Methamphetamine Alters Methylation Modifications of Synaptic Plasticity Genes in Addicted Mice
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摘要:
目的 研究慢性甲基苯丙胺（methamphetamine，MA）成瘾小鼠神经突触可塑性基因的表达变化情况。 方法 选用C57BL/6J小鼠，模拟人类药物成瘾模式，分段渐进性腹腔注射给药5 mg/kg、10 mg/kg或者生理盐水。选取小鼠的大脑皮质和海马组织，通过亚硫酸氢盐处理基因组DNA和甲基化特异性PCR （methylmion specific PCR，MSP）对突触可塑性基因表达水平进行检测，运用BiQ-Analyzer软件对测序结果进行比对和DNA甲基化分析。 结果 相比盐水处理组小鼠，MA成瘾组小鼠大脑皮层的Egr2 （P = 0.064）基因启动子CpG位点的甲基化修饰增加，而Eln（P = 0.083）基因启动子的甲基化修饰降低；海马组织中，Arc（P = 0.025）、Egr2（P = 0.034）基因甲基化修饰增加，而Eln（P = 0.063）基因甲基化修饰降低。 结论 突触可塑性基因的甲基化修饰可能参与MA成瘾机制的形成。 Abstract:Objective To investigate the expression changes of synaptic plasticity genes in chronic methamphetamine （MA） addicted mice. Methods C57BL/6J mice were selected to simulate the human drug addiction model, and the drugs were injected intraperitoneally with 5 mg/kg, 10 mg/kg or normal saline. The cerebral cortex and hippocampus of mice were selected, and the gene expression level of synaptic plasticity was detected by bisulfite treated genomic DNA and methylation specific PCR （MethylmionSpecificPCR, MSP）. The sequencing results were compared and DNA methylation was analyzed by BiQ-Analyzer software. Results Compared to mice in the saline-treated group, MA addiction group mice showed increased methylation modification of the Egr2 （P = 0.064） gene promoter CpG site and decreased methylation modification of the Eln （P = 0.083） gene promoter in the cerebral cortex; in hippocampal tissue, methylation modification of the Arc （P = 0.025） and Egr2 （P = 0.034） genes was increased, while Eln （P = 0.063） gene methylation modifications were decreased. Conclusion Methylation of synaptic plasticity genes may be involved in the formation of MA addiction mechanism. -
Key words:
- Methamphetamine /
- Synaptic plasticity /
- Immediate early gene /
- DNA Methylation.
