The Relationship between T950C Polymorphism in the Promoter Region of Osteoprotegerin Gene and Type 2 Diabetes with Osteoporosis in Kunming Area
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摘要:
目的 研究护骨素（OPG）基因启动子区T950C多态性与昆明地区2型糖尿病（T2DM）伴骨质疏松症的关系，探讨T2DM伴骨质疏松症发病的遗传易感因素。 方法 （1）采用聚合酶链反应（PCR-RFLP）技术，检测T2DM无骨质疏松组（A组）61例，T2DM合并骨量减少组（B组）111例，T2DM伴骨质疏松组（C组）65例，OPG基因T950C的基因型，对3组人群的OPG基因T950C进行多态性分析；（2）比较3组患者性别、年龄、糖尿病病程、血压、身高、体重、体重指数（BMI）、空腹血糖(FPG)、糖化血红蛋白（HbA1c）、血钙、血脂、血尿酸（UA）、维生素D浓度、雌激素、睾酮水平，超敏C-反应蛋白（Hs-CRP）、纤维蛋白原（FIB），口服葡萄糖耐量（OGTT）-0h、2h血糖，0h、2h胰岛素(INS)水平，胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）临床指标；(3）比较OPG基因T950C不同基因型间骨密度的差异；（4）将OPG基因T950C的基因型及组间具有统计学差异的指标进行多因素logistic回归分析。 结果 （1）昆明地区T2DM和T2DM伴骨质疏松症患者，OPG基因T950C的基因型以TC型为主;（2）3组OPG基因T950C的基因型的频率及等位基因频率差异均无统计学意义（P > 0.05）；（3）3组患者年龄、身高、体重、BMI比较，差异有统计学意义（P < 0.05），且两两比较，差异有统计学意义（P < 0.05）；（4）OPG基因T950C的三种基因型比较，各部位的骨密度差异无统计学意义（P > 0.05）；（5）多因素Logistic回归分析显示：年龄、吸烟可进入回归方程，而OPGOPG基因T950C的基因型未进入回归方程。 结论 （1）昆明地区T2DM和T2DM伴骨质疏松症患者，OPG基因T950C的基因型以TC型为主；（2）3组OPG基因T950C的基因型的频率及等位基因频率差异均无统计学意义，OPG基因T950C的三种基因型比较，各部位的骨密度差异无统计学意义，OPG基因T950C的基因型可能与昆明地区T2DM及T2DM伴骨质疏松症的遗传易感性无关；（3）年龄、吸烟是昆明地区T2DM伴骨质疏松患者的独立危险因素。 -
关键词:
- 护骨素(OPG) /
- 基因启动子区T950C多态性 /
- 2型糖尿病 /
- 骨质疏松症
Abstract:Objective To study the relationship between the T950C polymorphism in the promoter region of the osteoprotegerin （OPG） gene and type 2 diabetes mellitus （T2DM） with osteoporosis in Kunming, and to explore the genetic susceptibility factors of T2DM with osteoporosis. Methods （1） The polymerase chain reaction （PCR-RFLP） technique was used to detect the OPG gene T950C polymorphism about 61 cases in the T2DM without osteoporosis group （group A）, 111 cases in the T2DM combined with osteopenia group （group B）, and T2DM with osteoporosis group （ Group C） 65 cases. The OPG gene T950C polymorphism was analyzed in the 3 groups of people. （2） We compare the 3 groups of patients' clinical indicators including gender, age, diabetes course, blood pressure, height, weight, body mass index （ BMI）, fasting blood glucose （FPG）, glycosylated hemoglobin （HbA1c）, blood calcium, blood lipids, blood uric acid （UA）, vitamin D concentration, estrogen, testosterone levels, high-sensitivity C-reactive protein （Hs-CRP）, fibrin Original （FIB）, oral glucose tolerance （OGTT） -0h, 2h blood glucose, 0h, 2h insulin （INS） levels