Correlation between Changes of Vaginal Microflora and Premature Rupture of Membranes during Pregnancy
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摘要:
目的 通过对正常妊娠与胎膜早破孕妇的阴道微生物群落分析，阐明阴道菌群变化与胎膜早破的相关性。 方法 随机收集符合纳入标准的不同孕周阶段胎膜早破孕妇阴道分泌物50例为实验组，正常孕妇阴道分泌物30例为正常对照组，提取细菌DNA后用高通量测序技术，分析比较胎膜早破与正常孕妇阴道微生物群落的多样性指数及群落结构。 结果 各组的Alpha多样性丰富度及均匀度指数，差异无统计学意义（P > 0.05），各组菌群非度量多维尺度分析（nonmetric multidimensional scaling, NMDS）Stress = 0.02,差异具有统计学意义（ P < 0.05）。根据维恩图显示未足月胎膜早破组的物种多样性最高，为529个；未足月正常对照组组的多样性最低，为207个。 结论 正常孕期阴道菌群较稳定，Alpha多样性小,Beta多样性显著。妊娠期阴道微生物群落以卷曲乳杆菌为主，若孕期阴道内菌群多样性增加，惰性乳杆菌、加德纳菌、纤毛菌、普氏菌、奇异菌等异常增加，易发生细菌性阴道病、胎膜早破。 Abstract:Objective To elucidate the relationship between vaginal microbiota and premature rupture of membranes by analyzing the vaginal microbiota of normal pregnancy and pregnant women of premature rupture of membranes. Methods Gestational age meeting inclusion criteria was randomly collected （gestational age < 28 weeks; 28 to 34 weeks; 34 and 37 weeks; 37 to 39 weeks; each case was 10 at 39-41 weeks） , a total of 50 cases of vaginal secretions from pregnant women with premature rupture of membranes were used as the experimental group. Vaginal secretions were collected from 6 normal pregnant women at the above relative gestational age, and a total of 30 normal women were selected as the control group. The bacterial DNA of vaginal secretions was extracted by the second generation high throughput sequencing method, and the diversity index, microbial community structure and dominant species of vaginal microbiome were analyzed and compared between premature rupture of membranes and normal pregnant women. Results The P value of Wilcoxon test for Alpha diversity richness and evenness index among each group was > 0.05, The Stress value of nonmetric multidimensional scaling was = 0.02, less than 0.05, the difference was statistically significant. According to Venn diagram, the species diversity of preterm premature rupture