related proteins. The targeting relationship between miR-373 and P2X7R was verified by dual-luciferase reporter gene assay. Results In mice treated with chronic unpredictable stress, sucrose preference and social time were significantly reduced, and immobility time of forced swimming and tail suspension was significantly increased （P < 0.05）. miR-373 washighly expressed, and alleviated depression-like behavior in depression model mice （P < 0.05）. miR-373 targeted and negatively regulated P2X7R expression in microglia ofmice hippocampus （P < 0.01）. miR-373 inhibited the proliferation and activation of microglia （P < 0.01）. miR-373 inhibited caspase-1, c-caspase-1, NLRP3, IL-1β and IL-18 expression, and the apoptosis of microglia （P < 0.05）. Conclusion ImiR-373 inhibits P2X7R expression to alleviate depression-like behavior, and inhibit the activation and pyroptosis of microglia in the hippocampus of depression mice. -
Key words:
- Depression /
- Depression-like behavior /
- Microglia /
- Pyroptosis /
- miR-373 /
- P2X7R
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抑郁症（major depressive disorder，MDD）是一种令人衰弱的疾病，其特征在于情绪低落，兴趣减少，认知功能受损和植物性症状，例如睡眠或食欲不振，严重限制了人群的心理社会功能并降低了生活质量[1-2]。在2008年，WHO将MDD列为全球疾病负担的第3大原因，并预测该疾病在2030年将位居首位[3]。目前，MDD的主要治疗手段为心理治疗和药物治疗。对多种增强或联合治疗尝试均无反应的耐治疗性患者，电抽搐治疗是有最佳治疗手段[4]。MDD的危险因素包括遗传因素和环境因素[5]。特别是整个生命周期中的压力事件在MDD的形成中起着关键作用[2, 6]。然而，目前对MDD病理生理学的理解并不能完善的解释该疾病。
目前，大量文献已表明，炎症和大脑回路之间的相互作用推动了MDD的发展，并可能导致目前的抗抑郁治疗手段无反应[7-9]。小胶质细胞是大脑的免疫细胞，激活的小胶质细胞能够产生大量的促炎因子，进而导致抑郁症[10, 11]。在这方面，与免疫系统和炎症相关的靶向机制和途径可能为MDD治疗开辟新的道路。微小RNAs（MicroRNAs，miRNAs）是一种长度在22 nt左右的非编码RNA，在调节基因表达中起着重要作用[12]。越来越多的证据表明，miRNAs在包括癌症和自身免疫性疾病在内的多种人类疾病中起到重要的调控作用[13]。尽管，最近的研究已经揭示了miRNAs在MDD发病机制中的重要性[14, 15]，但miRNAs在MDD发病机制中的具体机制仍不清楚。因此，本研究拟挖掘抑郁症小鼠中差异表达的miRNAs，并阐明miRNAs对抑郁症小鼠抑郁样行为和小胶质细胞表型的具体调控机制。
1. 材料与方法
1.1 主要材料