and insulin resistance index （HOMA-IR）. （3） We compared the bone mineral density among different genotypes of OPG gene T950C. （4） Multivariate logistic regression analysis was performed on the genotype of OPG gene T950C and the indicators with statistical differences between groups. Results (1） In patients with T2DM and T2DM with osteoporosis in Kunming, the main genotype of OPG gene T950C was TC. （2） There was no statistical difference in the genotype frequency and allele frequency of the three groups of OPG gene T950C （P > 0.05）. （3） The comparison of age, height, weight, and BMI of the three groups of patients, the difference was statistically significant （P < 0.05）, and the differences were statistically significant in each other （P < 0.05）. （4） Comparing the three genotypes of OPG gene T950C, there was no statistically significant difference in bone mineral density （P > 0.05）. （5） Multivariate logistic regression analysis showed that age and somking can enter the regression equation, while OPG gene T950C genotype did not enter the regression equation. Conclusions (1） In patients with T2DM and T2DM with osteoporosis in Kunming, the genotype of OPG gene T950C is mainly TC type. （2） There is no statistical difference in the genotype frequency and allele frequency of the three groups of OPG gene T950C. Comparing the three genotypes of OPG gene T950C, there is no statistically significant difference in bone mineral density. The genotype of OPG gene T950C may have nothing to do with the genetic susceptibility of T2DM and T2DM with osteoporosis in Kunming （3） Age and smoking are independent risk factor for patients with T2DM and osteoporosis in Kunming. -
随着人们生活水平的提高和寿命的延长，2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus）和骨质疏松症的发病率逐年上升，据国际糖尿病联盟（international diabetes federation， IDF）预计2030年T2DM发病率将翻倍，而中国T2DM将达到4230万人，骨质疏松症的发病率也已跃居各种常见病的第7位，已成为全球主要的公共卫生问题[1]。糖尿病高血糖状态、糖基化终末产物（AGEs）、糖尿病慢性并发症、胰岛素及胰岛素样生长因like growth factor，IGF）分泌的减少、氧化应激损伤、炎症因子（CRP、IL-6）水平的升高等均可能影响骨代谢[2-4]，从而导致骨质疏松。 在众多的发病因素中，遗传是T2DM和骨质疏松症主要的发病原因，有研究认为，糖尿病性骨质疏松是一种多基因遗传病，这些基因[5]包括降钙素受体（calcitonin receptor，CTR）基因，维生素D受体基因及护骨素基因（osteoprotegerin ，OPG）等。对基因型多态性与骨质疏松症的相关性，国内外研究结果尚不一致。OPG基因型与T2DM伴骨质疏松症的关系研究较少。本研究旨在探讨护骨素（OPG）基因启动子区T950C多态性与昆明地区T2DM伴骨质疏松症的关系，为昆明地区T2DM伴骨质疏松症防治提供理论依据，并早期防治糖尿病性骨质疏松，提高糖尿病患者的生活质量。
1. 资料与方法
1.1 研究对象
