The Correlation between AMH Levels in Serum and Follicular Fluid and the Number of Retrieved Oocytes During COH
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摘要:
目的 研究控制性超促排卵（COH)过程中血清AMH的动态变化、大中卵泡液中AMH水平与获卵数的相关性。 方法 检测自然月经周期2～4 d基线（BL）、卵泡刺激第6天（S6）及扳机日（Trigger）血清中AMH值；检测大、中卵泡液中AMH值。分析血清AMH的动态变化，及其与获卵数的关系。比较大、中卵泡液中AMH水平与获卵数的关系。 结果 （1）血清AMH与获卵数呈正相关，BL与trigger、S6与trigger血清AMH有显著性差异P < 0.05；（2）大卵泡液AMH值与获卵数呈正相关，大、中卵泡液AMH差异有统计学意义P < 0.05；（3）AMH值从BL到S6呈缓慢上升，获卵数越多上升越明显；从S6到trigger日AMH值快速下降，获卵越多下降越明显。 结论 COH过程中，血清AMH呈波动变化，动态监测AMH值可预测获卵数；对Gn量的调整可能存在一定的指导意义。 Abstract:Objective To study the dynamic changes of serum AMH during different periods of treatment in patients who received the treatment of controlled ovarian hyperstimulation （COH） and to observe the correlation between AMH level in large and medium follicular fluid and the number of retrieved oocytes. Methods Serum AMH levels were measured on days 2-4 of natural menstrual cycle of baseline （BL）, day 6 of follicular stimulation （S6） and day trigger. The AMH levels in the fluid of large and medium follicles were detected. The dynamic changes of serum AMH and its relationship with the number of retrieved oocytes were analyzed. The relationship between the level of AMH and the number of retrieved oocytes was compared between large and medium follicular fluid. Results （1） There was a positive correlation between serum AMH and the number of retrieved oocytes. There was a significant difference in serum AMH between BL and trigger, S6 and trigger （P < 0.05）; （2） The value of AMH in large follicular fluid was positively correlated with the number of retrieved oocytes, and there was significant difference between large and medium follicular fluid （P < 0.05）; （3） The value of AMH increased slowly from BL to S6, and the more the number of retrieved eggs, the more obvious the increase; The AMH value decreased rapidly from S6 to trigger day, and the more oocytes were retrieved, the more obvious the decrease was. Conclusion Serum AMH fluctuates during COH, and dynamic monitoring of AMH can predict the number of retrieved oocytes; There may be some guiding significance for the adjustment of Gn. -
