Effects of Scutellarin on Expressions of PKC and TNF-α in OX-LDL Injured RAW264.7 Cells in vitro
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摘要:
目的 研究灯盏乙素（scutellarin）对OX-LDL诱导损伤的巨噬细胞RAW264.7脂质吞噬能力及对PKC和TNF-α的蛋白和mRNA表达调控的影响。 方法 体外培养小鼠单核巨噬细胞RAW264.7，复制OX-LDL诱导损伤模型，通过油红O染色检测脂质吞噬及试剂盒检测细胞损伤模型胆固醇酯的含量。Western blot和RT-PCR方法检测RAW264.7细胞中PKC和TNF-α表达变化。 结果（ 1） 油红O结果显示：与正常对照组比较，模型组细胞红染程度明显高于正常对照组；与模型组比较，辛伐他汀组、灯盏乙素50和100 μmol /L组细胞红染程度均低于模型组;（ 2）胆固醇酯含量检测显示:与正常对照组比较，各时间点模型组细胞CE/TC值均明显升高；与模型组比较，各时间点用药组细胞CE/TC值均降低。（ 3） WB和RT-PCR结果显示：与正常对照组比较，模型组PKC和TNF-α的蛋白和mRNA表达升高；与模型组比较，辛伐他汀组(simvastatin) PKC和TNF-α的蛋白和mRNA表达降低，且灯盏乙素组呈浓度依赖性下调PKC和TNF-α的蛋白和mRNA表达。 结论 （1）灯盏乙素能明显抑制OX-LDL诱导损伤的RAW264.7细胞脂质吞噬能力。（ 2） 灯盏乙素能够明显下调OX-LDL诱导损伤的RAW264.7中PKC和TNF-α的蛋白和mRNA表达水平。 -
关键词:
- 灯盏乙素 /
- 巨噬细胞RAW264.7 /
- 氧化型低密度脂蛋白 /
- 蛋白激酶C /
- 肿瘤坏死因子-α
Abstract:Objectives To investigate the effects of scutellarin on lipid phagocytosis and the regulation of PKC, and TNF-α expressions in low density lipoprotein （OX-LDL） injured RAW264.7 cells. Methods Murine RAW264.7 macrophages was cultured in vitro. Then, the OX-LDL-induced injury model was replicated. Combined with oil red O staining, cellular cholesteryl ester content was also detected in OX-LDL-induced injury model. Furthermore, Western blot and RT-PCR methods were used to detect changes in PKC and TNF-α protein as well as mRNA expression in RAW264.7 cells. Results （1） The results of oil red O showed that the degree of cell red staining in model group was significantly higher than that in normal control group; compared with model group, the degree of cell red staining in simvastatin group, scutellarin 50 and 100 μmol/L group were lower than that in the model group; （2） The cholesteryl ester content assay showed that: compared with the normal control group, the CE/TC values of the model group cells were significantly increased at each time point; compared with model group, and cellular CE/TC values were significantly decreased in the dosing group at each