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子宫颈癌（cervical cancer，CC）的高发病率和高死亡率在全球呈上升趋势，威胁着女性的生命健康，在2020年全球有60.41万例新发病例并有34.18万死亡病例[1]。中国国家癌症中心发布的《2022年全国癌症报告》研究显示，中国子宫颈癌新发病例约11.93万例，死亡人数约3.72万例[2]。近95%的CC病例是由于高危型人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）持续感染，其中在约200种已确定的HPV毒株中，高危HPV16和HPV18占HPV相关宫颈癌的75%[3−4]。这种疾病往往在发展到晚期才被发现，而肿瘤细胞的恶性增殖以及无法控制的转移是宫颈癌复发和治疗失败的主要原因[5]。
HPV 编码的早期蛋白 6 （E6） 和早期蛋白 7 （E7） 过与 TP53 和 pRB 蛋白相互作用来解除细胞周期的调节，从而在细胞转化中发挥重要作用，增强癌细胞增殖并促进癌症进展[6−7]。研究表明，HPV18 E6癌蛋白干扰上皮细胞极性Par3蛋白，促进肿瘤进展[8]。HPV E6除了与P53结合使 p53 降解外，HPV E6还能与其它蛋白相互作用，包括端粒酶、Myc、Akt、Wnt、mTORC1。随着HPV E6作用的深入研究，HPV E6可影响CC进展的多个步骤，但其机制尚不明确。
因此，为探索宫颈癌中HPV16 E6基因对其恶性进展的影响，本研究采用Illumina Hiseq 技术，通过转录组学筛选HPV16 E6感染后不同病变程度宫颈组织的差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs），并将DEGs进行富集分析筛选相关信号通路。通过慢病毒转染、Western blot和肿瘤细胞恶性化表型等实验方法检测及验证，为探索子宫颈癌相关分子的致病机制提供理论基础。
1. 材料与方法
1.1 研究对象
本研究中涉及的12例样本分别取自2015年6月至2017年3月期间新疆医科大学第一附属医院妇科住院患者的宫颈病变组织（分别为正常宫颈HPV阴性、正常宫颈HPV 16阳性、CIN HPV 16阳性和宫颈癌HPV 16阳性组织各３例）。标本术前均未接受过放化疗或其他特殊处理且，入组前均经过新疆医科大学第一附属医院病理科医师确诊，患者及家属均签署知情同意书。本研究已得到了新疆医科大学第一附属医院伦理委员会的批准（20130216-147）。
1.2 实验材料
人源宫颈癌Hela（HPV+）细胞，HCerEpiC人子宫颈上皮细胞购买于国家实验细胞资源共享平台；胎牛血清FBS、青-链霉素PS、DMEM培养基购买于上海逍鹏生物科技有限公司，sh-E6、OE-Rap1、空载sh-NON慢病毒由上海吉凯生物科技有限公司构建。一抗HPV16 E6抗体（sc-460）购买于美国 Santa Cruz Biotechnology 公司，Rap1（68125-1-Ig）、Rap1GAP（19174-1-AP）、CyclinD1（60186-1-Ig）、GADPH（10494-1-AP）购自美国Proteintech Group公司； E-Cadherin（WL01482）、 N-Cadherin（WL01047）沈阳万类生物科技有限公司；Matrigel胶（356234）购买于美国康宁CORNING公司；1%结晶紫染色液（G1062）购买于北京索莱宝科技有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 宫颈病变组织基于HiSeq平台对其进行转录组测序分析
采用Illumina TruseqTM RNA sample prep Kit 方法构建测序所需的文库，实验步骤分为以下（1）从宫颈病变组织中提取总的RNA，用Oligo （dT）的磁珠与ployA碱基配（A-T），从中分离 mRNA，用于下游实验的文库构建、转录组测序及分析等；（2）实验中需要短序列片段进行测序，加Fragmentation buffer，打断上述富集得到的mRNA序列，使其长度为1.5～2 kb；（3）以（2）步骤的mRNA为模板反转合成一链cDNA，随后进行二链合成，形成稳定的双链结构。（4）连接adaptor及上机进行转录组测序。
1.3.2 生物信息学分析
应用KEGG PATHWAY 数据库（https://www.genome.jp/kegg/）对差异基因进行通路富集分析。使用在线软件 GO 分析（http://geneontology.org/） 对富集途径中的基因功能进行分析，包括分子功能（Molecular function）、生物过程（Biological process）和细胞组成（Cellular component）3个部分。