成年雄性BALB/c小鼠（24.0～26.0 g，8～10周龄）购买于中国科学院昆明动物所。ago-miR（无意义序列）和ago-miR-373由广州锐博生物设计和合成。TRIzol试剂，PrimeScriptRT reagent Kit和PrimeScript™ RT-PCR Kit购买于大连宝生物。BCA试剂盒及RIPA裂解液购买于上海优宁维生物。P2X7R蛋白质印迹和免疫荧光一抗和二抗抗体购买于美国CST公司。Iba-1和OX-42免疫荧光，caspase-1，c-caspase-1，NLRP3，IL-1β和IL-18免疫印迹一抗和二抗购买于英国abcam公司。TUNEL试剂盒购买于美国Merck。
1.2 实验方法
1.2.1 抑郁症小鼠模型构建
本研究参考Surget等的方法[16]，采用慢性不可预知应激（Chronic unpredictable stress，CUS）构建抑郁症小鼠模型。简而言之，将BALB/c小鼠随机分为Con组（正常）、CUS组（模型组），CUS+ago-miR组，CUS+ago-miR-373组（每组4只，n = 4）。CUS组小鼠接受一系列不可预测的轻度应激。应激源包括：（1）剥夺食物或水分24 h；（2）夜间照明；（3）笼中24 h没有垫料；（4）用水湿润垫料24 h；（5）分别在8 ℃或40 ℃下冷游泳或热游泳5 min；（6）距尾尖1 cm进行夹尾；（7）身体束缚6 h；（8）45°倾斜12 h。处理5周后，分别通过尾静脉注射ago-miR和ago-miR-373。
1.2.2 抑郁样行为检测
笔者采用蔗糖偏好（sucrose preference test，SPT）[17]，强迫游泳（Forced swim test，FST）[18]，尾部悬挂（tail suspension test，TST）[19]和社会实验（Social interaction test，SIT）[20]评估各组小鼠的抑郁样行为。SPT：在第36 d，将每只小鼠转移到一个笼子中，并训练其适应1%蔗糖溶液（w/v）和自来水24 h。适应后，剥夺小鼠水和食物24 h，然后进行SPT。自来水和蔗糖溶液的摄入量通过从初始重量减去暴露24 h后瓶子的最终重量来量化。蔗糖偏好比 = 蔗糖消耗量/（蔗糖消耗量+水分消耗量）×100%。FST：在第37天，将各组大鼠分别置于高80 cm，直径30 cm的25 ℃的圆柱形水中，强迫游泳15 min进行训练。训练24 h后，再次将大鼠单独置于圆筒中5 min，并检测小鼠的不动时间。不动时间被定义为小鼠停止挣扎，四肢在水中静止漂浮的时间。TST：在第38天，将大鼠悬在离地面50 cm的地方。试验持续时间为6 min，并在每次试验的最后4 min记录大鼠的不动时间。不动时间被定义为除了呼吸引起的运动，小鼠没有任何肢体或身体运动。SIT：在第39天，将小鼠单独置于测量笼中，让其自由探索120 min以适应。然后将一只雄性幼鼠引入笼中，并在3 min内记录与受试成年小鼠进行社交互动（舔，嗅，爬上或爬下另一只小鼠等行为）所花费的时间。
1.2.3 荧光定量（RT-qPCR）实验
Trizol试剂提取各组小鼠海马层组织中的总RNA。紫外光谱定量分析后，参考PrimeScriptRT reagent Kit说明书，将总RNA反转录为cDNA。以β-actin和U6为内参，相关引物序列，采用PrimeScript™ RT-PCR Kit检测mRNAs和miR-373的表达水平。qPCR反应体系：5 μL PCR Buffer II，2 μL dNTP Mixture，PCR正反引物各0.5 μL，0.5 μL TaKaRa Ex TaqHS，5 μL DNA模板及H2O2添加至50 μL。qPCR反应条件：94 ℃1 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，进行35个循环。实验结果采用2-ΔΔCt法进行计算。引物序列见表1。
表 1 RT-qPCR引物序列Table 1. RT-qPCR Primer Series目标 正向引物（5′-3′） 反向引物（5′-3′） miR-373 ACUCAAAAUGGGGGCGGAAAGC CAGTGCGTGTCGTGGAGT U6 CCCTTCGGGGACATCCGATA TTTGTGCGTGTCATCCTTGC caspase-1 TGGATCTTCACAAGGGCGAC CAACACAGCAACCAGCAGAC NLRP3 CAGGATGGCTCTCGCTTCAT CTGACAGAACCGTGGGACTC IL-1β TGCCACCTTTTGACAGTGATG TTCTTGTGACCCTGAGCGAC IL-18 ACAGGACTGCCATCTTCTGC ATTGTTCCTGGGCCAAGAGG β-actin TTCCAGCCTTCCTTCTTG TGTCAACGTCACACTTCA 1.2.4 蛋白质印记（Western blotting）实验