of membranes was the highest （529）. The diversity of normal control group before term was the lowest （207）. Conclusions In normal pregnancy, vaginal microflora is stable, with small Alpha diversity and significant Beta diversity. Vaginal microbial community during pregnancy can be divided into five types, mainly L. crispatus , if the increase of L.iners, gardnella, prevotella,sneathia , ureaplasma and atopobium etc in the vagina during pregnancy, bacterial vaginosis and premature rupture of membranes are prone to occur. -
在正常情况下，女性阴道内微生物群落主要由乳酸杆菌组成，它能维持阴道的酸性环境，有抑菌保护作用[1-2]，与其他细菌共同形成了一个相对平衡的群落。孕期由于雌激素增多、免疫力低下等生理环境及结构的变化[3]，阴道菌群失衡，易引起各种阴道炎，如细菌性阴道病（bacterial vaginosis，BV）、霉菌性阴道炎等疾病[4]。这些致病菌上行感染易导致胎膜早破（premature rupture of membranes，PROM）、早产、绒毛膜羊膜炎等不良妊娠结局。孕期阴道炎以BV对妊娠结局影响最为严重，且多为无症状感染者，增加了孕期临床医生发现的难度。目前临床上越来越多的人重视BV与PROM、早产等不良妊娠的研究，这也是产科研究的热门课题[5]。阴道微生物群落以厌氧菌居多，培养困难，因此通过传统的培养方法很难全面认识阴道内菌群结构[6-7]。随着分子生物学技术的发展，第2代高通量测序技术越来越多的被用于微生物群落的研究，它能更全面、更准确的认识阴道菌群结构[8]，为全面分析孕期阴道菌群结构提供了可能。因此本文利用Illumina 高通量测序技术，通过对比分析胎膜早破与正常妊娠孕妇阴道菌群结构，以期对预防和治疗胎膜早破提供理论支持。
1. 资料与方法
1.1 一般资料
随机收集2020年1月至2020年12月在昆明医科大学第二附属医院住院分娩的孕周 < 28周；28～34周；34～37周；37～39周；39～41周各10例共50例胎膜早破者为试验组（TMZPZ）；随机选取符合纳入标准的30例正常妊娠为对照组（Control），其中未足月胎膜早破30例（PPROM）、未足月正常组18例（WZY）、足月胎膜早破组20例（PROM）、足月正常组12例（ZY）。年龄平均范围：28.7～30.6（29.64±0.48）岁，参与本研究的所有患者均签署知情同意书，并获得本院伦理委员会批准（伦理审批号：审-PJ-2019-50）。
1.2 纳入与排除标准
1.2.1 纳入标准[9]
（1）单胎妊娠；（2）昆明医科大学第二附属医院常规产检、分娩的孕妇；（3）选取经临床诊断为胎膜早破的为实验组；（4）阴道分泌物分析（细菌）白带清洁度I° ～II° 、阴道分泌物培养阴性的且胎膜完整的为正常对照组。
1.2.2 排除标准[9]
（1）双胎妊娠；（2）有生殖道畸形的孕妇（如双子宫、纵隔子宫畸形等）；（3）合并妊娠期内外科感染相关性疾病；（4）患急慢性传染病的孕妇；（5）近1月应用抗生素、免疫抑制剂或阴道局部用药者；（6）近3 d做过妇检或阴道B超、阴道冲洗、近3 d有性生活等；（7）资料缺失及中途退出研究。
1.3 研究方法
1.3.1 样本的采集
签署知情同意书后，严格消毒后，由产科医师用窥阴器窥开阴道，用无菌棉拭子在阴道后穹窿分别提取阴道分泌物，分别放置在3个无菌试管中，并进行分组、编号、保存及送检。
1.3.2 阴道分泌物分析及微生物DNA提取
其中2个阴道分泌物样本送至本院检验科行常规分析，另一样本送昆明汉岭生物科技有限公司，利用E.Z.N.A.®Stool DNA Kit试剂盒完成样本微生物DNA提取、检测。
1.4 高通量测序
利用细菌16 s rDNA V3+V4区域通用引物对16 s rDNA基因可变区（V3+V4）采用高保真DNA聚合酶进行PCR扩增。纯化、质控后使用MiSeq测序仪进行2×300 bp的双端测序。