随机抽样选取2017年2019年1月在昆明市第一人民医院内分泌科住院治疗的2型糖尿病患者237例，男性122例，女性115例，年龄50～84岁，平均（64.68±7.92）岁。糖尿病诊断标准：参考2013年版《中国2型糖尿病防治指南》[6]；骨质疏松诊断标准：参考2011年版《原发性骨质疏松症诊治指南》[7]。纳入标准：（1）T2DM；（2）昆明地区居住时间大于10 a。排除标准：（1）1型糖尿病；（2）各种糖尿病急性并发症、感染、营养不良及严重的心肝肾脏疾病及肿瘤患者；（3）甲状腺手术史，合并其他可能引起甲状腺激素代谢异常的其他内分泌、免疫系统疾病、结缔组织病者，如垂体瘤、垂体功能减退者，亚急性甲状腺炎等；（4）皮肤疾病无法接受阳光照射者；（5）存在风湿或类风湿关节炎，且应用激素类药物时间超过6个月，或曾经接受活性维生素Ｄ、降钙素、雌激素受体调节剂等影响骨代谢的药物治疗者；（6）存在畸形性骨关节炎者和成骨不全患者。按骨密度检测结果分组为糖尿病无骨质疏松症（A组）61例，占25.7%;糖尿病合并骨量减少组（B组）111例，占46.8%;糖尿病伴骨质疏松组（C组）65例，占27.4%。纳入研究对象均签署知情同意书，且本研究经昆明市第一人民医院医学伦理学委员会批准。
1.2 研究方法
1.2.1 一般指标：
记录年龄、性别、糖尿病病程，男性是否吸烟，是否饮酒。测试当日由专人用固定体重/身高测量仪测定：体重、身高、计算体重指数（BMI），单位kg/m2。
1.2.2 血压指标：
采用汞柱式标准袖带血压表，受试者入院时休息5min后测定坐位右上臂收缩压（SBP）/舒张压（DBP），单位mmHg（1 mmHg = 0.133 kPa）。
1.2.3 其他生化指标测定：
受试者隔夜禁食8～12 h，入院第二天清晨6点30分-8点取静脉血测FPG、HbA1c、肝肾功能电解质（血钙）、血脂、UA、维生素D浓度、雌激素水平、睾酮水平，Hs-CRP、FIB。按标准方法行OGTT试验，检测OGTT-0 h、2 h血糖，采用化学发光法测定0 h、2 h INS水平，并计算HOMA-IR。
1.2.4 外周血基因组DNA提取：
空腹采集静脉血6～8 mL，EDTA抗凝，-80 ℃保存，标本收集结束后购进DNA提取试剂盒统一提取OPG基因。具体所需试剂及仪器见表1。
表 1 DNA提取所需试剂及仪器Table 1. Required for DNA extraction reagent and instrument试剂及仪器 来源 DNA提取试剂盒 AXYGEN公司 DNA聚合酶（2×Taq Master Mix） Bioteke公司 引物 昆明硕擎公司合成 普通PCR仪 美国应用生物系统公司：ABI2720 各种规格的离心管、枪尖、PCR管、一次性乳胶手套和口罩 NSET公司 1.2.5 PCR扩增 ：
（1）扩增所使用的引物：上游引物5′ -GTTCCTCAGCCCGGTGGCTTTT-3′ 下游引物5′ -TGTGGTCCCGGAAACCTCAGG-3′ ；
（2）PCR反应体系：共25 µL混匀液体，包括2XTaq PCR Master Mix 12.5 µL，PCR Forward Primer（10 µM，硕擎）1 µL，PCR Reverse Primer（10 µM，硕擎）1 µL，Template DNA 4 µL，Nuclease-freeWater 8.5 µL。
（3）PCR反应条件：共35个循环，95 ℃预变性5 min，然后95 ℃变性30 s，60 ℃退火 30 s，72 ℃延伸60 s，反应完成后，72 ℃再延伸10 min。
1.2.6 酶切鉴定基因型：
PCR扩增产物用限制性内切酶Hinc II酶切后，置于2%琼脂糖凝胶电泳紫外灯下观察基因型。
1.2.7 骨密度测量：
采用通用电气医疗系统（中国）有限公司生产的双能x线骨密度仪（型号DPX Bravo）测量腰椎L1～L4，股骨颈及髋部骨密度（BMD），单位g/cm2。
1.3 统计学处理
本研究的所有数据均使用SPSS11.5软件包进行统计处理。采用Hardy-Weinberg平衡检测基因型的分布是否具有代表性。正态分布计量资料用均数±标准差（
$ \bar x \pm s $ ）表示，3个独立样本比较，采用方差分析，组间比较用最小有意义差异法（LSD检验）。2个独立样本比较，采用t检验。非正态分布计量资料用M（P25，P75）表示，采用秩和检验。计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验。采用多因素Logistic回归分析筛选独立危险因素。P < 0.05为差异有统计学意义。2. 结果
2.1 3组人群一般资料比较
结果显示,3组患者性别、年龄、吸烟、饮酒、DBP、身高、体重、BMI、HDL-C、雌激素、睾酮差异均有统计学意义（P < 0.05），且在T2DM伴骨质疏松组与无骨质疏松组比较时，上述指标均有统计学差异（P < 0.05），见表2。