time point. （3） WB and RT-PCR results showed that compared with normal control group, protein and mRNA expressions of PKC and TNF-α were increased in the model group; compared with the model group, protein and mRNA expression of PKC and TNF-α were decreased in simvastatin group, and scutellarin group showed a concentration-dependent downregulation of PKC and TNF-α expression. Conclusions （1） Scutellarin can significantly inhibit the levels of cholesterol in OX-LDL injuried RAW264.7 cells. （2） Scutellarin can down-regulated the protein and mRNA expressions of PKC, TNF-α in OX-LDL induced RAW264.7 cells. -
Key words:
- Scutellarin /
- RAW264.7 macrophages /
- oxidized low-density lipoprotein （OX-LDL） /
- PKC /
- TNF-α
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自杀是15～29岁人群的第四大死因[1]，给个人、家庭和社会带来了沉重的伤痛和负担。目前研究[2]认为自杀有心理、社会和生物学三个层面的危险因素，其中心理因素包括：共患精神障碍、抑郁、焦虑、既往有自杀未遂、药物滥用病史；社会因素包括：压力性生活事件（家庭问题和同伴冲突）；生物学因素包括：个性特征（例如：神经质和冲动）。对自杀的研究以往主要集中在用自杀量表测评患者的自杀意念和行为，寻找自杀的生物学机制，例如：铁蛋白、高密度脂蛋白胆固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）有望成为青少年抑郁症患者出现非自杀性自伤行为的潜在预测指标[3]，但目前均没有明确的结论。在临床实践中，当患者表现出抗拒或不配合的态度，特别是在自杀倾向的患者刻意隐藏其真实意图时，识别患者的自杀意图将变得极为困难，这就需要其他方法判断或预测患者的自伤、自杀意图。
研究[4]发现房树人绘画测验（house-tree-person test，HTP）对青少年抑郁水平的监测有一定的参考价值。本项研究创新使用房树人绘画，即一种简单的心理投射测试，不受文化背景限制，通过分析伴有自伤、自杀行为的青少年抑郁障碍患者的绘画特征，反应其潜意识。还有文献[5−7]报道，自伤风险高的人群疼痛阈值较高，对疼痛耐受性也高，在伴有自伤、自杀行为的青少年抑郁障碍患者的疼痛阈值也升高。对伴有自伤、自杀行为的青少年抑郁障碍患者进行房树人绘画测试和疼痛阈值监测，有可能早期发现自伤、自杀的高危险风险因素，有利于早期干预，减少青少年的伤残率，使预防自杀行为端口前移。
1. 资料与方法
1.1 研究对象
收集2023年1月至2024年5月于云南省精神病医院和昆明市精神病院确诊为抑郁发作青少年的研究资料。入组标准：（1）已发生自杀、自伤行为的患者；或无自杀、自伤行为和意念的患者；或发生自伤、自杀行为已超过1月的患者；（2）根据ICD-10标准[8]通过临床会谈诊断或研究现场病例记载曾诊断抑郁状态、抑郁发作和双相情感障碍，目前为抑郁发作；（3）年龄：10～25岁；（4）性别：男女不限；（5）受教育年限≥5年；（6）能理解和阅读汉语，能理解知情同意书。排除标准（出现下列任何一条标准的受试者都不能参加本研究）：（1）精神分裂症、痴呆、神经血管或神经退行性疾病史；（2）头部外伤（意识丧失超过1 h），通过既往史判断；（3）既往和现在正在服用阿片类止痛药物；（4）目前接受的治疗对评估有干扰的；（5）怀孕或哺乳妇女；（6）无法获得患者和监护人知情同意[8]。本研究经昆明市精神病院伦理委员会审批通过（2021001），研究对象及其监护人签署知情同意书。
1.2 调查工具和方法
1.2.1 调查工具
