Application of PTGD Combined with Elective LC in the Treatment of Cholecystolithiasis with Acute Onset of Chronic Cholecystitis
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摘要:
目的 探讨B超引导下经皮经肝胆囊穿刺引流术(percutaneous transhepatic gallbladder drainage,PTGD)联合择期腹腔镜胆囊切除术(laparoscopiccholecystectomy,LC)治疗胆囊结石伴慢性胆囊炎急性发作的疗效。 方法 回顾性分析2018年1月至2021年9月昆明医科大学第二附属医院肝胆胰外科二病区以及西双版纳傣族自治州人民医院普外科收治的胆囊结石伴慢性胆囊炎急性发作的患者61例,急性期均接受PTGD,其中40例患者再次入院而后行择期LC。对比PTGD前及LC前患者临床表现、实验室检查及影像学差异,并分析PTGD及LC相关并发症及术后情况。 结果 40例患者再次返院行择期LC,与PTGD前比较,患者的腹痛、发热等临床表现好转或消失;白细胞计数下降,谷丙转氨酶、谷草转氨酶下降,差异有统计学意义(P < 0.05);腹部B超提示:胆囊壁厚度变薄、胆囊最长径缩短,差异有统计学意义(P < 0.05);40例患者接受LC均在腹腔镜下完成手术,无中转开腹,无胆道损伤,无并发症,均治愈出院。 结论 PTGD联合择期LC治疗胆囊结石伴慢性胆囊炎急性发作疗效确切,可有避免胆道损伤,降低LC中转开腹率,确保患者安全。 -
关键词:
- 胆囊结石 /
- 慢性胆囊炎急性发作 /
- 经皮经肝胆囊穿刺引流术 /
- 腹腔镜胆囊切除术 /
- 疗效
Abstract:Objective To investigate the efficacy of ultrasound-guided percutaneous transhepatic cholecystectomy combined with elective laparoscopic cholecystectomy in the treatment of cholecystolithiasis complicated with acute onset of chronic cholecystitis. Methods 61 patients with cholecystolithiasis complicated with acute onset of chronic cholecystitis admitted to The 2nd Heptatopancreatobiliary Surgery Department of The Second Affiliated Hospital of Kunming Medical University and The General Surgery Department of Xishuangbanna Dai Autonomous Prefecture People’ s Hospital from January 2018 to September 2021 were retrospectively analyzed. All patients received PTGD in the acute stage, and 40 of them received elective LC after readmission. The clinical manifestations, laboratory examinations and imaging differences between patients before PTGD and before LC were compared, and PTGD and LC related complications and postoperative conditions were analyzed. Results 40 patients returned to the hospital again for elective LC. Compared with before PTGD, the clinical manifestations of the patients, such as abdominal pain and fever, were improved or disappeared. WBC count decreased, alanine aminotransferase and aspartate aminotransferase decreased, and the difference was statistically significant (P < 0.05). Abdominal ultrasound showed that the gallbladder wall thickness was thinner and the longest diameter of the gallbladder was shortened, with statistical significance (P < 0.05). All the 40 patients who received LC were operated under laparoscope without conversion to laparotomy, biliary tract injury or complications, and all were cured and discharged from hospital. Conclusion PTGD combined with elective LC is effective in the treatment of cholecystolithiasis with acute attack of chronic cholecystitis, which can avoid biliary tract injury and reduce the conversion of LC to laparotomy. -