1.5 数据分析
对原始的下机数据拆分、拼接、过滤、有效数据去噪等，获得最终的feature特征表[10]。根据feature注释结果，利用SILVA（Release 132， https://www.arb-silva.de/documentation/release-132/）以及NT-16S数据库做物种分类及后续分析。利用丰富度、均匀度指数、非度量多维尺度分析描述阴道菌群的Alpha多样性及Beta多样性分析，最后在门、属、种水平等级分析阴道菌群结构。
1.6 统计学处理
采用SPSS 26.0软件进行数据分析。计量资料用（
$\bar x \pm s $ ）表示，2组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，事后两两比较采用LSD检验；P < 0.05表示差异有统计学意义。2. 结果
2.1 样品序列统计和稀释曲线
通过对80例孕妇资料收集，孕妇年龄为28.7～30.6岁，均为云南本地育龄女性，其中少数民族16人，汉族54人，初产妇55人，经产妇25人，经查阅相关文献，发现年龄、民族、产次等基线资料对阴道菌群结构无明显影响，主要结合阴道菌群的变化进行研究讨论。
通过对80例样本进行测序质控后最终得到6281086条序列。根据稀释曲线提示样本的测序数据量是合理的，见图1、图2。
图 2 足月/未足月胎膜早破组与足月/未足月对照组稀释曲线Figure 2. Rarefaction curve of PPROM，WZY，PROM and ZY group2.2 阴道微生物群落的多样性
胎膜早破组及对照组在物种丰富度及均匀度指数秩和检验，差异无统计学意义（P > 0.05）；因此，对于以上各分组Alpha多样性均不显著，也表明各分组菌群结构较稳定，见 表1。
表 1 各分组丰富度及均匀度指数的多样性分析Table 1. Diversity analysis of the richness and evenness indices of each grouping组别 shannon simpson chao1 对照组 1.01 ± 0.26 0.34 ± 0.09 67.46 ± 14.31 TMZPZ组 1.02 ± 0.36 0.35 ± 0.13 68.85 ± 23.5 t 0.058 0.390 0.328 P 0.954 0.697 0.744 WTY组 1.06 ± 0.29 0.36 ± 0.1 69 ± 14.97 ZY组 0.94 ± 0.18 0.31 ± 0.07 65.16 ± 13.55 PPROM组 1.07 ± 0.39 0.38 ± 0.15 70.04 ± 18.36 足月PROM组 0.94 ± 0.3 0.31 ± 0.09 67.05 ± 30.07 F 0.973 1.566 0.193 P 0.410 0.205 0.901 根据OTUs数各分组样本的微生物群落非度量多维尺度分析（nonmetric multidimensional scaling，NMDS），见图3、图4。各组stress = 0.02，小于0.05，差异具有统计学意义（P < 0.05），表明各分组之间物种有显著差异，具有Beta多样性。
图 4 未足月/足月胎膜早破组与未足月/足月对照组的微生物群落非度量多维尺度分析Figure 4. The NMDS of PPROM，WZY，PROM and ZY group2.3 阴道微生物群落结构
2.3.1 在门、属水平等级胎膜早破组与正常对照组物种组成分析
在门水平，TMZPZ与control组主要菌群均以厚壁菌门（Firmicutes）为主（相对丰度 > 75%），TMZPZ中放线菌门（Actinobacteria）、酸杆菌门（Fusobacteria）明显增加，见 图5。在属水平等级，TMZPZ组、Control组均以乳酸杆菌属（Lactobacillus）为主要优势菌，但TMZPZ中阴道菌群种类明显增多，乳酸杆菌属相对丰度明显降低但仍大于75%；TMZPZ组加德纳菌属（Gardnerella）、纤毛菌属（Sneathia）、变异菌属（Atopobium）、脲原体属（Ureaplasma）、普氏菌属（Prevotella）等明显增多，见图6。
图 5 胎膜早破与对照组在门水平等级微生物物种组成Figure 5. Microbial species composition at phylum level of TMZPZ and control group