1.3.3 慢病毒转染和分组
sh-E6慢病毒、其对照慢病毒（sh-NON）以及Rap1过表达病毒根据上海吉凯有限公司的转染操作步骤进行病毒转染，将对数生长的Hela细胞进行胰酶消化，配置4×104个/mL细胞悬液，分别吸取1 mL细胞悬液于6孔板中，待细胞量达40%时，细胞立即进行饥饿培养；24 h后弃培养基，加含血清培养基加入慢病毒溶液，转染48 h后，使用1 µg/µL嘌呤霉素用于筛选慢病毒转进的细胞，荧光显微镜观察并拍照。将筛选存活细胞用0.5 µg/mL嘌呤霉素继续培养，过表达Rap1病毒的转染方法与sh-E6方法相似，其中筛选稳转细胞株使用500 µg/µLG418。
1.3.4 Western blot检测
收集细胞样品裂解并通过蛋白质免疫印迹法进行检测，以确定各组细胞中相关蛋白的表达情况。其主要步骤为：通过10%SDS-PAGE凝胶分离蛋白样品，并将其转移至PVDF膜。抗体稀释：E6（1∶
3000 ）、CyclinD1（1∶10000 ）、Rap1（1:5000 ）、Rap1GAP （1∶4000 ）、E-Cadherin （1∶4000 ）、N-Cadherin （1∶1000 ）和GADPH（1∶35 000）。将PVDF膜置于提前用TBST配制的10%脱脂牛奶溶液中进行常温封闭1.5 h，一抗室温孵育100 min，HRP标记的二抗（兔抗稀释比1∶20 000；鼠抗稀释比例1∶10 000）室温避光孵育2 h，最后使用增强化学发光（ECL）检测试剂进行蛋白条带显影。1.3.5 CCK-8和平板克隆实验检测细胞增殖和集落形成能力
取生长状态良好的细胞制备成每100 µL2 000个细胞悬液加入96孔板中，在不同的时间段取出96孔细胞培养板，加入含10%的CCK-8试剂的培养基，37℃孵育0.5～4 h，用酶标仪测定450 nm处的每组细胞吸光度数值。使用3.5 cm培养皿进行克隆形成试验，将不同分组的细胞以1×103个细胞/皿进行培养，培养7～15 d观察集落大小和数量。
1.3.6 Transwell和划痕实验检测细胞侵袭和迁移能力
Transwell上室在实验前3 h加入60 µL的1 mg/mL的Matrigel，培养箱中放置3 h，超净台内将上室多余液体吸弃，随后向上室中加入5×104/200 μL的无血清的细胞悬液，下室含600 μL含有血清完全培养基；24 h后，取出小室，使用提前准备好的PBS洗涤细胞3次，每次5 min， 4%多聚甲醛固定细胞，置于室温15 min；弃去多聚甲醛，PBS洗涤细胞2次，每次10 min，加入600 μL 1%结晶紫染色液，37 ℃条件下放置20 min；用PBS冲洗3次，每次10 min，染色后用显微镜观察并拍照。使用记号笔在12孔板背后快速划平行线，每组细胞以每毫升5×104个细胞的密度接种于12孔板中，24 h后弃去培养基，用温育的PBS洗涤细胞，用直尺比着，使用20 µL枪头垂直于12孔板和记号线制造细胞划痕，使划痕与标记线相交，PBS洗涤细胞，用显微镜照相，作为0 h对照。
1.4 统计学处理
采用GraphPad Prism 7.0软件和SPSS 19.0软件进行统计学分析，统计结果以均数±标准差（$\bar x \pm s $）表示，采用独立样本t检验比较2组变量，应用单因素方差分析比较多组间变量，两两比较运用LSD-t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 HPV 16感染宫颈病变组织的差异基因筛选和功能富集分析
转录组测序结果显示，与正常宫颈（HPV阴性）相比较，正常宫颈、CIN 和宫颈癌（HPV 16阳性）组织分别筛选出340、864和
1036 个差异基因。将3组数据进行排序，做出差异排序图，可视化差异分析后的结果，见图1A。取3组数据间差异基因的交集，共有差异基因225个，见图1B，根据log2FC≥2，P < 0.01为筛选标准，筛选差异基因并取差异基因的交集，共有24个。将24个差异基因进行GO|KEGG 富集分析，差异表达基因主要富集在Rap1相关信号通路（如Rap1/Rap1GAP），见图1C。