糖尿病(diabetes mellitus,DM)是一组以慢性高血糖为特征的代谢性疾病。糖尿病周围神经病变(diabetic peripheral neuropathy,DPN)是糖尿病最常见的并发症之一,国内患病率达67.6%,其中重度 DPN患病率达19.3%[1]。雪旺细胞作为周围神经系统中最重要的髓鞘细胞,参与维持周围神经的正常结构和功能[2-3],炎症反应对雪旺细胞的损伤是DPN发生发展的重要因素[4]。核因子κB(nuclear factor kappa-b,NF-κb)级联反应是炎症反应的调控中心,抑制NF-κb通路,有望降低炎性细胞因子的表达,最终改善神经损伤[5]。
Mer受体酪氨酸激酶(Mer receptertyroshin kinase,Mertk)是受体酪氨酸激酶家族TAM成员之一,作为一种单跨膜受体可以通过结合多种配体将信号从细胞外基质转导至细胞质,调节众多生理过程[6-8]。现有文献显示[9-10],Mertk能够抑制促炎性细胞因子IL-12、干扰素和NF-κb的表达,从而抑制炎症信号转导。本课题前期利用公共数据库,发现并报道[11]Mertk基因表现出糖尿病周围神经病变的疾病特异性,但Mertk在雪旺细胞中的可能作用及其调控机制尚不清楚。为此,本研究通过沉默大鼠雪旺细胞内Mertk基因,探究Mertk是否通过调控炎症反应NF-κb通路相关蛋白B细胞κ轻肽基因增强子抑制因子激酶ε(inhibitor kappa B kinaseβ,Ikbkb)、P65、TNF-α,从而影响雪旺细胞炎症反应。
1. 材料与方法
1.1 主要仪器与试剂
AI1600超灵敏化学发光成像仪(GE公司,美国)和正置荧光显微镜(Olympus公司,日本)来源于昆明医科大学科技成果孵化中心,垂直电泳及湿式转膜系统购自北京六一生物科技公司。葡萄糖浓度为4.5 g/L(25 mmol/L)的DMEM培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素双抗和含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化液均购自美国GIBCO公司,无水葡萄糖购自广州光华科技有限公司,BCA蛋白浓度测定试剂盒购自上海碧云天公司,Mertk、Ikbkb抗体购自美国Abcam公司,P65抗体、TNF-α抗体、β-actin抗体、IgG抗体、抗兔/抗鼠第二抗体购自武汉Proteintech公司,免疫荧光试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司,免疫共沉淀试剂盒购自上海爱必信科技有限公司。
1.2 细胞培养
大鼠雪旺氏细胞株(RSC96)来自昆明医科大学科技成果孵化中心,生长所需细胞培养基配比是DMEM培养基∶胎牛血清∶双抗=100∶10∶1,放置在37℃、5% CO2饱和湿度的细胞培养箱中静置培养。
1.3 Mertk在高糖环境雪旺细胞中表达
将RSC96细胞随机分为对照组(25 mmol/L组)和处理组(50、75、100及125 mmol/L组)。首先使用不添加胎牛血清的培养基进行饥饿处理4 h,再将DMEM培养基中葡萄糖浓度分别调整至50 mmol/L、75 mmol/L、100 mmol/L及125 mmol/L,继续培养48 h,Western blot检测细胞内Mertk蛋白表达水平。
1.4 免疫共沉淀检测内源性Mertk、Ikbkb相互作用
培养3瓶RSC96细胞。以Lysis buffer∶PMSF=100∶1配制裂解液,将RSC96细胞裂解、超声、离心、留取Input蛋白,所得产物分别加入Mertk、Ikbkb、IgG一抗1~5 µg,4℃孵育过夜后加入5 µL Protein A与Protein G,再经过孵育、洗涤、离心、SDS缓冲液重悬、变性得到终产物,最后利用免疫印迹法检测Mertk与Ikbkb的相互作用。
1.5 免疫印迹法检测沉默Mertk后RSC96内Ikbkb、P65、TNF-α表达水平
将3种Mertk siRNA试剂(siRNA1 /siRNA2 /siRNA3)及空载对照(NC)利用GP-Transfect-Mate试剂转染进入RSC96细胞。48 h后根据BCA试剂盒说明书所述提取总蛋白,免疫印迹法检测Mertk、Ikbkb、P65、TNF-α表达水平。siRNA核苷酸序列见表1。
表 1 Mertk小干扰核苷酸序列Table 1. Mertk-RNA oligo sequences寡核苷酸 正义序列(5′-3′) 反义序列(5′-3′) Mertk-Rat-1 GGGUCGUACAUCUGUAAGATT UCUUACAGAUGUACGACCCTT Mertk-Rat-2 CACCCACUGAAGUCCAUAUTT AUAUGGACUUCAGUGGGUGTT Mertk-Rat-3 GAGGAAAGAUACAUCUUAATT UUAAGAUGUAUCUUUCCUCTT 1.6 免疫荧光法检测沉默Mertk后炎症因子TNF-α表达