表 2 研究对象的一般资料比较[($ \bar x \pm s $ )，M(P25,P75)]Table 2. Comparison of general data of study objects[($ \bar x \pm s $ )，M(P25,P75)]指标/分组 A组（61例） B组（111例） C组（65例） 统计量值 P值 性别（男/女）） 46/15 61/50# 15/50*#& 18.286 < 0.001 年龄（岁） 61.65 ± 8.16 64.79 ± 10.15# 66.33 ± 6.77*#& 4.573 0.011* 吸烟（是/否） 24/37 32/79 11/54*# 7.833 0.020* 饮酒（是/否） 17/44 29/82 6/59*#& 8.518 0.014* 绝经年龄（女，岁） 50（48 ，54 ） 50（48 ，52 ） 50（48 ，51 ） −0.744 0.457 糖尿病病程（a） 9.18 ± 7.34 10.11 ± 7.46 8.69 ± 7.36 0.805 0.449 收缩压（mmHg） 126.77 ± 22.50 129.07 ± 19.73 125.77 ± 22.54 0.543 0.582 舒张压（mmHg） 80.77 ± 11.51 78.64 ± 10.27 74.97 ± 12.30*# 4.364 0.014* 身高（m） 167.64 ± 7.32 164.12 ± 8.04# 158.13 ± 7.21*#& 24.880 0.000* 体重（kg） 71.02 ± 11.16 65.85 ± 9.94# 59.07 ± 10.45*#& 20.955 0.000* 体重指数（kg/m2） 25.26 ± 2.77 24.29 ± 2.75# 23.40 ± 3.21*# 6.369 0.002* TC（mmol/L） 4.94 ± 1.59 4.57 ± 1.22 4.90 ± 1.02 2.122 0.122 TG（mmol/L） 2.13（1.32，3.25 ） 1.65（1.19，2.26 ） 1.79（1.30，2.41 ） −2.163 0.051 HDLC（mmol/L） 1.09 ± 0.34 1.15 ± 0.28 1.23 ± 0.31*# 3.410 0.035* LDLC（mmol/L） 2.79 ± 1.14 2.82 ± 0.99 3.15 ± 1.01 2.389 0.094 FPG（mmol/L） 8.63（7.31，12.29 ） 8.55（6.85，11.19 ） 8.13（6.58，10.97 ） −1.297 0.195 HBA1c（%） 8.60 ± 1.91 8.32 ± 2.04 8.06 ± 1.76 1.199 0.303 OGTT-0h（mmol/L） 8.09 ± 2.29 8.25 ± 2.06 8.13 ± 2.71 0.093 0.911 OGTT-2h（mmol/L） 17.86 ± 3.19 18.29 ± 4.60 17.81 ± 4.73 0.223 0.800 INS-0h（mIU/L） 15.36（9.50，21.35 ） 15.64（7.83，32.75 ） 15.23（8.23，25.83 ） −0.426 0.670 INS-2h（mIU/L） 34.79（23.12，58.31 ） 41.12（25.93，67.58 ） 52.49（35.09，81.46 ） −1.300 0.194 HOMR-IR 4.77（2.69，9.08 ） 5.23（2.65，11.2） 4.98（2.37，8.86 ） −0.492 0.623 UA（umol/L） 354.05 ± 86.92 342.32 ± 99.48 314.82 ± 92.09 2.909 0.057 血钙（mmol/L） 2.33 ± 0.11 2.31 ± 0.12 2.32 ± 0.12 0.722 0.487 雌激素
（pmol/L）116.90（80.73，152.44，） 90.42（60.97，140.19） 81.12（58.63，98.22 ） *# −1.949 0.041* 睾酮（nmol/L） 9.13（1.94，14.85 ） 5.17（1.32，12.09 ） 1.57（1.17，2.38 ） *#& −2.281 0.023* 维生素D （ng/ml） 18.15 ± 9.72 16.78 ± 6.16 16.00 ± 5.71 1.403 0.248 Hs-CRP（mg/L） 1.72（0.61，3.02 ） 1.70（0.50，2.69 ） 1.06（0.50，3.16 ） −0.368 0.713 FIB（g/L） 2.89 ± 0.70 2.77 ± 0.64 2.80 ± 0.72 0.599 0.550 *P < 0.05。 2.2 OPG基因T950C的基因型和等位基因频率的分布
2.2.1 OPG基因型酶切电泳图。OPG基因T950C内切酶Hinc
II酶切位点多态性确定为：纯合子TT为342 bp一条带，杂合子TC为342 bp、225 bp、和117 bp三条带；纯合子CC为117 bp和225 bp两条带，见图1。
图 1 OPG基因T950C的基因型酶切电泳图Figure 1. Genotype restriction electrophoresis map of OPG gene T950C2.2.2 OPG基因T950C的基因型分布
分布符合Hardy-Weinberg平衡定律，说明所选人群代表性好。在237例人群中， OPG基因T950C基因型分布情况为：TT型71例（30.0%），TC型125例（52.7 %），CC型41例（17.3%）。提示昆明地区糖尿病患者中，OPG基因型以TC型为主；在65例糖尿病合并骨质疏松组中OPG基因T950基因型分布情况为：TT型13例（19.6%），TC型36例（55.4%），CC型16例24.6%）。提示昆明地区2型糖尿病合并骨质疏松中，OPG基因T950基因型仍以TC型为主。