基础血清AMH是评估卵巢储备的可靠指标[1, 2]。在COH治疗前，测定血清中基础AMH的水平，对于促排方案以及促性腺激素（Gn）的起始剂量的制定有着非常重要的意义。不仅减少了IVF-ET助孕过程中由于Gn使用不当所导致的副作用[2]，尤其对于OHSS的预防上，由于减少了Gn的使用剂量，从而降低了OHSS的发生率，减少了患者住院治疗的比例，降低了患者的治疗成本，提高了治疗的安全性[3, 4] 。2017年国内一项关于COH患者AMH动态变化与临床结局的一项研究发现[5]，促性腺激素（Gn）启动5 d血清AMH水平与获卵数、M2卵数和可利用胚胎数相关性最强。然而，其他关于COH过程中动态观察血清AMH以及大中卵泡液AMH的水平与获卵数的相关性研究，在血清AMH检测时段和卵泡液收集方法上尚无统一观点，仍需进一步探索。关于控制性超促排卵（controlled ovarian hyperstimulation，COH）过程中AMH的动态变化，国内外研究结果差异较大[6]，本研究就以上问题进行设计观察，并将结果报道如下。
1. 资料与方法
1.1 研究对象
选择2019年11月至2020年12月在昆明市妇幼保健院生殖中心行IVF/ICSI-ET控制性超促排卵（controls ovulation hyperstimulation，COH）治疗的177例患者。参考国内相关研究[5]结合本研究的特点制定以下标准。纳入标准：（1）所有对象均为控制性超排卵（COH）方案；（2）年龄25～45岁；（3）体重指数（BMI）18～25 kg/m2。排除标准：（1）与妊娠结局相关的染色体异常；（2）生殖系统畸形；（3）非真性空卵泡综合征。
患者资料：该研究经昆明市妇幼保健院伦理委员会批准后，所有患者及家属均知情、同意并已签署知情同意书。
1.2 研究方法
1.2.1 观察指标
（1）不同时段血清AMH水平:月经2～4即基线（BL）、促性腺激素（Gn）使用第5天（S6）、扳机日（Trigger）；（2）卵泡液中AMH水平：取卵日卵卵泡直径≥16 mm的大卵泡，取卵日卵泡直径14～15 mm。
1.2.2 血清AMH测定
待测患者分别于基线（BL）， 促排卵第６天（S6）和扳机日（trigger）抽取静脉血，测定血清AMH值（全自动化学发光免疫分析仪。型号：Kaeser6600，试剂：抗缪勒氏管激素（AMH）测定试剂盒）。
1.2.3 卵泡液的采集及AMH测定
卵泡液采集方法为：取卵日采用阴道B超引导下取卵术，将卵泡液按照卵泡直径大小进行分组，具体如下：大卵泡直径为≥16 mm的卵泡，中卵泡为直径14～15 mm的卵泡，分别穿刺取卵后留取无明显血染的卵泡液；排除空卵泡的卵泡液，以500 g离心10 min，取上清液分装于冷冻管中，置于-20 ℃冰箱保存备用。分别检测，并避免反复冻融，以保证测定的可靠性和稳定性。
1.3 统计学处理
采用SPSS 21.0软件进行统计分析，计量资料经正态性检验，符合正态分布以（
$\bar x \pm s $ ）表示，并行t检验（2组）或方差分析（多组）；不服从正态分布用[M（P25，P75）]描述，采取采取Mann-Whitney U检验（2组）或Kruskal-Wallis H检验（多组），相关性分析采用线性相关（Pearson’ s）。检验水准$ \alpha = 0.05 $ 。2. 结果
177例患者平均年龄（30.70±4.11）岁，最小21岁，最大42岁；不孕原因为女方因素81例，占45.80%，男方因素19例，占19.11%，男女双方因素有77例，占43.50%；选择拮抗剂方案87例，占49.15%，黄体期长方案86例，占48.59%，PPOS方案4例，占2.26%。
2.1 2 不同时段血清AMH值检测结果比较
3个不同时段AMH均为偏态分布（峰度系数和偏度系数均大于1.96），血清BL日AMH值[3.32（1.85，5.01）] ng/mL，S6日AMH值[3.23（1.72，5.15）] ng/mL，trigger日AMH值[1.63（0.83，2.70）] ng/mL。 经秩和检验，3个不同时段AMH值不全相同（P < 0.001），见表1。
表 1 不同时段AMH值比较（ng/mL）Table 1. Comparison of serum AMH level at different time points （ng/mL）分组 中位数 百分位数（P） χ2 P 25 75 血清BL值 3.32 1.85 5.01 52.051 < 0.001 S6日AMH值 3.23 1.72 5.15 trigger日AMH值 1.63 0.83 2.70 经进一步两两比较（调整检验水准
$ {\alpha ^{'}} = \alpha /3 = $ $ 0.017 $ ），血清BL值大于trigger日AMH值，S6日AMH值大于trigger日AMH值，血清BL值与S6日AMH值无显著性差异（P > 0.05），见表2。表 2 不同时段AMH值两两比较Table 2. Comparison of AMH value between each two groups at different time point比较组 Z P 血清BL值与S6日AMH值 0.159 0.874 S6日AMH值与trigger日AMH值 7.557 < 0.001 血清BL值与trigger日AMH值 7.817 < 0.001 2.2 血清与卵泡液中AMH值与年龄的关系