在玻璃爬片上培养RSC96细胞,随机分为对照组(Con组)和实验组(siRNA3组),按组别处理细胞。48 h后细胞经过固定、通透、封闭等步骤后,分别加入Mertk(1∶200)、Ikbkb(1∶200)、P65(1∶200)一抗4℃孵育过夜,第2天加入相对应种属的荧光二抗暗室内孵育;DAPI染细胞核10 min后,将细胞爬片倒扣在滴有荧光淬灭剂的载玻片上,使用正置荧光显微镜观察并拍照。
1.7 统计学处理
采用SPSS23.0统计软件。计量资料采用Kolmogorov-Smirnov法检验数据正态性,符合正态分布时以均数±标准差($\bar x \pm s $)表示,多组间单因素比较采用单因素方差分析。P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 Mertk在雪旺细胞的表达
首先明确Mertk在雪旺细胞中是否表达,以及模拟糖尿病高糖环境下Mertk表达水平的变化情况。免疫印迹结果显示,Mertk在雪旺细胞中存在表达,且随葡萄糖浓度增加,细胞Mertk表达水平增加(P < 0.05),见表2和图1。
表 2 不同葡萄糖水平RSC96内Mertk蛋白表达Table 2. Mertk protein expression within RSC96 at different glucose levels灰度值
比值组别 F P 25 mmol/L 50 mmol/L 75 mmol/L 100 mmol/L 125 mmol/L Mertk/β-actin 0.60 ± 0.20 0.78 ± 0.19 0.81 ± 0.06 0.95 ± 0.09* 0.87 ± 0.11* 4.452 0.0098* 与对照组(25 mmol/L组)比较,*P < 0.05。 2.2 Mertk与Ikbkb内源性相互作用
以非特异免疫的同源抗体IgG作为阴性对照,以Input作为阳性对照,免疫共沉淀结果显示,RSC96细胞内同时表达Mertk、Ikbkb,且二者之间存在相互作用关系,见图2。
2.3 沉默Mertk对雪旺细胞Ikbkb、P65、TNF-α蛋白表达的影响
免疫印迹实验结果显示,3种siRNA均使Mertk表达含量下降(P < 0.05),同时Ikbkb、P65、TNF-α表达水平随Mertk表达水平的降低而升高(P < 0.05),见表3和图3。
表 3 沉默Mertk后Ikbkb、P65、TNF-α蛋白表达量Table 3. Ikbkb,P65,and TNF-α protein expression after silencing Mertk组别 Mertk
/β-actinIkbkb
/β-actinP65
/β-actinTNF-α
/β-actinCON 1.13 ± 0.22 0.38 ± 0.11 0.60 ± 0.12 0.60 ± 0.09 NC 1.28 ± 022 0.44 ± 0.22 0.57 ± 0.16 0.62 ± 0.19 siRNA1 0.68 ± 0.08* 1.10 ± 0.18* 1.22 ± 0.18* 1.05 ± 0.25* siRNA2 0.60 ± 0.24* 1.12 ± 0.02* 1.02 ± 0.09* 0.85 ± 0.04* siRNA3 0.60 ± 0.12* 1.18 ± 0.28* 0.95 ± 0.11* 1.19 ± 0.09* F 8.927 13.76 12.62 8.646 P 0.0025* 0.0004* 0.0006* 0.0028* 与CON组比较,*P < 0.05。 2.4 免疫荧光检测Mertk、Ikbkb、P65蛋白
以siRNA3转染RSC96细胞后,Mertk、Ikbkb、P65蛋白免疫荧光结果与免疫印迹实验一致,见图4。
3. 讨论
糖尿病周围神经病是糖尿病患者最常见的慢性并发症,是导致糖尿病患者截肢,生活质量下降及死亡的主要原因之一,加重社会负担[12]。糖尿病周围神经病变以神经纤维脱髓鞘、神经传导速度受损为特征[13],而雪旺细胞正是周围神经系统中最重要的髓鞘细胞;雪旺细胞损伤与凋亡是糖尿病周围神经病变的重要病理学特征之一,也是导致糖尿病髓鞘功能不良的主要因素[14]。因此,本研究以大鼠雪旺细胞作为研究对象,以此作为糖尿病周围神经病变研究的重要切入点,并且首先明确了Mertk在雪旺细胞中的表达,即随着细胞生长环境内葡萄糖浓度的提高,Mertk表达量也随之提高。
蛋白质通常不是作为单一物质发挥作用,而是以蛋白质-蛋白质相互作用的方式在活细胞生物过程中发挥作用。本研究结果通过免疫共沉淀实验,验证了雪旺细胞内Mertk与Ikbkb的内源性相互作用。Ikbkb(也称IKKβ、IKK2)是IKK复合体的催化亚基之一,而IKK复合体是NF-κb信号转导通路的关键调节因子,可迅速激活NF-κb,以协调大多数靶基因的表达[15-16]。因此,本实验试图进一步探究Mertk是否间接调控NF-κb通路,对雪旺细胞炎症反应产生影响。
为达到这一目的,本研究使用siRNA敲减沉默表达Mertk后,发现P65及其下游炎症因子TNF-α表达水平升高,表明NF-κb通路受到正向调控,雪旺细胞内炎症反应加重。经典的NF-κb系统是由亚基p50和P65组成的复合体,在大多数静息细胞中,NF-κb以抑制物IκB的形式存在。糖尿病病理过程产生的刺激,可导致IKK特异性地磷酸化IκB,进而允许p50和P65向细胞核发出信号,激活大量有关基因[17]。NF-κb通路调控的促炎细胞因子是神经血管损伤和神经传导速度受损的主要原因,抑制NF-κb通路,有望降低炎性细胞因子的表达,最终改善神经损伤[5]。由此,课题组推测,以Mertk基因为靶点进行研究可能为糖尿病周围神经病的治疗提供新的思路。