使用RIPA裂解缓冲液提取各组小鼠海马层组织中的总蛋白。BCA试剂盒量化蛋白质浓度后，取10 μg蛋白混合液在10%SDS-PAGE凝胶上电泳分离并转移到PVDF膜上。室温下，在含5%脱脂牛奶的TBST中封闭1 h后，加入P2X7R（1∶1000），caspase-1（1∶1000），c-caspase-1（1∶500），NLRP3（1∶1000），IL-1β（1∶1000）和IL-18（1∶1000）免疫印迹一抗，孵育过夜。然后，加入相应二抗后，室温，5%脱脂牛奶的TBST中封闭1 h。ECL化学发光底物显示蛋白质条带。以内参为β-actin，用ImageJ软件定量分析条带灰度值。
1.2.5 双荧光素酶报告基因实验
通过TargetScan（http://www.targetscan.org/vert_72/）数据库预测miR-373的下游靶标，并确定为P2X7R。PCR扩增P2X7 mRNA与miR-373潜在野生结合片段，导入到荧光素酶载体中构建P2X7R野生型质粒。突变miR-373和P2X7R的潜在野生结合片段，扩增和导入荧光素酶载体中获得P2X7R突变型质粒。随后，通过Lipofectamine 2000试剂盒向HEK-293T细胞中分别共转染P2X7R野生型质粒和miR-373 mimic，P2X7R突变型质粒和miR-373 mimic。参考双荧光素酶试剂盒说明书进行染色，以海肾荧光值作为内参，采用酶标仪检测萤火虫和海肾荧光值。
1.2.6 免疫荧光（Immuno fluorescence，IF）实验
将小鼠海马层组织固定在4%多聚甲醛中，脱水，冷冻切片机切片（20～30 μm）。然后使用0.1% Triton X-217100透化30 min。5% BSA阻断后，在4 ℃下加入P2X7R（1∶500），Iba-1（1∶500）和OX-42（1∶500）免疫荧光一抗孵育过夜。PBS清洗后，加入相应二抗孵育1 h。随后，使用DAPI进行细胞核染色。在共聚焦显微镜下观察和拍照。采用ImageJ软件进行溶图和荧光强度分析。
1.2.7 TUNEL实验
小鼠海马层组织经IF标记Iba-1后，PBS清洗2次。组织用4%多聚甲醛固定15 min，在0.25% Triton-X 100中透化20 min。参考TUNEL试剂盒进行小鼠海马层中小胶质细胞凋亡检测。简单地说，组织首先在37 ℃的末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）反应混合物中孵育45 min。DAPI进行细胞核染色。荧光显微镜进行观察和拍照。TUNEL阳性细胞在无明显坏死的随机视野内进行计数。
1.3 统计学处理
实验数据采用SPSS 20.0统计学软件进行分析，相关图片的绘制采用Graphpad 8.0软件进行绘制。2组间比较采用t检验；多组间比较采用单因素方差分析，其中两两比较采用LSD法。P < 0.05表示差异具有统计学意义。
2. 结果
2.1 抑郁症样小鼠模型构建
笔者对BALB/c小鼠进行了5周的CUS方案处理，见图1A，并分别在第36～39天进行SPT，FST，TST和SIT。SPT发现，CUS方案处理小鼠后，小鼠对蔗糖偏爱度显著降低（P < 0.01），见图1B。FST和TST发现，相比于对照组小鼠，CUS中的小鼠不动时间显著增加（P < 0.01，图1C-D）。SIT结果显示，CUS方案处理后，小鼠的社交时间显著降低（P < 0.05，图1E）。这些行为数据表明，采用CUS方案处理的BALB/c小鼠可作为抑郁症的动物模型。
图 1 抑郁症样小鼠模型构建A：BALB/c小鼠处理方法和时间示意图。在CUS处理BALB/c小鼠5周后，测量抑郁样行为的结果：B：SPT；C：FST；D：TST；E：SIT。与Con组比较，*P < 0.05，**P < 0.01。Figure 1. Construction of depression-like mice model2.2 miR-373对抑郁症模型小鼠抑郁样行为的影响