2.2.3 3组人群OPG基因T950C基因型分布频率
OPG基因 T950C基因型TT，TC，CC基因型比较，差异无无统计学意义，见表3。
表 3 OPG基因T950C基因型分布频率比较[n（%）]Table 3. OPG gene T950C genotypes distribution frequency comparison [n（%）]组别/基因型 TT n（%） TC n（%） CC n（%） 合计n χ2 P A组 21（34.4 ） 32（52.5） 8（13.1） 61 B组 37（33.3 ） 57（51.7） 17（15.3） 111 C组 13（19.6） 36（55.4） 16（24.6） 65 合计n 71 125 41 237 5.989 0.200 2.2.4 3组人群OPG基因T950C等位基因分布
等位基因C、T的分布频率无统计学差异（P > 0.05），见表4。
表 4 OPG基因T950C等位基因分布频率Table 4. OPGgeneT950C allele frequency distribution组别/基因型 频数 T C χ2 P A组 122 74 48 B组 222 131 91 C组 130 62 68 合计n 474 267 20 5.519 0.063 2.2.5 OPG基因T950C基因多态性与T2DM患者BMD的关系
237例T2DM患者中，OPG基因T950C不同基因型在各部位的BMD值差异均无统计学意义（P > 0.05），见表5。
表 5 OPG基因T950C基因多态性与T2DM患者BMD的关系（g/cm2）[$ \bar x \pm s $ ]Table 5. The relationship between the OPGgeneT950C gene polymorphism and BMD of T2DM patients （g/cm2）[$ \bar x \pm s $ ]指标/分组 TT 组（71例） TC组（125例） CC组（41例） F/Z P 腰1 0.952 ± 0.161 0.944 ± 0.166 0.887 ± 0.155 1.521 0.222 腰2 1.034 ± 0.187 1.021 ± 0.188 0.937 ± 0.171 2.371 0.097 腰3 1.081 ± 0.206 1.066 ± 0.197 0.977 ± 0.171 2.639 0.075 腰4 1.113 ± 0.215 1.082 ± 0.181 1.022 ± 0.226 1.763 0.175 左股骨颈 0.885 ± 0.194 0.873 ± 0.193 0.805 ± 0.158 1.582 0.209 左大粗隆 0.774 ± 0.154 0.759 ± 0.167 0.684 ± 0.142 2.779 0.065 左全髋 0.965 ± 0.150 0.912 ± 0.268 0.870 ± 0.135 1.514 0.224 右股骨颈 0.884 ± 0.156 0.835 ± 0.353 0.773 ± 0.206 1.273 0.283 右大粗隆 0.775 ± 0.149 0.726 ± 0.294 0.659 ± 0.184 1.909 0.152 右全髋 0.959（0.863,1.085） 0.912（0.801,1.043） 0.859（0.721,0.951） 1.096 0.295 2.3 多因素Logistic回归分析结果
将OPG基因T950C基因型及单因素分析三组间具有统计学差异的变量，即性别（0为女，1为男）、年龄、吸烟(0为无，1为有)、饮酒(0为无，1为有)、DBP、身高、体重、BMI、HDL-C、雌激素、睾酮作为自变量，糖尿病有无骨质疏松作为因变量(0为无，1为有)，进行多因素Logistic回归分析，以筛选糖尿病伴骨质疏松的独立危险因素。结果显示：年龄（OR 1.108、95%CI：1.033～1.188、P = 0.004）、吸烟（OR 8.190、95%CI：1.368～49.053、P = 0.021）可以进入回归方程，见表6。
表 6 Logistic归分析结果Table 6. Logistic analysis results因素 B SE Wald P OR值 95%CI OPG-T950C 0.285 0.365 0.609 0.435 1.330 0.650～2.820 性别 0.364 0.932 0.152 0.696 1.439 0.231～8.947 年龄 0.103 0.036 8.245 0.004 1.108 1.033～1.188 吸烟 2.103 0.913 5.302 0.021 8.190 1.368～49.053 饮酒 −0.990 0.841 1.385 0.239 0.372 0.071～1.933 DBP 0.005 0.022 0.046 0.831 1.005 0.963～1.049 身高 −0.084 0.073 1.318 0.251 0.919 0.797～1.061 体重 −0.017 0.072 0.055 0.814 0.983 0.854～1.132 BMI −0.106 0.205 0.264 0.607 0.900 0.602～1.345 HDL-C 0.500 0.881 0.322 0.570 1.648 0.293～9.265 雌激素 0.001 0.003 0.052 0.819 0.999 0.993～1.005 睾酮 −0.117 0.067 3.042 0.081 0.889 0.7779～1.015 3. 讨论