图 6 胎膜早破组与对照组在属水平等级微生物物种组成Figure 6. Microbial species composition at genus level of TMZPZ and Control2.3.2 在种等级水平各分组的物种分析
本研究阴道微生物群落总体结构可分为五种主要的微生物群落结构类型（community state type，CSTs），其中四种以不同的乳杆菌为优势，如卷曲乳酸杆菌（L.crispatus）、格氏乳酸杆菌（L.gasseri）、惰性乳酸杆菌（L.iners）和詹氏乳酸杆菌（L.jessenii），分别在 CSTⅠ、 CSTⅡ、CSTⅢ和 CSTⅤ中占主导地位。该研究结果主要以CSTⅠ为主，其次为CSTⅢ、CSTIV-B，CST V、CST II所占比例很少，见图7。
图 7 样本在种水平等级上的微生物群落类型聚类图注释：柱状图中不同颜色代表不同的物种相对丰度，根据柱状图、树状聚类图可主要分为以下几种微生物群落类型（community state types，CST），红色：CST I，蓝色：CST III ，黄色：CST IV ， 深蓝色：CST V ，绿色：CST II 。Figure 7. Cluster diagram of microbial community types at species levelTMZP组中检测的物种数目比control组高；其中PPROM的物种多样性最高，为529个；WZY组的多样性最低，为207个，见图8。
图 8 样本微生物群落在种水平分布维恩图Figure 8. Venn diagram of sample microbial community distribution at species levelTMZPZ组与control组在种水平等级物种最为丰富物种为卷曲乳杆菌、惰性乳杆菌、詹氏乳杆菌、加德纳菌类等，2组均以卷曲乳酸杆菌为主要优势菌，但TMZPZ组中卷曲乳酸杆菌相对丰度明显降低，而惰性乳酸杆菌、加德纳菌等明显增多，见图9。
图 9 胎膜早破组与对照组的Circos图注释：左半部分是丰度top5的物种以及其对应的丰度信息，右半部分是按照分组展示的分组信息，所占宽度越宽，表示丰度越高。Figure 9. Circos diagram of TMZPZ and control group3. 讨论
利用第2代高通量测序技术本研究发现，孕期无论是正常还是胎膜早破孕妇阴道菌群均呈现一种低Alpha多样性的状态，但Beta多样性显著。既往MacIntyre等[9]学者表示，孕期阴道菌群呈现一种低Alpha多样性和乳酸杆菌为优势的菌群状态，并且菌群稳定性较高。Xinyuan Liang等[11]通过研究也发现随着妊娠的进展，阴道微生物群的Beta多样性显著增加。本研究结果与上述学者一致。根据维恩图可知胎膜早破组阴道菌群更具多样性，其中未足月胎膜早破组的物种多样性最高；未足月正常对照组的多样性最低，而足月比未足月正常妊娠的物种数更有多样性。此前有研究也显示，孕32周以后阴道菌群复杂性与胎龄呈正相关，增加至分娩前[11]，因此，足月正常妊娠阴道菌群更具多样性，与笔者所得结论一致，这是正常的阴道微生态变化。而在胎膜早破组中，未足月胎膜早破者阴道菌群多样性最大，笔者推测此时期出现足月阴道微生态变化即为异常状态，易引发BV，导致PPROM，这有待更多研究证实。
通过研究发现妊娠期阴道微生物群落类型主要为5种，以CSTⅠ为主，CSTⅢ及CSTⅣ次之，而CSTⅤ、CSTⅡ所占比例很少。这与上述MacIntyre等[9]提出的孕期阴道微生物群落以CSTⅠ为主的观点一致，但与Romero等[3]提出的CSTⅢ为主不一致。Hyman等[12]指出种族对孕期阴道微生物群落有影响。本研究的结果与上述学者不一致是否与种族有关有待研究。有研究发现[13]CSTⅣ可分为CSTⅣ-A、CSTⅣ-B两种类型，其中CSTⅣ-A中惰性乳酸杆菌占比较高，而CSTⅣ-B中加德纳菌、奇异菌、普氏菌、纤毛菌等较多，CSTⅣ-B增多与BV有关，而BV易引发胎膜早破，故本研究CST Ⅳ-B的增多，多考虑与胎膜早破相关。