病人健康问卷抑郁量表（patient health questionaire-9 items，PHQ-9），Cronbach's α系数介于0.8～0.9，具有良好的内部一致性[9−12]。该量表基于美国精神疾病诊断与统计手册（diagnostic and statistical manual of mental disorders，DSM-IV）所制定的1种抑郁自评工具，该量表由9个条目组成，4个分值分别为0分（完全不会）、1分（好几天）、2分（超过1周）、3分（几乎每天），分数越高，代表抑郁的可能性越大，总分0～27分。测评结果分别为：正常（分值：1～4）、轻度抑郁（分值：5～9分）、中度抑郁（分值：10～14）、中重度抑郁（分值：15～19）、重度抑郁（分值：20～27），其中，PHQ-9第9题为“有不如死掉或用某种方式伤害自己的念头”，对患者的自杀意念有一定的指导意义。
米式边缘性人格障碍量表（McLean screening instrument for borderline personality disorder，MSI-BPD），该量表该问卷的Cronbach's α系数为0.784[13]，是基于美国精神疾病诊断标准编制的，由10个条目组成，选项为是或否，是为1分，否为0分，分数高，则症状严重。MSI-BPD的10个条目与美国精神疾病诊断与统计手册DSM-IV中BPD诊断标准的前8条各用1条检测项目，而第9条诊断标准，即偏执/分离，用2条检测项目[14−15]。
艾德堡HP-50压力测试仪器，压力单位牛（N），最大负荷50N，分度值0.01N，精度±0.5%。为降低对研究对象的伤害性以及提高疼痛检测的精确性，对仪器进行改进，对5号注射器针头进行打磨，将针尖打磨成钝口为0.5 mm直径的圆形平口，保证对研究对象的皮肤不会造成损伤。
1.2.2 研究方法
量表测评：对入组的患者先完成自编的人口学资料收集，通过病例查询及询问患者及其家属自伤自杀情况，确定自伤自杀日期；通过哥伦比亚自杀严重程度评定量表（Columbia-suicide severity rating scale，C-SSRS）评定患者的自杀意念和自杀的情况[16]；PHQ-9抑郁检测量表评定抑郁程度，用MSI-BPD评定人格特征。
房树人测验：使用标准化指导语：“请你用铅笔在这张A4纸上任意画一幅包括房子、树和人物在内的画，你想怎么画就怎么画，但是要求你必须认真低画，不要采取写生或临摹的方式，也尽量不要用尺子，时间不限，也可以涂擦”，让患者独立完成房树人绘画。对绘画特征采用单盲方法进行分析，由3名未参与研究的应用心理学专业人士及精神科护士，在不了解分组信息的情况下，对每幅画作的各个特征进行分类。在出现分歧时，以两人一致同意的特征为准。
对研究对象进行疼痛阈值测定：在保证研究无传染的情况下，对入组对象进行疼痛阈值测试。研究对象以利手中指指腹区域为疼痛测试点，该指腹贴紧5号注射器打磨后的针尖，自主向上用力对压力器施压，当感觉疼痛时停止，检测进行3次，记录检测结果，计算其平均值。检测完毕后，及时对钝形针口进行严格消毒。
1.3 统计学分析
所得数据用Excel软件建立数据库分析，采用 SPSS 27.0 版统计软件，两组患者采集到的数值进行比较，因考虑药物治疗影响，一般药物治疗2～4周开始起效[17]，故在96例研究数据中以30 d作为分组界限，其中定量资料（如PHQ-9、MSI-BPD分值等）应用独立样本t检验、二元Logistic回归分析等进行分析；定性资料（如性别、民族、房树人绘画特征等）应用卡方检验等进行分析，P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 两组青少年抑郁研究对象一般人口学资料
收集96例研究对象完整资料，对其进行分组，30 d及以内自伤自杀的研究对象为案例组，30 d以上或无自伤自杀行为的研究对象为对照组。案例组61例，其中男性11例（18.0%），女性50例（82.0%），对照组35例，其中男性15例（42.9%），女性20例（57.1%）。两组的性别、年龄比较，差异具有统计学意义，30 d内有自伤或自杀行为病例组，女性比例更高，年龄更小（χ2性别=6.940、t年龄=2.132，P < 0.05），见表1。
表 1 两组抑郁症患者的一般资料比较[n（%）/（$ \bar x \pm s $）]Table 1. Comparison of general data of two groups of patients with depression[n（%）/（$ \bar x \pm s $）]项目 30 d内自伤
自杀者30 d以上自伤