图 1 HPV 16感染宫颈病变组织中差异基因的筛选和功能富集分析A：可视化差异排序图 B:3组数据间差异基因的交集 C：差异表达基因KEGG通路分析注：N_HPV_P_vs_NC_HPV_N：正常宫颈（HPV 16阳性）vs 正常宫颈（HPV阴性）；N_HPV_N_vs_CIN_HPV_P：正常宫颈（HPV阴性）vs CIN（HPV 16阳性）；N_HPV_N_vs_CA_HPV_P：正常宫颈（HPV阴性）vs 宫颈癌（HPV 16阳性）。Figure 1. Screening and functional enrichment analysis of differential genes in HPV 16-infected cervical lesions2.2 HeLa、HCerEpiC细胞中Rap1/Rap1GAP通路的比较
通过筛选HPV 16感染宫颈病变组织的差异基因并进行功能富集分析，差异表达基因主要富集在Rap1相关信号通路（如Rap1/Rap1GAP），应用Western blotting 实验验证正常宫颈上皮HCerEpiC细胞和宫颈癌HeLa细胞中Rap1和Rap1GAP蛋白表达水平。与HCerEpiC组相比较，宫颈癌HeLa组中Rap1表达量升高（t = -18.58，P < 0.01），Rap1GAP表达量降低（t = 6.88，P < 0.05），见图2。
图 2 HPV 16感染激活宫颈癌Hela细胞内Rap1/Rap1GAP通路（$ \bar x \pm s$，n = 3）A：Western blot检测结果；B：HeLa、HCerEpiC细胞中Rap1/Rap1GAP通路关键蛋白相对表达水平；与HCerEpiC组相比，*P < 0.05，**P < 0.01。Figure 2. HPV 16 infection activates the Rap1/Rap1GAP pathway in Hela cells of cervical cancer （$ \bar x \pm s$，n = 3）2.3 HeLa与HCerEpiC细胞增殖、侵袭和迁移能力的比较
Rap1是Ras家族成员之一，属于小分子G蛋白，其主要功能影响癌细胞的增殖、侵袭和转移等。因此应用平板克隆实验、侵袭实验及划痕实验分别检测细胞的增殖，侵袭和迁移能力。结果表明，第2周时HCerEpiC组细胞的集落克隆数低于对照Hela组（t = 14.93，P < 0.01），见图3A。与HCerEpiC组比较，Hela组细胞侵袭能力增强（t = 16.20，P < 0.01），见图3B，迁移能力也增强。以上结果表明，HPV E6表达可使增强宫颈癌Hela细胞的增殖、侵袭和迁移能力。
图 3 HPV 16感染促进宫颈癌Hela细胞增殖、侵袭和迁移能力（$\bar x \pm s$，n = 3）A：细胞平板克隆实验结果；B：Transwell实验结果（标尺为100 μm）；C：细胞划痕实验结果（标尺为100 μm）；与HCerEpiC组相比，**P < 0.01。Figure 3. HPV 16 infection promotes the proliferation，invasion and migration of Hela cells （$\bar x \pm s$，n = 3）2.4 HPV16 E6低表达细胞株构建
荧光倒置显微镜观察对转染HPV16编码E6基因慢病毒的宫颈癌Hela细胞，明确sh-E6和sh-NON组病毒转染的效果，见图4A。应用Western blotting 实验验证sh-E6、sh-NON组和Hela细胞中HPV E6蛋白表达水平。与Hela组相比较，sh-E6 组中HPV E6表达量降低（F = 143.8，P < 0.001），见图4B。
图 4 宫颈癌Hela细胞慢病毒转染效率（$\bar x \pm s $，n = 3）A：荧光倒置显微镜下观察各组细胞的荧光表达情况（标尺为100 μm）；B：Western blot检测慢病毒转染Hela细胞后HPV E6蛋白表达；与Hela组相比，***P < 0.001。Figure 4. Lentivirus transfection efficiency of Hela cells of cervical cancer （$\bar x \pm s $，n = 3）2.5 HPV E6表达对宫颈癌细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响
平板克隆实验结果表明，第2周时sh-E6组细胞的集落克隆数低于对照Hela组（F = 90.93，P < 0.001），见图5A。CCK-8结果表明，与Hela组相比，24、36和48 h时sh-E6组细胞的活力显著降低（P < 0.001），见图5B。与Hela组比较，sh-E6组细胞侵袭能力降低（F = 103.2，P < 0.001），见图5C。与Hela组比较，sh-E6组细胞迁移能力降低，见图5D。以上结果表明，下调HPV E6表达可减弱Hela细胞的增殖、侵袭和迁移能力。