众所周知，乳酸杆菌是革兰阳性菌也是厌氧菌，它在预防泌尿生殖系统感染如BV、霉菌感染等起着至关重要的作用[14-15]。其中卷曲乳酸杆菌可产生大量H2O2，而惰性乳酸杆菌产生H2O2的量很少，H2O2可杀死致病菌，对维持阴道内环境的动态平衡起着重要作用[16]。Rinku Pramanick[17]表示无症状的BV妇女的阴道内卷曲乳杆菌的减少，易使阴道微生态稳定性降低；来自南非的研究也表明卷曲乳杆菌与女性正常阴道微生态关系密切[18]。上述表明卷曲乳杆菌能维持阴道正常菌群微生态，并且能抵抗BV的发生。本研究显示孕妇阴道内以卷曲乳杆菌为优势菌，不同的是在胎膜早破组中卷曲乳杆菌明显减少，而惰性乳杆菌、各种厌氧菌等明显增多。惰性乳杆菌不易产生乳酸、H2O2[19]，它对阴道内的保护作用很小，而且它有些特征类似于加德纳菌[20]。有学者发现孕期阴道内加德纳氏菌、普氏菌、纤毛菌等厌氧菌增多，会使乳酸杆菌减少，并与BV相关[11]。这些异常增多的细菌易发生胎膜早破[21]。Liang Xinyuan等[11]提出孕晚期阴道使用益生菌可能有助于调节阴道菌群。有学者发现与BV相关的菌群更容易引起早期早产而不是晚期早产[22]。对于妊娠早期，特别是妊娠前3个月阴道内菌群的多样性及丰富度是关系后期足月和早产的关键时间段[23]。妊娠早期阴道菌群的研究可能是预防妊娠晚期发生胎膜早破、早产等的关键。因此，孕早期治疗BV或预防性补充阴道益生菌，增加阴道内乳酸杆菌的量，维持阴道内酸性环境，减少惰性杆菌、加德纳菌、纤毛菌、奇异菌等细菌的异常增多是否可以避免或减少孕晚期胎膜早破、早产、母婴感染的发生，从而改善胎儿的妊娠结局，这将是笔者后续研究的方向。
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图 2 足月/未足月胎膜早破组与足月/未足月对照组稀释曲线
Figure 2. Rarefaction curve of PPROM，WZY，PROM and ZY group
图 4 未足月/足月胎膜早破组与未足月/足月对照组的微生物群落非度量多维尺度分析
Figure 4. The NMDS of PPROM，WZY，PROM and ZY group
图 5 胎膜早破与对照组在门水平等级微生物物种组成
Figure 5. Microbial species composition at phylum level of TMZPZ and control group
图 6 胎膜早破组与对照组在属水平等级微生物物种组成
Figure 6. Microbial species composition at genus level of TMZPZ and Control
图 7 样本在种水平等级上的微生物群落类型聚类图
注释：柱状图中不同颜色代表不同的物种相对丰度，根据柱状图、树状聚类图可主要分为以下几种微生物群落类型（community state types，CST），红色：CST I，蓝色：CST III ，黄色：CST IV ， 深蓝色：CST V ，绿色：CST II 。
Figure 7. Cluster diagram of microbial community types at species level
图 8 样本微生物群落在种水平分布维恩图
Figure 8. Venn diagram of sample microbial community distribution at species level
图 9 胎膜早破组与对照组的Circos图
注释：左半部分是丰度top5的物种以及其对应的丰度信息，右半部分是按照分组展示的分组信息，所占宽度越宽，表示丰度越高。
Figure 9. Circos diagram of TMZPZ and control group
表 1 各分组丰富度及均匀度指数的多样性分析
Table 1. Diversity analysis of the richness and evenness indices of each grouping
组别 shannon simpson chao1 对照组 1.01 ± 0.26 0.34 ± 0.09 67.46 ± 14.31 TMZPZ组 1.02 ± 0.36 0.35 ± 0.13 68.85 ± 23.5 t 0.058 0.390 0.328 P 0.954 0.697 0.744 WTY组 1.06 ± 0.29 0.36 ± 0.1 69 ± 14.97 ZY组 0.94 ± 0.18 0.31 ± 0.07 65.16 ± 13.55 PPROM组 1.07 ± 0.39 0.38 ± 0.15 70.04 ± 18.36 足月PROM组 0.94 ± 0.3 0.31 ± 0.09 67.05 ± 30.07 F 0.973 1.566 0.193 P 0.410 0.205 0.901 
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