T2DM是一种严重的高风险疾病，除血糖升高外，心、脑、眼、肾等全身并发症是T2DM致死、致残的主要原因。有研究表明，与糖尿病有关的并发症中如丧失的视力均可增加骨折风险[8]，骨质疏松症是以骨量流失、骨组织微结构破坏以及骨脆性增加为主要临床特征的一组代谢性疾病[9]。T2DM伴骨质疏松症发病机制非常复杂，近年来各国学者对T2DM与骨质疏松症的相关性研究日益增多，目前认为发病机制除了与年龄、性别、体重、 营养、生活方式有关外，遗传和环境因素亦起着重要作用。护骨素是肿瘤坏死因子受体超家族成员，是骨质疏松症的一个候选基因。护骨素是参与骨代谢及破骨细胞功能的关键调节因子，主要功能为抑制破骨细胞形成、分化、存活并诱导破骨细胞凋亡[10-11]。国内外已有报道称护骨素基因多态性与原发性骨质疏松的发病可能有关 [12-14]。国外报道，在男性2型糖尿病患者中，护骨素水平与骨密度呈负相关[15]。国内郑蓉等[16]的研究发现：护骨素基因启动子区T950C多态性与老年女性2型糖尿病患者骨密度有一定关联，其中C等位基因可能对骨量有一定保护作用，T等位基因可能是骨密度降低的危险因素。对OPG基因T950C基因多态性的研究在国际上已经引起了重视，OPG基因T950C基因多态性与骨质疏松的相关性已有大量报道，而OPG基因T950C基因多态性与T2DM并骨质疏松症的相关性研究在国内外报道较少。
本研究显示昆明地区T2DM患者的OPG基因T950基因型分布：TT型占30.0%，TC型占52.7%，CC型占 17.3%，提示昆明地区糖尿病患者中，OPG基因T950型以TC型为主。糖尿病合并骨质疏松组中OPG基因T950基因型分布为：TT型19.6%，TC型55.4%，CC型24.6%。提示昆明地区T2DM合并骨质疏松中，OPG基因T950基因型仍以TC型为主。
在本研究中T2DM无骨质疏松组、T2DM合并骨量减少组、T2DM伴骨质疏松组3组人群，OPG基因T950基因型比较，无统计学差异（χ2 = 5.989，P = 0.200），3组人群OPG基因T950等位基因T、C的分布频率无统计学差异（χ2 = 5.519，P = 0.063），与国内外研究不一致。这种多态性分布表明种族、饮食、生活习惯对遗传因素的影响可能与同一种族产生相同的基因频率有关，而与伴随疾病T2DM及T2DM合并骨质疏松症可能无关。这需要大量的研究进一步了解昆明地区2型糖尿病患者骨质疏松的影响因素。
笔者将OPG基因T950基因型及单因素分析3组间具有统计学差异的变量作为因变量，糖尿病合并骨质疏松作为自变量，进行多因素Logistic回归分析，以筛选糖尿病合并骨质疏松的独立危险因素，本研究显示年龄是昆明地区T2DM伴骨质疏松症的独立危险因素，OPG基因T950基因型未进入回归方程，说明OPG基因T950基因型未增加T2DM人群患骨质疏松症的风险，OPG基因T950基因型与昆明地区T2DM及 T2DM伴骨质疏松症遗传易感性不相关。同时比较T2DM患者OPG基因T950基因型中不同部位的骨密度，结果显示OPG基因T950不同基因型在各部位的骨密度值差异无统计学意义，提示OPG基因T950基因型可能不是T2DM患者BMD改变的易感基因；T2DM和骨质疏松症受多个基因调控，多个易感基因组合构成了该病的遗传易感性，每个单一基因在遗传易感性中所起的决定作用不同，因此导致了OPG基因T950 基因多态性与T2DM和T2DM合并骨质疏松症患者BMD相关性的不同。
曹玉丽等[17]研究显示年龄是发生骨质疏松危险因素，年龄与各部位骨密度明显负相关，随着年龄增长，体骨量发生着变化，30～40岁左右骨量积累达高峰，以后逐渐下降。从T2DM无骨质疏松症组到T2DM合并骨量减少组再到T2DM伴骨质疏松组年龄呈逐渐增加趋势，且不论是总体比较还是两两比较有统计学意义，说明随着年龄的增长，T2DM患者患骨质疏松症的风险增加，且Logstic回归分析显示：年龄（OR 1.108、95%CI：1.033～1.188、P = 0.004）是昆明地区T2DM伴骨质疏松症的独立危险因素。说明昆明地区T2DM伴骨质疏松症的发病与年龄相关
烟草的有害成分是尼古丁、焦油、亚硝胺和一氧化氮等，吸烟可以影响到血糖、体重指数、胰岛素抵抗、诱导炎症等，可以降低骨质量，增加骨折的发生。吸烟降低 BMD 的机制是通过抑制骨形成，增加骨吸收，使碱性磷酸酶活性增加，刺激破骨细胞，使骨吸收和骨形成之间平衡失调。姚坤等[18]对国内外文献进行Meta 分析提示吸烟与２型糖尿病伴发骨质疏松发生风险有关联，吸烟是2型糖尿病伴发骨质疏松的相关危险因素。国内研究显示随着吸烟量的增加，各部位 BMD 均有不同程度的下降，同时反映骨形成指标降低，骨吸收指标升高[19]。本研究Logistic回归分析，结果显示：吸烟（OR 8.190、95%CI：1.368～49.053、P = 0.021）是T2DM伴骨质疏松的独立危险因素。
总之，T2DM和骨质疏松症受多个基因调控，多个易感基因组合构成了该病的遗传易感性，每个单一基因在遗传易感性中所起的决定作用不同，因此导致了OPG基因T950C 基因多态性与T2DM和T2DM合并骨质疏松症患者BMD相关性的不同。OPG基因T950C基因多态性与T2DM伴骨质疏松症的相关性研究一方面有助于从分子水平解释T2DM伴骨质疏松症发病的遗传学机制，另一方面亦可以应用于评估T2DM骨折的危险性。因此，T2DM伴骨质疏松症的相关基因研究应更加广泛和深入，进行多种族、多地域、大样本的研究，并综合考虑诸多因素的协同作用。