自杀者t/Z/χ2 P 性别 6.940 0.008** 男 11（18.0） 15（42.9） 女 50（82.0） 20（57.1） 年龄（岁） 16.46±3.23 17.86±2.84 2.132 0.036* 民族 0.498 0.480 汉族 43（70.5） 27（77.1） 少数民族 18（29.5） 8（22.9） 是否抽烟 3.855 0.050 是 22（36.1） 6（17.1） 否 39（63.9） 29（82.9） *P < 0.05；**P < 0.01。 2.2 两组青少年抑郁患者PHQ-9和MSI-BPD得分比较
因PHQ-9题为“有不如死掉或用某种方式伤害自己的念头”，能够对患者的自杀意念进行检测，故将此题结果进行分析。案例组的PHQ-9总分、PHQ-9第9题得分和MSI-BPD总分均高于对照组。经独立样本t检验分析，差异均有统计学意义（tP=-6.054，tPHQ第9题=-6.487，tM=-4.197，P < 0.01），见表2。
表 2 案例组和对照组分别在PHQ-9、MSI-BPD量表的分析（$ \bar x \pm s $）Table 2. Analysis of PHQ-9 and MSI-BPD scales in the case group and control group（$ \bar x \pm s $）变量 分组（n=96） 得分 t P PHQ-9 案例组（n=61） 19.59±5.99 −6.054 <0.001** 对照组（n=35） 10.89±7.99 “有不如死掉或用某种方式伤害自己的念头”（PHQ-9第9题） 案例组（n=61） 2.41±0.97 −6.487 <0.001** 对照组（n=35） 1.00±1.11 MSI-BPD 案例组（n=61） 7.43±1.61 −4.197 <0.001** 对照组（n=35） 5.40±3.13 **P < 0.01。 2.3 两组HTP绘画特征频率比较
根据相关文献研究，假设以下47项绘画特征可能与抑郁青少年自伤自杀行为有关，绘画特征分别是：整体5项特征、房11项特征、树9项特征、其他元素10项。对以上47项绘画特征进行卡方检验，结果显示，案例组有5项绘画特征的差异有统计学意义（P < 0.05），分别是重心偏移、头发、山、太阳和花草，其中，重心偏移、头发不凌乱或无头发、无山、无太阳和无花草出现的比例更高，见表3。
表 3 绘画特征频率比[n （%）]（1）Table 3. Drawing feature frequency ratio [n （%）]（1）编号 绘画特征 选项 案例组（n=61） 对照组（n=35） χ2 P 整体 A1 篇幅 大 33（54.1） 23（65.7） 1.235 0.267 小 28（45.9） 12（34.3） A2 重心偏移 是 40（65.6） 14（40.0） 5.910 0.015* 否 21（34.4） 21（60.0） A3 纸张 横 60（98.4） 35（100） 0.580 0.446 竖 1（1.6） 0（0.0） A4 笔墨 浓 21（34.4） 14（40.0） 0.298 0.585 浅 40（65.6） 21（60.0） A5 HTP占比最大 房 37（60.7） 25（71.4） 3.043 0.218 树 20（32.8） 6（17.1） 人 4（6.6） 4（11.4） 房 H1 屋顶 涂黑 5（8.2） 4（11.4） 0.273 0.601 不涂黑 56（91.8） 31（88.6） H2 房切 是 10（16.4） 3（8.6） 1.162 0.281 否 51（83.6） 32（91.4） H3 房子类型 独栋房 44（72.1） 30（85.7） 3.210 0.201 楼房 9（14.8） 4（11.4） 其它 8（13.1） 1（2.9） H4 房子栋数 一栋 51（83.6） 30（85.7） 0.075 0.784 多栋 10（16.4） 5（14.3） H5 窗子 大 9（14.8） 8（22.9） 1.599 0.450 小 39（63.9） 18（51.4） 无 13（21.3） 9（25.7） H6 门 大 16（26.2） 8（22.9） 0.186 0.911 小 36（59.0） 21（60.0） 无 9（14.8） 6（17.1） H7 房门形状 拱形 9（14.8） 7（20.0） 0.640 0.726 方形 43（70.5） 22（62.9） 无 9（14.8） 6（17.1） H8 房子立体感 立体 17（27.9） 9（25.7） 0.656 0.720 不立体 43（70.5） 26（74.3） 两者都有 1（1.6） 0（0.0） H9 烟囱 有 13（21.3） 6（17.1） 0.243 0.622 无 48（78.7） 29（82.9） H10 窗帘 有 4（6.6） 2（5.7） 0.027 0.870 无 57（93.4） 33（94.3） H11 门把手 有 38（62.3） 20（57.1） 0.247 0.619 无 23（37.7） 15（42.9） 树 T1 树冠 圆形 42（68.9） 24（68.6） 0.001 0.977 其他 19（31.1） 11（31.4） *P < 0.05。 