综上所述,本研究以雪旺细胞为研究对象,发现Mertk与Ikbkb相互作用,沉默Mertk可上调Ikbkb,继而激活NF-κb信号转导通路,上调P65及其下游炎症因子TNF-α表达水平。本研究对糖尿病周围神经病变的发病机制、临床药物的治疗、靶向药物的研发都有非常积极的作用,这些体外细胞实验也为进一步的动物体内实验以及临床血清分子标记验证打下了基础。
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表 1 40例胆囊结石伴慢性胆囊炎急性发作患者PTGD前后临床症状对比[n(%)]
Table 1. Comparison of clinical symptoms between 40 cases of acute onset of chronic cholecystitis before and after PTGD procedure [n(%)]
组别 n 腹痛 发热 胆囊结石伴慢性胆囊炎急性发作
第1次入院,PTGD前40 40(100.0) 26(65.0) 第2次入院,PTGD后 40 2(5.0) 0(0.0) χ2 72.381 38.519 p 0* 0* *P < 0.05。 表 2 40例胆囊结石伴慢性胆囊炎急性发作PTGD前后实验室检查指标比较(
$\bar x \pm s $ )Table 2. Comparison of laboratory indicators (WBC, ALT, AST) between 40 cases of acute onset of chronic cholecystitis before and after PTGD procedure (
$\bar x \pm s $ )组别 n WBC(×109/L) ALT(U/L) AST(U/L) 胆囊结石伴慢性胆囊炎急性发作 第1次入院,PTGD前 40 13.12 ± 6.40 36.30 ± 15.98 31.65 ± 13.22 第2次入院,PTGD后 40 7.95 ± 1.76 29.43 ± 10.87 25.80 ± 12.71 t 5.821 2.408 2.210 P 0.000* 0.021* 0.033* *P < 0.05。 表 3 40例胆囊结石伴慢性胆囊炎急性发作患者PTGD前后胆囊壁厚度、最大径对比(
$\bar x \pm s $ )Table 3. Comparison of the gallbladder wall and the longest diameter of the gallbladder under the Abdominal ultrasound between 40 cases of acute onset of chronic cholecystitis before and after PTGD procedure (
$\bar x \pm s $ )组别 n 胆囊壁厚度(cm) 胆囊最长径(cm) 胆囊结石伴慢性胆囊炎急性发作 第1次入院,PTGD前 40 0.54 ± 0.21 10.46 ± 2.11 第2次入院,PTGD后 40 0.34 ± 0.11 5.97 ± 1.64 t 6.787 11.828 p 0.000* 0.000* *P < 0.05。 -
[1] Go Wakabayashi,Yukio Iwashita,Taizo Hibi,et al. Tokyo guidelines 2018:Surgical management of acute cholecystitis:safe steps in laparoscopic cholecystectomy for acute cholecystitis[J]. J Hepatobiliary Pancreat Sci,2018,25(1):73-86. doi: 10.1002/jhbp.517 [2] Yasuhisa Mori,Takao Itoi,Todd H. Baron,et al. Tokyo Guidelines 2018:Management strategies for gallbladder drainage in patients with acute cholecystitis[J]. J Hepatobiliary Pancreat Sci,2018,25(1):87-95. doi: 10.1002/jhbp.504 [3] KazunosukeYamada,Yuichi Yamashita,Teppei Yamada,et al. Optimal timing for performing percutaneous transhepatic gallbladder drainage and subsequent cholecystectomy for better management of acute cholecystitis[J]. J Hepatobiliary Pancreat Sci,2015,22(12):855-861. doi: 10.1002/jhbp.294 [4] 王艺桦,范罡贤,匡立润,等. GRADE II 急性胆囊炎PTGD治疗对手术疗效的影响及行LC的手术时机选择[J]. 