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图 1 OPG基因T950C的基因型酶切电泳图
Figure 1. Genotype restriction electrophoresis map of OPG gene T950C
表 1 DNA提取所需试剂及仪器
Table 1. Required for DNA extraction reagent and instrument
试剂及仪器 来源 DNA提取试剂盒 AXYGEN公司 DNA聚合酶（2×Taq Master Mix） Bioteke公司 引物 昆明硕擎公司合成 普通PCR仪 美国应用生物系统公司：ABI2720 各种规格的离心管、枪尖、PCR管、一次性乳胶手套和口罩 NSET公司 
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表 2 研究对象的一般资料比较[(
$ \bar x \pm s $ )，M(P25,P75)]Table 2. Comparison of general data of study objects[(
$ \bar x \pm s $ )，M(P25,P75)]指标/分组 A组（61例） B组（111例） C组（65例） 统计量值 P值 性别（男/女）） 46/15 61/50# 15/50*#& 18.286 < 0.001 年龄（岁） 61.65 ± 8.16 64.79 ± 10.15# 66.33 ± 6.77*#& 4.573 0.011* 吸烟（是/否） 24/37 32/79 11/54*# 7.833 0.020* 饮酒（是/否） 17/44 29/82 6/59*#& 8.518 0.014* 绝经年龄（女，岁） 50（48 ，54 ） 50（48 ，52 ） 50（48 ，51 ） −0.744 0.457 糖尿病病程（a） 9.18 ± 7.34 10.11 ± 7.46 8.69 ± 7.36 0.805 0.449 收缩压（mmHg） 126.77 ± 22.50 129.07 ± 19.73 125.77 ± 22.54 0.543 0.582 舒张压（mmHg） 80.77 ± 11.51 78.64 ± 10.27 74.97 ± 12.30*# 4.364 0.014* 身高（m） 167.64 ± 7.32 164.12 ± 8.04# 158.13 ± 7.21*#& 24.880 0.000* 体重（kg） 71.02 ± 11.16 65.85 ± 9.94# 59.07 ± 10.45*#& 20.955 0.000* 体重指数（kg/m2） 25.26 ± 2.77 24.29 ± 2.75# 23.40 ± 3.21*# 6.369 0.002* TC（mmol/L） 4.94 ± 1.59 4.57 ± 1.22 4.90 ± 1.02 2.122 0.122 TG（mmol/L） 2.13（1.32，3.25 ） 1.65（1.19，2.26 ） 1.79（1.30，2.41 ） −2.163 0.051 HDLC（mmol/L） 1.09 ± 0.34 1.15 ± 0.28 1.23 ± 0.31*# 3.410 0.035* LDLC（mmol/L） 2.79 ± 1.14 2.82 ± 0.99 3.15 ± 1.01 2.389 0.094 FPG（mmol/L） 8.63（7.31，12.29 ） 8.55（6.85，11.19 ） 8.13（6.58，10.97 ） −1.297 0.195 HBA1c（%） 8.60 ± 1.91 8.32 ± 2.04 8.06 ± 1.76 1.199 0.303 OGTT-0h（mmol/L） 8.09 ± 2.29 8.25 ± 2.06 8.13 ± 2.71 0.093 0.911 OGTT-2h（mmol/L） 17.86 ± 3.19 18.29 ± 4.60 17.81 ± 4.73 0.223 0.800 INS-0h（mIU/L） 15.36（9.50，21.35 ） 15.64（7.83，32.75 ） 15.23（8.23，25.83 ） −0.426 0.670 INS-2h（mIU/L） 34.79（23.12，58.31 ） 41.12（25.93，67.58 ） 52.49（35.09，81.46 ） −1.300 0.194 HOMR-IR 4.77（2.69，9.08 ） 5.23（2.65，11.2） 4.98（2.37，8.86 ） −0.492 0.623 UA（umol/L） 354.05 ± 86.92 342.32 ± 99.48 314.82 ± 92.09 2.909 0.057 血钙（mmol/L） 2.33 ± 0.11 2.31 ± 0.12 2.32 ± 0.12 0.722 0.487 雌激素