图 5 下调HPV E6表达后各组宫颈癌细胞增殖、侵袭和迁移能力（$\bar x \pm s $，n = 3）A：细胞平板克隆实验结果；B：CCK-8实验结果；C：Transwell实验结果（标尺为100 μm）；D：细胞划痕实验结果（标尺为100 μm）；与Hela组相比，***P < 0.001。Figure 5. Proliferation，invasion and migration of cervical cancer cells in each group after down-regulating HPV E6 expression （$\bar x \pm s $，n = 3）2.6 HPV E6通过Rap1信号通路调控宫颈癌细胞增殖、侵袭和迁移
应用Western blotting检测下调HPV E6后Rap1信号通路相关蛋白Rap1和Rap1GAP以及增殖相关的蛋白CyclinD1、E-Cadherin和 N-Cadherin的表达。结果显示，与Hela组相比，sh-E6组细胞内Rap1、CyclinD1、N-cadherin的表达降低，Rap1GAP和E-cadherin表达增强（P < 0.001），见图6A。下调HPV E6的同时过表达Rap1，Western blotting结果显示，与sh-E6组相比，过表达Rap1组（sh-E6/OE Rap1）细胞内Rap1、CyclinD1、N-cadherin的表达增高，Rap1GAP和E-cadherin表达降低（P < 0.001），见图6B，其细胞的增殖、侵袭和迁移能力显著被恢复（P < 0.001，P < 0.01），见图6C、D和E。
图 6 HPV E6通过Rap1信号通路调控宫颈癌细胞增殖、侵袭和迁移（$\bar x \pm s $，n = 3）A：Western blot检测Hela细胞下调HPV E6后Rap1信号通路中相关蛋白的表达；B：Western blot检测下调HPV E6后再次过表达Rap1细胞内Rap1信号通路中相关蛋白的表达；C：细胞平板克隆实验结果；D：Transwell实验结果（标尺为100 μm）；E：细胞划痕实验结果（标尺为100 μm）；与sh-E6组相比，***P < 0.001；与sh-NON组相比，###P < 0.001，##P < 0.01。Figure 6. HPV E6 by Rap1 signaling pathways regulating the cervical cancer cell proliferation，invasion and migration （$\bar x \pm s $，n = 3）3. 讨论
2020年我国宫颈癌新发病例11万，死亡病例近6万，可见宫颈癌依然严重危害着女性健康[1]。新疆地区HPV阳性率较高，宫颈病变患者HR-HPV感染率前五的亚型分别是：HPV16、52、58、39、51/53型[9]。研究证实，宫颈癌的发生与高危型的HPV感染密切相关，尤其是16/18型的感染[10]。HPV是一种双链DNA病毒，其基因组可分为早期区域（E）、晚期区域（L）和长控制区域。HPV病毒编码的致癌基因E6和E7不仅编码主要的致癌蛋白，而且在宫颈癌的肿瘤微环境及免疫逃逸中发挥着关键作用[11−12]。已知高危型HPV16 E6参与众多信号通路的活化，从而介导细胞的增殖、侵袭、转移行为及免疫相关等，促进宫颈癌的恶性进展[13−15]。研究显示，HPV16 E6与NFX1-123相互作用，且HPV16 E6影响NFX1-123的亚细胞定位，促进HR-HPV感染的宫颈上皮向宫颈癌发生[16]。本研究聚焦HPV E6基因，筛选异常活化的相关通路及有效的生物靶点，探索HPV E6在宫颈癌前病变过程及宫颈癌的具体作用。
本研究通过转录组高通量测序，获得HPV16 E6感染不同病变程度的宫颈组织所有转录本和所有转录信息，研究 HPV16 E6蛋白在宫颈癌致瘤中的作用机制。在转录组学测序中，筛选与HPV相关的差异基因；并利用GO、KEGG Pathway 方法对差异基因进行生物学功能富集分析；差异表达基因主要富集在Rap1相关信号通路。Rap1是一种与Ras蛋白具有高度同源性的小GTPase蛋白，其活性可被GEFs（鸟嘌呤核苷酸交换因子）和GAPs（GTPase激活蛋白）调节，从而使其在GTP结合（活性状态）和GDP结合（非活性状态）二者之间循环，在各自的信号传导途径中充当分子开关[17] ，其异常活化与肿瘤的恶性增殖和侵袭相关[18−19]。为了证明差异基因富集Rap1通路与HPV相关，笔者选择宫颈癌HeLa细胞、正常宫颈上皮HCerEpiC细胞进行验证，发现HPV感染的Hela细胞的Rap1表达增高，同时细胞增殖活性变强、其侵袭和迁移的能力同样增强。