笔者通过RT-qPCR检测发现，抑郁症模型中miR-373的表达水平显著低于正常小鼠（P < 0.01，图2A）。随后，向抑郁症模型小鼠中注射ago-miR-373以过表达miR-373取探讨对抑郁症模型抑郁样行为的影响。RT-qPCR结果显示，过表达miR-373显著上调模型小鼠中miR-373的表达水平（P < 0.01，图2B）。此外，相比于CUS组，过表达miR-373能够上调模型小鼠的蔗糖偏爱度和社交时间（P < 0.05，图2C和2F），并且下调FST和TST中模型小鼠的不动时间（P < 0.01，图2D-E）。综上数据可知，过表达miR-373能够缓解抑郁症模型小鼠抑郁样行为。
图 2 miR-373缓解抑郁症模型小鼠抑郁样行为A和B：RT-qPCR检测小鼠中miR-373表达水平的结果。抑郁症小鼠模型尾静脉注射ago-miR及ago-miR-373，测量抑郁样行为的结果：C：SPT；D：FST；E：TST；F：SIT。注：图2A，与Con组比较，*P < 0.05，**P < 0.01；图2B，与ago-miR（无意义序列）比较，*P < 0.05，**P < 0.01；图2C-F，与CUS组比较，*P < 0.05，**P < 0.01。Figure 2. miR-373 alleviates depression-like behavior in depression model mice2.3 P2X7R是miR-373的靶基因
笔者通过TargetScan预测miR-373下游靶标发现，P2X7R与miR-373存在潜在的3' UTR结合区域。随后，对潜在的结合区域进行了突变，并且进行了双荧光素酶报告基因实验（图3A）。结果显示，miR-373能够显著抑制野生型载体中P2X7R的荧光素酶活性（P < 0.01，图3B），但是对突变型载体中P2X7R的荧光素酶活性无显著性影响。进一步，笔者检测了小鼠中，miR-373对P2X7R蛋白和mRNA表达的影响。Western blotting结果显示，相比于CUS组，ago-miR-373组中P2X7RR蛋白和mRNA的表达水平显著下调（P < 0.01，图3C-D）。此外，笔者还发现，CUS组中CUS组P2X7RR蛋白和mRNA的表达水平显著高于Con组（P < 0.01，图3C-D）。以上结果表明，P2X7RR在小鼠模型中异常高表达，且miR-373能够靶向负调控P2X7RR的表达水平。
图 3 P2X7R是miR-373的靶基因A：TargetScan预测miR-373与P2X7R潜在结合区域的示意图；B：双荧光素酶验证miR-373与P2X7R的靶向关系；C：Western blotting检测各组小鼠中P2X7R蛋白的表达水平；D：RT-qPCR检测各组小鼠中P2X7R mRNA的表达水平。横线两端所示的2组比较，**P < 0.01。Figure 3. P2X7R is a targe gene of miR-3732.4 miR-373抑制小鼠海马层中小胶质细胞的激活
目前，科学界普遍认为抑郁症是一种小胶质细胞疾病，且P2X7R在小胶质细胞的激活中具有积极的意义[21, 22]。因此，笔者进一步探讨miR-373对小鼠大脑海马层小胶质细胞表型的影响。首先我们选择了Iba-1作为小胶质细胞的标志物，OX-42作为小胶质细胞活化的标志物，并且进行了IF双染小鼠海马层。结果显示，Iba-1和OX-42共表达于小胶质细胞核外（图4A）。相比于Con组，CUS组中Iba-1和OX-42的荧光强度显著增强（P < 0.01，图4A），且过表达miR-373能够回复Iba-1和OX-42的荧光强度（P < 0.01，图4A）。随后，笔者通过IF双染了小鼠海马层中的P2X7R和Iba-1，结果显示，抑郁症模型小鼠海马层小胶质细胞中P2X7R的荧光强度显著高于Con组，且过表达miR-373能够显著抑制P2X7R的荧光强度（P < 0.01，图4B）。此结果与之前Western blotting结果一致。由以上数据可知，抑郁症模型小鼠海马层中小胶质细胞呈现异常的高增殖和激活状态，而过表达miR-373能够抑制小胶质细胞的增殖和激活。
图 4 miR-373抑制小鼠海马层中小胶质细胞的激活A：IF双染小鼠海马层中小胶质细胞标志物Iba-1和小胶质细胞活化标志物OX-42的结果和相对荧光强度统计图，红色箭头表示激活的小胶质细胞；B：IF双染小鼠海马层中P2X7R和Iba-1的结果和相对荧光强度统计图，红色箭头表示表达P2X7R的小胶质细胞。横线两端所示的2组比较，**P < 0.01。Figure 4. miR-373 inhibits the activation of microglia in mice hippocampus2.5 miR-373抑制小鼠海马层中小胶质细胞焦亡