大连医科大学学报,2021,43(2):127-133. [5] Masamichi Yokoe,Jiro Hata,Tadahiro Takada,et al. Tokyo Guidelines 2018:Diagnostic criteria and severity grading of acute cholecystitis[J]. J Hepatobiliary Pancreat Sci,2018,25(1):41-54. doi: 10.1002/jhbp.515 [6] 张崇,沈思思,王明辉,等. 急性重症胆囊炎PTGD后再行腹腔镜胆囊切除术最佳时机的Meta分析[J]. 中国现代普通外科进展,2021,24(6):427-433. [7] 邱明,吴向未,杨宏强,等. 急性胆囊炎经皮经肝胆囊穿刺引流术后手术时机的选择[J]. 实用医学杂志,2014,30(18):2911-2914. doi: 10.3969/j.issn.1006-5725.2014.18.014 [8] Yunxiao Lyu,Ting Li,Bin Wang,et al. Early laparoscopic cholecystectomy after percutaneous transhepatic gallbladder drainage for acute cholecystitis[J]. Scientific Reports,2021,11(1):2516. doi: 10.1038/s41598-021-82089-4 [9] Hye Woen Jeon,Kyung Uk Jung,Mi Yeon Lee,et al. Surgical outcomes of percutaneous transhepatic gallbladder drainage in acute cholecystitis grade II patients according to time of surgery[J]. Asian Journal of Surgery,2021,44(1):334-338. [10] 邓海成,蔡云峰,崔伟珍,等. 急性重症胆囊炎腹腔镜手术前PTGD的效果分析[J]. 岭南现代临床外科,2010,10(3):175-177,180. doi: 10.3969/j.issn.1009-976X.2010.03.006 [11] Koetsu Inoue,Tatsuya Ueno,Orie Nishina,et al. Optimal timing of cholecystectomy after percutaneous transhepatic gallbladder drainage for severe cholecystitis[J]. BMC Gastroenterology,2017,17(1):71. doi: 10.1186/s12876-017-0631-8 [12] 韦萍,陈闯,杨士彦,等. PTGBD联合LC序贯治疗在老年急性胆囊炎中的应用[J]. 中国现代普通外科进展,2018,21(8):635-637. [13] Michele Pisano,Niccolo Allieve,Kurinchi Gurusamy,et al. 2020 World society of emergency surgery updated guidelines for the diagnosis and treatment of acute calculus cholecystitis[J]. World Journal of Emergency Surgery,2020,15(1):61. doi: 10.1186/s13017-020-00336-x [14] 李博,郑香玉. PTGD 联合早期腹腔镜胆囊切除术对急性重症胆囊炎患者炎性因子的影响[J]. 临床医学工程,2021,28(1):29-30. doi: 10.3969/j.issn.1674-4659.2021.01.0029 [15] 张涛. 保守治疗配合PTGD择期LC与急诊LC治疗AC的疗效比较[J]. 系统医学,2020,5(23):22-25,42. [16] 许承,郑跃,王军,等. PTGD 术后择期LC对GRADE II急性胆囊炎患者手术效果的影响[J]. 实用医学杂志,2018,34(7):1119-1122. doi: 10.3969/j.issn.1006-5725.2018.07.018 [17] Chang Wei Ke,Shuo Dong Wu. Comparison of emergency cholecystectomy with delayed cholecystectomy after percutaneous transhepatic gallbladder drainage in patients with moderate acute cholecystitis[J]. Journal of Laparoendoscopic & Advanced Surgical Techniques,2018,28(6):705-712. [18] 邢人伟,聂韩秋,张阳,等. 老年急性胆囊炎患者经胆囊穿刺引流术后不同时期行腹腔镜胆囊切除的效果分析[J]. 浙江医学,2021,43(1):70-73. doi: 10.12056/j.issn.1006-2785.2021.43.1.2019-2347 期刊类型引用(1)
1. 李慧利,陈浩,叶风丽,张津,张铭豪,周长浩,高巍巍. 丙泊酚对吗啡镇痛致皮肤瘙痒反应和胃泌素释放肽水平的影响. 中国医刊. 2022(12): 1341-1344 . 百度学术
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