Rap1在多种肿瘤中过表达与肿瘤细胞侵袭迁移密切相关[20−21]，但Rap1的作用在HPV16 /18感染方面的研究少有报道，尤其对宫颈癌中发生发展的分子机制尚不明确。首先，笔者下调Hela细胞HPV E6表达，细胞增殖、侵袭及迁移能力降低。进一步检测增殖与侵袭迁移相关的关键蛋白，结果发现下调HPV E6使肿瘤细胞中CyclinD1、N-cadherin蛋白表达降低，同时E-cadherin蛋白表达异常升高（P < 0.001）。通过Western blot检测细胞内Rap1信号通路关键蛋白Rap1表达降低， 其下游Rap1GAP表达增高（P < 0.001）。下调HPV E6的同时过表达Rap1，过表达Rap1细胞细胞的增殖、侵袭和迁移能力显著被恢复，CyclinD1、N-cadherin的表达异常增高，Rap1GAP和E-cadherin表达降低（P < 0.001）。提示HPV E6可能通过Rap1信号通路的异常活化，从而在癌细胞的增殖、侵袭及迁移中发挥关键作用。
综上所述，本研究结果表明，在宫颈癌发展过程中，HPV E6通过激活Rap1信号通路促进宫颈癌细胞增殖、侵袭及迁移，为治疗宫颈癌提供研究基础。
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图 1 生理盐水处理组和MA处理组大脑皮质和海马组织CpG岛甲基化修饰对比
A：生理盐水处理组和MA处理组大脑皮质基因组和海马组织基因组Arc启动子BSP测序结果，在海马组织中Arc（P < 0.05）；B：生理盐水处理组和MA处理组大脑皮质基因组和海马组织基因组Fos启动子BSP测序结果；C：生理盐水处理组和MA处理组大脑皮质基因组和海马组织基因组Egr2启动子BSP测序结果，在海马组织中Egr2（P < 0.05）；D：生理盐水处理组和MA处理组大脑皮质基因组和海马组织基因组Egr4启动子BSP测序结果。甲基化的CpG位点用实心圆圈表示、非甲基化的CpG位点用空心圆圈表示。一个测序克隆为一行。
Figure 1. Comparison of Methylation modification of CpG islands in cerebral cortex and hippocampus between saline treated group and MA treated group
图 2 生理盐水处理组和MA处理组大脑皮质和海马组织CpG岛甲基化修饰对比
A：生理盐水处理组和MA处理组海马组织基因组Dusp1启动子BSP测序结果；B：生理盐水处理组和MA处理组海马组织基因组Eln启动子BSP测序结果，在海马组织中Eln（P = 0.063）。甲基化的CpG位点用实心圆圈表示、非甲基化的CpG位点用空心圆圈表示。一个测序克隆为一行。
Figure 2. Comparison of CpG island Methylation modifications in hippocampal tissues between the saline group and the MA treatment group
表 1 BSP引物表（5′→3′）
Table 1. Primer list for BSP （5′→3′）
基因 正向引物 反向引物 Fos GTGGGTAAGTTTTATTTTAGGA TAAAAAATCTCCTAAACCTTCC Arc GTATATTGTGTGGTTAGGATGG TAAAACCCTAACTCCCATTAAC Egr4 AATAAATTGGTATTAGGTGGGAAT CAATCCCCCCACTTATATAACTA Egr2 TTTAGTTTGGGTAGGGAAGAAA CTAACTTCCCTACTCCCCATT Dusp1 GGTGGGAATTAATTGGAAGTAT CACCCTCCTATCCTCTAAACTC Eln AGGAGGTTTGTAAGTTTGGTTTT AAATTCCCCATCAATCTTACC 
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