表 3 绘画特征频率比[n （%）]（2）Table 3. Drawing feature frequency ratio [n （%）]（2）编号 绘画特征 选项 案例组（n=61） 对照组（n=35） χ2 P T2 树枝树叶 有 22（36.1） 12（34.3） 0.031 0.861 无 39（63.9） 23（65.7） T3 树落叶 有 4（6.6） 1（2.9） 0.617 0.432 无 57（93.4） 34（97.1） T4 树干 粗 30（49.2） 19（54.3） 0.232 0.630 细 31（50.8） 16（45.7） T5 树疤痕 有 7（11.5） 4（11.4） 0.000 0.994 无 54（88.5） 31（88.6） T6 树果实 有 7（11.5） 4（11.4） 0.000 0.994 无 54（88.5） 31（88.6） T7 树根 有 24（39.3） 7（20.0） 3.806 0.051 无 37（60.7） 28（80.0） T8 树切 切 12（19.7） 8（22.9） 0.137 0.711 不切 49（80.3） 27（77.1） T9 树类型 传统树 48（78.7） 25（71.4） 0.643 0.422 其他 13（21.3） 10（28.6） 人 P1 火柴人 是 32（52.5） 18（51.4） 0.009 0.923 否 29（47.5） 17（48.6） P2 手掌 有 17（27.9） 15（42.9） 2.248 0.134 无 44（72.1） 20（57.1） P3 五官 有 38（62.3） 26（74.3） 1.439 0.230 无 23（37.7） 9（25.7） P4 人物数量 1人 43（70.5） 19（54.3） 2.554 0.110 多人 18（29.5） 16（45.7） P5 头发 凌乱 3（4.9） 8（22.9） 7.078 0.029* 不凌乱 29（47.5） 13（37.1） 无 29（47.5） 14（40.0） P6 表情 微笑 24（39.3） 18（51.4） 1.511 0.680 不微笑 13（21.3） 7（20.0） 皆有 2（3.3） 1（2.9） 无 22（36.1） 9（25.7） P7 姿势 站立 58（95.1） 32（91.4） 0.507 0.776 坐姿 2（3.3） 2（5.7） 皆有 1（1.6） 1（2.9） P8 人物张口 是 2（3.3） 2（5.7） 0.330 0.565 否 59（96.7） 33（94.3） P9 脚掌 有 19（31.1） 9（25.7） 0.318 0.573 无 42（68.9） 26（74.3） P10 耳朵 有 5（8.2） 2（5.7） 0.203 0.653 无 56（91.8） 33（94.3） P11 服饰 有 25（41.0） 16（45.7） 0.203 0.652 无 36（59.0） 19（54.3） P12 人切 切 7（11.5） 7（20.0） 1.297 0.255 不切 54（88.5） 28（80.0） *P < 0.05。 表 3 绘画特征频率比[n （%）]（3）Table 3. Drawing feature frequency ratio [n （%）]（3）编号 绘画特征 选项 案例组（n=61） 对照组（n=35） χ2 P 其他元素 E1 围墙栅栏 有 9（14.8） 4（11.4） 0.210 0.647 无 52（85.2） 31（88.6） E2 花草 有 9（14.8） 17（48.6） 12.879 <0.001** 无 52（85.2） 18（51.4） E3 动物 有 7（11.5） 7（20.0） 1.297 0.255 无 54（88.5） 28（80.0） E4 路 有 13（21.3） 12（34.3） 1.944 0.163 无 48（78.7） 23（65.7） E5 水 有 12（19.7） 5（14.3） 0.443 0.506 无 49（80.3） 30（85.7） E6 太阳 有 8（13.1） 13（37.1） 7.513 0.006** 无 53（86.9） 22（62.9） E7 云 有 9（14.8） 11（31.4） 3.749 0.053 无 52（85.2） 24（68.6） E8 山 有 3（4.9） 8（22.9） 7.054 0.008** 无 58（95.1） 27（77.1） E9 石子 有 4（6.6） 2（5.7） 0.027 0.870 无 57（93.4） 33（94.3） E10 旗帜 有 1（1.6） 3（8.6） 2.676 0.102 无 60（98.4） 32（91.4） **P < 0.01。 2.4 绘画特征对于抑郁青少年自伤自杀行为的Logistic回归分析