此前已有文献报道，P2X7R调控小胶质细胞焦亡介导抑郁症的发展进程[23]。因此，笔者进一步探讨了miR-373对小鼠海马层中小胶质细胞焦亡的影响。首先笔者通过Westernblotting和RT-qPCR检测了小鼠海马层中细胞焦亡相关蛋白和mRNA的表达水平。结果显示，相比于Con组，CUS组中caspase-1，NLRP3，IL-1β和IL-18蛋白和mRNA及c-caspase-1蛋白的表达水平均显著上调（P < 0.05，见图5A-B）。此外，相比于CUS组，ago-miR-373组中caspase-1，NLRP3，IL-1β和IL-18蛋白和mRNA及c-caspase-1蛋白的表达水平均显著下调（P < 0.05），见图5A-B。进一步，笔者检测了小鼠海马层中小胶质细胞凋亡水平。结果显示，CUS组中小胶质细胞的凋亡水平显著高于Con组，而ago-miR-373组中小胶质细胞凋亡水平显著低于CUS组（P < 0.01），见图5C。由以上数据可知，miR-373能够缓解抑郁症小鼠海马层中小胶质细胞焦亡。
图 5 miR-373抑制小鼠海马层中小胶质细胞焦亡A：Westernblotting检测的结果和蛋白相对表达的统计图。B：RT-qPCR检测的结果和mRNA相对表达的统计图。C：TUNEL实验检测小鼠海马层中小胶质细胞凋亡水平结果及统计图。横线两端所示的两组比较，**P < 0.01。Figure 5. miR-373 inhibits pyroptosis of microglia in mice hippocampus3. 讨论
转录调控的改变可能会对MDD和相关精神疾病造成遗传风险[24]。miRNAs通过抑制翻译或诱导目标mRNA降解来负调节基因表达。在哺乳动物中，预估miRNA可调控所有蛋白质编码基因约50%的活性，并且miRNA的表达失调与包括癌症和精神相关疾病在内的多种人类疾病有关[25]。目前，临床研究已经发现MDD中miRNAs表达改变的证据，并且表明其在MDD发展中具有重要的作用[26-27]。miR-373首先被鉴定为人类胚胎干细胞的特异性miRNA之一。随后，它被证实是潜在的新型致癌基因，在神经系统相关的多种恶性肿瘤和炎症相关疾病中具有重要的意义[28-29]。然而，miR-373与MDD的联系还有待阐述。在本研究中，笔者发现了miR-373在抑郁症小鼠模型中异常低表达，而过表达miR-373能够缓解抑郁症小鼠的抑郁样行为，并抑制海马层中小胶质细胞的激活和焦亡。
患有严重抑郁症的患者表现出炎症反应的所有基本特征，包括外周血和脑脊液中促炎因子及其受体的表达增加以及急性期反应物，趋化因子和可溶性粘附分子的水平升高[7-9]。NLRP3是研究最广泛的NOD样受体之一，在触发小胶质细胞炎症小体介导的神经炎症中发挥重要作用。研究表明，caspase 1和炎症小体NLRP3在DMM患者外周血单个核细胞中的表达增加与血液中IL-1β和IL-18浓度的增加相关，且与DMM的严重程度相关[30]。值得注意的是，caspase 1，NLRP3，IL-1β和IL-18是细胞焦亡途径中重要的调控基因和产物。已有文献表明，小胶质细胞的焦亡会加重DMM的炎症反应，进而促进DMM的发展进程。例如，异寡糖通过抑制miRNA-27a/SYK/NF-κB轴介导的NLRP3表达，从而抑制小胶质细胞焦亡并能够改善DMM表型[31]。芍药苷通过抑制CASP-11/GSDMD通路介导的小胶质细胞焦亡途径具有抗抑郁作用[32]。褪黑激素通过激活SIRT1/Nrf2信号通路抑制小鼠小胶质细胞中NLRP3炎性体的活化和细胞焦亡，从而缓解DMM的抑郁样行为[33]。以上研究均表明，小胶质细胞焦亡在DMM中的重要性。笔者也首次发现了，miR-373对DMM小鼠小胶质细胞焦亡的调控。此外，笔者还发现P2X7R是miR-373的下游靶标。
人类P2X7R基因位于染色体12q24.31区域，该区域和MDD相关[34]。P2X7R是一个不敏感的阳离子选择性离子通道，直接由ATP控制。然而，P2X7R被ATP重复或长时间激活后，P2X7R会加速NLRP3炎性小体的组装，进而促进caspase-1介导的原发性促炎细胞因子IL-1β和IL-18的加工，并且最终会形成一个非选择性孔，加速IL-1β和IL-18等炎性因子的释放[35]。而P2X7R调控的这个途径正是细胞焦亡中依赖caspase-1的经典途径。此外，脑中高水平的IL-1β与抑郁症[36]和神经变性等疾病相关[37]。已有研究表明，CUS处理小鼠会增强海马和前额内侧皮层中P2X7R的表达[38]。P2X7R基因敲除小鼠的抑郁样行为被抑制[39]。此外，在DMM小鼠中，氯胺酮诱导的抗抑郁样作用与海马P2X7R水平降低有关[40]。因此，P2X7R拮抗剂的开发对MDD的治疗具有重要的意义。综合以上研究结果，笔者确定miR-373通过抑制P2X7R的表达水平，从而抑制抑郁症小鼠模型的抑郁样行为，并且能够抑制海马层小胶质细胞的激活和焦亡。