用线性相关（Pearson’ s）分别将血清AMH值及大、中卵泡卵泡液中AMH 与女方年龄作相关性分析，结果显示：BL、S6、trigger、大卵泡及中卵泡液中AMH水平与女方年龄均为负相关性。随着年龄的增加，无论是血清里还是卵泡液中AMH值均呈下降趋势见表3。
表 3 AMH（ng/mL）值与女方年龄作相关性分析Table 3. Correlation between AMH （ng/ml） value and age of women项目 BL S6 trigger 大卵泡液 中卵泡液 女方年龄 r −0.308 −0.268 −0.267 −0.217 −0.150 P 0.006* 0.017* 0.018* 0.055 0.188 *P < 0.05。 比较不同年龄组中血清中3个不同时段AMH值、卵泡液中AMH值的差异，进一步将年龄以35岁为界，分为高龄组与适龄组，比较2组在不同时段血清和卵泡中AMH的差异，结果显示适龄组血清BL、S6、trigger日均值均高于高龄组，且差异具有显著性P < 0.05；大卵泡液及中卵泡液AMH在不同年龄组中亦有显著性差异，P < 0.05，见表4。
表 4 不同年龄AMH检测结果的比较[（$\bar x \pm s $ ），ng/mL]Table 4. Comparison of the results of AMH in different age groups [（$\bar x \pm s $ ），ng/mL]女方年龄 n BL S6 trigger 大卵泡液 中卵泡液 ≤35岁 153 4.29 ± 3.14 4.08 ± 2.83 2.14 ± 1.68 3.99 ± 4.16 3.07 ± 2.69 > 35岁 24 2.11 ± 1.14 2.46 ± 1.59 1.16 ± 0.89 1.93 ± 1.38 1.84 ± 2.51 比较（t、P） t 11.283 7.422 7.687 5.809 4.425 P 0.001* 0.007* 0.006* 0.017* 0.037* *P < 0.05。 2.3 大、中卵泡液中AMH值的比较
大、中卵泡液中的AMH值呈左偏态分布，大卵泡液中AMH水平高于中卵泡液AMH水平，差异具有显著性（P = 0.009），见表5。
表 5 大、中卵泡液AMH值比较（ng/mL）Table 5. Comparison of AMH levels between large and medium follicles （ng/mL）分组 中位数 百分位数（P） Z P 25 75 大卵泡 2.52 1.33 4.51 2.651 0.009 中卵泡 2.21 1.2 3.98 经配对秩和检验，同一患者中，大、中卵泡液AMH值存在显著性差异（P = 0.009），大卵泡AMH值比中卵泡AMH值高。 2.4 血清及卵泡液AMH水平与获卵数的关系
用线性相关（Pearson’ s）分别将获卵数与血清BL、S6、Trigger以及大、中卵泡液中AMH水平做相关性分析后发现，在COH治疗患者中无论是血清AMH还是大卵泡液中AMH均与获卵数呈正相关性，P < 0.01。但中卵泡液AMH水平与获卵数无明显相关性。P > 0.05，见表6。
表 6 血清及卵泡液AMH水平与获卵数的相关性Table 6. Correlation of AMH levels in serum and follicular fluid with the number of retrieved oocytesBL S6 trigger 大卵泡液 中卵泡液 获卵数 r 0.392 0.419 0.315 0.171 0.117 P < 0.001* < 0.001* < 0.001* 0.026* 0.123 *P < 0.05。 将获卵数分为4组，< 5枚（一组），6～10枚（二组），11～15枚（三组）， > 15枚（四组），用秩和检验进行分析，发现血清BL、S6及trigger日、大卵泡液AMH、中卵泡液AMH水平在不同的获卵数组间有显著性差异（P < 0.05），见表7。
表 7 AMH值与获卵数的比较[ M（P25，P75）]Table 7. Comparison between AMH value and the number of retrieved oocytes [ M（P25，P75）]获卵数 基础AMH S6AMH trigger日AMH 大卵泡液AMH 中卵泡液AMH < 5 1.19（0.79，2.47） 1.11（0.87，1.98） 0.71（0.48，1.11） 1.61（0.49，2.11） 1.55（0.61，2.60） 6～10 2.24（1.63，3.62） 2.11（1.48，4.07） 1.12（0.69，2.18） 2.59（1.15，4.55） 1.76（0.81，4.43） 11～15 3.89（2.26，5.52） 3.30（2.24，5.60） 1.82（1.15，2.67） 2.57（1.42，4.37） 213（1.38，3.70） > 15 4.37（2.82，6.51） 4.96（3.44，6.57） 2.44（1.41，3.47） 2.82（1.75，5.07） 2.55（1.48，4.30） χ2 40.263 39.425 23.596 7.877 7.846 P < 0.001 < 0.001 < 0.001 0.049 0.049 经两两比较（调整检验水准