（pmol/L）116.90（80.73，152.44，） 90.42（60.97，140.19） 81.12（58.63，98.22 ） *# −1.949 0.041* 睾酮（nmol/L） 9.13（1.94，14.85 ） 5.17（1.32，12.09 ） 1.57（1.17，2.38 ） *#& −2.281 0.023* 维生素D （ng/ml） 18.15 ± 9.72 16.78 ± 6.16 16.00 ± 5.71 1.403 0.248 Hs-CRP（mg/L） 1.72（0.61，3.02 ） 1.70（0.50，2.69 ） 1.06（0.50，3.16 ） −0.368 0.713 FIB（g/L） 2.89 ± 0.70 2.77 ± 0.64 2.80 ± 0.72 0.599 0.550 *P < 0.05。
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表 3 OPG基因T950C基因型分布频率比较[n（%）]
Table 3. OPG gene T950C genotypes distribution frequency comparison [n（%）]
组别/基因型 TT n（%） TC n（%） CC n（%） 合计n χ2 P A组 21（34.4 ） 32（52.5） 8（13.1） 61 B组 37（33.3 ） 57（51.7） 17（15.3） 111 C组 13（19.6） 36（55.4） 16（24.6） 65 合计n 71 125 41 237 5.989 0.200
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表 4 OPG基因T950C等位基因分布频率
Table 4. OPGgeneT950C allele frequency distribution
组别/基因型 频数 T C χ2 P A组 122 74 48 B组 222 131 91 C组 130 62 68 合计n 474 267 20 5.519 0.063
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表 5 OPG基因T950C基因多态性与T2DM患者BMD的关系（g/cm2）[
$ \bar x \pm s $ ]Table 5. The relationship between the OPGgeneT950C gene polymorphism and BMD of T2DM patients （g/cm2）[
$ \bar x \pm s $ ]指标/分组 TT 组（71例） TC组（125例） CC组（41例） F/Z P 腰1 0.952 ± 0.161 0.944 ± 0.166 0.887 ± 0.155 1.521 0.222 腰2 1.034 ± 0.187 1.021 ± 0.188 0.937 ± 0.171 2.371 0.097 腰3 1.081 ± 0.206 1.066 ± 0.197 0.977 ± 0.171 2.639 0.075 腰4 1.113 ± 0.215 1.082 ± 0.181 1.022 ± 0.226 1.763 0.175 左股骨颈 0.885 ± 0.194 0.873 ± 0.193 0.805 ± 0.158 1.582 0.209 左大粗隆 0.774 ± 0.154 0.759 ± 0.167 0.684 ± 0.142 2.779 0.065 左全髋 0.965 ± 0.150 0.912 ± 0.268 0.870 ± 0.135 1.514 0.224 右股骨颈 0.884 ± 0.156 0.835 ± 0.353 0.773 ± 0.206 1.273 0.283 右大粗隆 0.775 ± 0.149 0.726 ± 0.294 0.659 ± 0.184 1.909 0.152 右全髋 0.959（0.863,1.085） 0.912（0.801,1.043） 0.859（0.721,0.951） 1.096 0.295
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表 6 Logistic归分析结果
Table 6. Logistic analysis results
因素 B SE Wald P OR值 95%CI OPG-T950C 0.285 0.365 0.609 0.435 1.330 0.650～2.820 性别 0.364 0.932 0.152 0.696 1.439 0.231～8.947 年龄 0.103 0.036 8.245 0.004 1.108 1.033～1.188 吸烟 2.103 0.913 5.302 0.021 8.190 1.368～49.053 饮酒 −0.990 0.841 1.385 0.239 0.372 0.071～1.933 DBP 0.005 0.022 0.046 0.831 1.005 0.963～1.049 身高 −0.084 0.073 1.318 0.251 0.919 0.797～1.061 体重 −0.017 0.072 0.055 0.814 0.983 0.854～1.132 BMI −0.106 0.205 0.264 0.607 0.900 0.602～1.345 HDL-C 0.500 0.881 0.322 0.570 1.648 0.293～9.265 雌激素 0.001 0.003 0.052 0.819 0.999 0.993～1.005 睾酮 −0.117 0.067 3.042 0.081 0.889 0.7779～1.015
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