以30 d内是否有自伤自杀行为为因变量，PHQ-9总分、MSI-BPD总分、PHQ-9第9题（“有不如死掉或用某种方式伤害自己的念头”）得分、5项在卡方检验有显著意义的绘画特征（重心偏移、头发不凌乱或无头发、无山、无太阳和无花草绘画特征）为自变量，进行二元逻辑回归分析，经过向前逐步回归建模，分类变量参考类别：第一个，PHQ-9总分、MSI-BPD总分、4项绘画特征：重心偏移、头发不凌乱或无头发、无山、无太阳均无统计学意义未纳入方程，而PHQ-9第9题得分、无花草绘画特征回归方程模型显著：OR无花草=7.934，P无花草<0.05；ORPHQ-9第9题得分=3.554，PPHQ-9第9题得分<0.05，结果显示，无花草、PHQ-9第9题得分是青少年抑郁症患者30 d内出现自伤或自杀行为的危险因素，见表4。
表 4 无花草元素对于抑郁青少年30 d及以内自伤自杀行为的Logistic回归分析Table 4. Logistic regression analysis of the effect of no-flowering plant elements on suicidal behavior of depressed adolescents within 30 days自变量 B S.E. Wald Sig. NagelkerkeR2 Exp（B） B的95%CI 下限 上限 无花草 2.071 0.694 8.900 0.003* 0.544 7.934 2.035 30.936 “有不如死掉或用某种方式
伤害自己的念头”（PHQ-9第9题）1.268 0.282 20.273 0.000** 0.544 3.554 2.047 6.174 分类自变量参考类别：第1个。*P < 0.05；**P < 0.01。 2.5 两组疼痛阈值组人口学资料比较
在研究中有72例研究对象自愿进行疼痛测试，其中男性26人（36.11%），女性46人（63.89%），以2 d内有无自伤或自杀行为进行分组，2 d内有自伤或自杀行为的研究对象为案例组，案例组12例，其中男性6例（50.0%），女性6例（50.0%），2 d以上或无自伤或自杀行为的研究对象为对照组，对照组60例，其中男性20例（33.3%），女性40例（66.7%），两组在人口变量学中差异无统计学意义（P > 0.05），见表5。
表 5 一般资料比较[n（%）/（$ \bar x \pm s $）]Table 5. General data comparison [n（%）/（$\bar x \pm s $）]项目 案例组 对照组 t/Z/χ2 P 性别 1.204 0.273 男 6（50.0） 20（33.3） 女 6（50.0） 40（66.7） 年龄（岁） 16.33±2.39 16.50±2.01 0.254 0.800 民族 0.701 0.403 汉族 10（83.3） 43（71.7） 少数民族 2（16.7） 17（28.3） 是否抽烟 2.566 0.109 是 6（50.0） 16（26.7） 否 6（50.0） 44（73.3） 2.6 两组在疼痛阈值的分析
将两组PHQ-9总分、PHQ-9第9题“有不如死掉或用某种方式伤害自己的念头”、MSI-BPD总分、3次疼痛测试结果及平均值分别进行独立样本t检验，PHQ-9量表得分、MSI-BPD总分、第二次测试疼痛阈值均差异不显著，2 d有自伤自杀行为组PHQ-9第9题得分更高，差异具有统计学意义（t = -2.201，P < 0.05）。3次测试疼痛阈值的平均值2 d有自伤自杀行为组疼痛阈值更高，差异有统计学意义（t = -2.289，P < 0.05）。第一、三次测试疼痛阈值比较，差异有统计学意义（t第一次=-2.301，t第三次=-2.424，P < 0.05），见表6。