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图 1 抑郁症样小鼠模型构建
A：BALB/c小鼠处理方法和时间示意图。在CUS处理BALB/c小鼠5周后，测量抑郁样行为的结果：B：SPT；C：FST；D：TST；E：SIT。与Con组比较，*P < 0.05，**P < 0.01。
Figure 1. Construction of depression-like mice model
图 2 miR-373缓解抑郁症模型小鼠抑郁样行为
A和B：RT-qPCR检测小鼠中miR-373表达水平的结果。抑郁症小鼠模型尾静脉注射ago-miR及ago-miR-373，测量抑郁样行为的结果：C：SPT；D：FST；E：TST；F：SIT。注：图2A，与Con组比较，*P < 0.05，**P < 0.01；图2B，与ago-miR（无意义序列）比较，*P < 0.05，**P < 0.01；图2C-F，与CUS组比较，*P < 0.05，**P < 0.01。
Figure 2. miR-373 alleviates depression-like behavior in depression model mice
图 3 P2X7R是miR-373的靶基因
A：TargetScan预测miR-373与P2X7R潜在结合区域的示意图；B：双荧光素酶验证miR-373与P2X7R的靶向关系；C：Western blotting检测各组小鼠中P2X7R蛋白的表达水平；D：RT-qPCR检测各组小鼠中P2X7R mRNA的表达水平。横线两端所示的2组比较，**P < 0.01。
Figure 3. P2X7R is a targe gene of miR-373
图 4 miR-373抑制小鼠海马层中小胶质细胞的激活
A：IF双染小鼠海马层中小胶质细胞标志物Iba-1和小胶质细胞活化标志物OX-42的结果和相对荧光强度统计图，红色箭头表示激活的小胶质细胞；B：IF双染小鼠海马层中P2X7R和Iba-1的结果和相对荧光强度统计图，红色箭头表示表达P2X7R的小胶质细胞。横线两端所示的2组比较，**P < 0.01。
Figure 4. miR-373 inhibits the activation of microglia in mice hippocampus
图 5 miR-373抑制小鼠海马层中小胶质细胞焦亡
A：Westernblotting检测的结果和蛋白相对表达的统计图。B：RT-qPCR检测的结果和mRNA相对表达的统计图。C：TUNEL实验检测小鼠海马层中小胶质细胞凋亡水平结果及统计图。横线两端所示的两组比较，**P < 0.01。
Figure 5. miR-373 inhibits pyroptosis of microglia in mice hippocampus
表 1 RT-qPCR引物序列
Table 1. RT-qPCR Primer Series
目标 正向引物（5′-3′） 反向引物（5′-3′） miR-373 ACUCAAAAUGGGGGCGGAAAGC CAGTGCGTGTCGTGGAGT U6 CCCTTCGGGGACATCCGATA TTTGTGCGTGTCATCCTTGC caspase-1 TGGATCTTCACAAGGGCGAC CAACACAGCAACCAGCAGAC NLRP3 CAGGATGGCTCTCGCTTCAT CTGACAGAACCGTGGGACTC IL-1β TGCCACCTTTTGACAGTGATG TTCTTGTGACCCTGAGCGAC IL-18 ACAGGACTGCCATCTTCTGC ATTGTTCCTGGGCCAAGAGG β-actin TTCCAGCCTTCCTTCTTG TGTCAACGTCACACTTCA 
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