表 6 两组患者PHQ-9量表与皮肤压痛阈值比较（$ \bar x \pm s $）Table 6. Comparison of PHQ-9 scale and skin tenderness threshold between two groups comparison of general data（$ \bar x \pm s $）项目 2 d有自伤自杀行为组（n=12） 2 d以上有自伤或无自伤行为组（n=60） t P PHQ-9总分（分） 20.58±3.09 18.22±4.40 −1.758 0.083 “有不如死掉或用某种方式
伤害自己的念头”（PHQ-9第9题）（分）2.50±0.67 1.87±0.95 −2.201 0.031* MSI-BPD总分（分） 7.75±0.87 6.82±1.79 −1.758 0.083 疼痛阈值平均值（N） 8.83± 4.27 6.48±3.00 −2.289 0.025* 第一次疼痛阈值（N） 8.14± 3.97 5.92±2.86 −2.301 0.024* 第二次疼痛阈值（N） 8.67± 4.38 6.71±3.36 −1.750 0.085 第三次疼痛阈值（N） 9.66± 5.10 6.83±3.38 −2.424 0.018* *P < 0.05。 3. 讨论
在心理学领域，投射测验作为一种人格评估工具，其目的在于引导个体对含糊不清的刺激作出反应，从而可能揭露个体在测验过程中所投射的潜在情绪及内在冲突。投射测验有助于被试者绕过本能的防御机制，进而揭示其内心深处的真实想法与情感。HTP绘图测验便是一项非常重要的投射测验。心理学家Buck于1948年提出房树人绘画测验，在进行测验时，向参与者提供3张尺寸相同的白纸，并要求他们在每张纸上分别绘制出房屋、树木和人物的图画，其中房是对家庭的投射、树是对环境投射、人是对自我的投射[18]。
3.1 两组PHQ-9、MSI-BPD结果分析
在本研究96例数据分析中发现：两组分别在性别、年龄上存在显著性差异，说明急性期伴有自杀或自伤行为的抑郁症患者可能多为女性，且年龄更小。两组在PHQ-9 [案例组（19.59±5.99）分VS对照组（10.89±7.99）分]、MSI-BPD [案例组（7.43±1.61）分VS对照组（5.40±3.13）分]得分存在显著性差异（P < 0.05），说明急性期伴有自杀或自伤行为的抑郁症患者的抑郁程度更为严重，患有边缘性人格障碍的可能性也更高。既往的研究表明[19]，在抑郁症患者中，自伤与自杀企图有很强的关系，自伤的存在与增加自杀的欲望和能力是密切相关。本研究所使用的PHQ-9量表的第9个条目（是否有自杀意念或自杀企图）在96例[案例组（2.41±0.97）分VS对照组（1.00±1.11）分]两组间的分布结果差异有统计学意义（P < 0.05），急性期伴有自杀或自伤行为的抑郁症患者，存在更严重的抑郁和更高的自杀意念或自杀企图。并且在二元逻辑回归分析中，PHQ-9第9题得分回归模型显著，ORPHQ-9第9题得分=3.554，PPHQ-9第9题得分<0.05，有更强的自杀意念或自杀企图是青少年抑郁症患者出现自伤或自伤行为的危险因素。
3.2 两组房树人绘画结果分析
抑郁程度严重时，在30 d以内出现自杀或自伤行为的青少年抑郁患者的HTP绘画中会出现5个绘画特征，分别是重心偏移、头发不凌乱或无头发、无山、无太阳和无花草。通过卡方检验和Logistic回归分析，发现有自伤或自杀行为的青少年抑郁患者中，在HTP绘画中危险因素是画中没有出现花草。对应的心理机制可能是花草具有生命力的，是生命的象征，也反映个体心理能量提升，但无花草可能提示绘画者心境处于低落状态，反应出绘画者可能对未来生活的迷茫及希望较低。相关研究表明：累积风险对青少年自伤行为的影响具有跨时间的稳定性[20]。花草绘画特征的缺失也可能象征其面临的风险因素。但本研究中研究对象为住院患者，部分已经接受治疗的患者可能心境渐渐平稳，所作出之画也可能发生变化。后续可以从多方面进行探索，例如急性自杀期和治疗后绘画比较、创伤象征的绘画元素等。
3.3 两组皮肤压痛阈值分析
研究发现抑郁青少年伴非自杀性自伤（non-self-inflicted suicide，NSSI）行为的发生率较高，还发现自伤增加了皮肤压痛阈值和疼痛耐受力，此外，还有研究发现目前自伤的人皮肤压痛阈值最高，其次是曾经自伤的人和健康对照组[21−22]。 在72例两组（案例组n = 12，对照组n = 60）分析中，PHQ-9量表得分[案例组（20.58±3.09）分VS对照组（18.22±4.40）分）]、MSI-BPD总分[案例组（7.75±0.87）分VS对照组（6.82±1.79）分]无显著差异（P > 0.05），在抑郁严重程度边缘性人格障碍得分相同的情况下，两组PHQ—9的第9题得分[案例组（2.50±0.67）分VS对照组（1.87±0.95）分]比较，差异具有统计学意义（P < 0.05），说明急性期伴有自杀或自伤行为的抑郁症患者存在更高的自杀意念或自杀企图。本研究还发现在2 d内出现自伤或自杀行为的青少年抑郁患者皮肤压痛阈值（8.83± 4.27）N明显高于时间超过2 d的患者（6.48±3.00）N，2 d内自伤自杀患者比2 d外的患者的疼痛阈值更高。压痛阈值升高可能是抑郁症青少年出现自伤自杀行为后大脑反应性的增加了镇痛物质的释放，有利于机体对疼痛的耐受，是对机体受伤后的一种保护机制，但亦或是出现自伤或自杀行为的生物学异常标志。相关研究表明β-内啡肽和神经降压素系统的异常可能是自杀未遂者痛阈升高的基础[23]，说明对疼痛调整起到重要作用的脑内阿片系统的异常可能是自杀或自伤的核心生物学机制之一，这值得进一步研究寻找生物标记物，例如血中α-内啡肽、β-内啡肽和脑啡肽等。
3.4 本研究的局限性
本研究也存在一些不足：（1）无法证明疼痛阈值升高是受伤后的正常生理反应或是出现自杀或自伤的起始因素；（2）2 d内急性自伤或自杀病例较少，研究结论可能存在假阳性。后续研究可加入对生物标志物等研究变量，进行前瞻性队列研究。
综上所述，患有抑郁症的青少年患者出现自伤或自杀行为与HTP的某些绘画特征、自杀意念及企图和痛觉阈值相关，这些因素可以为针对青少年NSSI行为的风险评估及预防干预提供信息，以减少青少年抑郁症患者自伤、自杀行为的发生。在对患有抑郁症的青少年进行自杀评估时，可先询问其自伤自杀意志，若患者存在隐瞒或未清晰表明其想法时，可结合HTP绘画特征对其绘画进行分析，进一步测试其压痛耐受，筛查细化其自伤自杀意图，防止漏查，以减少青少年抑郁症患者自伤、自杀行为的发生。
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图 2 OX-LDL诱导损伤RAW264.7细胞的油红O染色（400×）
Figure 2. Oil red O staining of OX-LDL injured RAW264.7 cells （400×）
图 3 灯盏乙素对OX-LDL诱导损伤的RAW264.7内脂质的影响[（
$\bar x \pm s$ ），n = 6]Figure 3. Effects of Scutellarin on OX-LDL injured RAW264.7 cells lipid levels [（
$\bar x \pm s$ ），n = 6]
图 4 灯盏乙素对OX-LDL损伤的RAW264.7中PKC和TNF-α蛋白表达的影响[（
$ \bar x \pm s $ ），n = 6]注：a：PKC和TNF-α的蛋白表达电泳图；b,c：细胞损伤模型中PKC和TNF-α蛋白表达变化。用ImageJ 1.4.3.67对蛋白条带进行统计分析，βactin是内参。与空白对照组相比较，#P < 0.05；与模型组比较，*P < 0.05，**P < 0.01。
Figure 4. Effects of scutellarin on OX-LDL induced RAW264.7 cells PKC and TNF-α protein expression [（
$ \bar x \pm s $ ），n = 6]
图 5 灯盏乙素对OX-LDL诱导的RAW264.7中PKC和TNF-α的mRNA表达的影响[（
$ \bar x \pm s $ ），n = 6]注：a，b：细胞损伤模型中PKC和TNF-α的 mRNA表达变化。与空白对照组相比较，#P < 0.05；与模型组比较，*P < 0.05，**P < 0.01。
Figure 5. Effects of Scutellarin on OX-LDL induced RAW264.7 cells PKC and TNF-α mRNA expression [（
$ \bar x \pm s $ ），n = 6]表 1 引物序列
Table 1. Primer sequence
基因名称 双向引物序列 β-actin Forward：5′ TGAGAGGGAAATCGTGCGTGAC 3′ Reverse：5′ GCTCGTTGCCAATAGTGATGACC 3′ PKC Forward：5′ TCACCAAGGAATCCAAGGAC3′ Reverse：5′ CCAGGAGGGACCAGTTGATA3′ TNF-α Forward：5′ ACGGCATAAATCTCAAAGAC 3′ Reverse：5′ GTGGGTGAGGAGCACGTAGT 3′ 
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