$ {\alpha ^{'}} = \alpha /6 = 0.008 $ ），除一组与二组和三组与四组外，一组与三组、四组及二组与三组、四组之间的基础AMH值存在显著性差异（P < 0.008）；各组之间的 S6AMH值均存在显著性差异（P < 0.008）；一组与三组、四组及二组与四组间的Trigger日AMH存在显著性差异（P < 0.008）；仅一组与四组的大卵泡液AMH值存在显著性差异（P < 0.008）；各组之间的中卵泡液AMH值无显著性差异（P > 0.008），见表8。表 8 4组获卵数 AMH值两两比较Table 8. Comparison of that numb of oocytes retrieve from the four groups and AMH value between the two groups比较组 基础AMH S6AMH trigger日AMH 大卵泡液AMH 中卵泡液AMH Z P Z P Z P Z P Z P 一组与二组 2.453 0.014 3.207 0.001* 2.362 0.018 1.826 0.068 1.187 0.235 一组与三组 4.341 < 0.001* 4.616 < 0.001* 3.690 < 0.001* 2.427 0.015 2.149 0.032 一组与四组 5.057 < 0.001* 5.465 < 0.001* 4.522 < 0.001* 2.696 0.007* 2.526 0.012 二组与三组 3.154 0.002* 2.859 0.004* 2.196 0.028 0.509 0.611 1.235 0.217 二组与四组 4.541 < 0.001* 4.535 < 0.001* 3.588 < 0.001* 1.069 0.285 1.607 0.108 三组与四组 1.411 0.158 2.173 0.030* 1.882 0.060 0.670 0.503 0.733 0.464 *P < 0.001。 2.4.1 分析COH过程中，血清AMH的动态变化特点
通过比较不同获卵数组在S6和trigger两个时段血清AMH与基线AMH水平的差值比，分析不同获卵数在S6及trigger两个检测点AMH较基础AMH的变化特点。
将BL的AMH水平设定为T0，S6设定为T1，trigger设定为T2， 差值比 = T1 （T2）-T0 /T0计算，并将所得结果绘制成图1。从图1中可以观察到4个不同获卵数组AMH值从BL到S6呈缓慢上升，获卵数越多上升越明显；从S6到trigger日AMH值快速下降，获卵越多下降越明显，见图1。
图 1 COH过程中不同获卵组血清AMH的动态变化趋势Figure 1. Dynamic changes of serum AMH in different oocyte retrieval groups during COH3. 讨论
抗苗勒管激素（anti-mullerian hormone，AMH）是由窦前及小窦卵泡的颗粒细胞所分泌，女性血清AMH水平在青春期后开始升高，很快达到峰值并在整个女性生育周期中持续存在，其作用为调控始基卵泡的募集，保持卵泡有序发育，促进卵泡优势选择，维持每月卵泡的成熟[7, 8]。随着卵泡的成熟其表达水平也显著下降[5]。所以可以通过测定AMH水平可以间接的了解小腔卵泡的数量[9]。而且AMH 的水平不随女性激素的周期性变化而变化，它可以相对客观的预测卵巢反应[10]。本研究结果也得出血清及卵泡液中AMH水平与年龄呈负相关性的结果。卵泡液 AMH 水平可能影响卵母细胞的质量[5] 。在本研究结果显示控制性超排卵周期中，随着Gn使用天数的增加，血清里AMH值也会随着下降，但S6与BL日AMH值差异无显著性，而在trrigger日AMH就明显低于BL和S6，且差异具有显著性。血清AMH在COH过程这一变化显示了Gn刺激下了小腔卵泡逐渐减少并形成成熟卵泡的过程[11]，再次说明AMH 主要表达于小腔卵泡。提示血清AMH动态变化能较好地预测卵泡对COH的反应。所以，国内有研究发现血清AMH水平与可获得卵母细胞数的相关性最高[12]，本研究发现COH治疗患者治疗无论是血清三个研究时段还是大中卵泡液中AMH值均与获卵数呈正相关性，与国内相关研究结果一致。本研究在对血清及卵泡液AMH与女性年龄（小于35岁及大于35岁两组）的关系进行分析后发现，年龄与血清及卵泡液中AMH的变化均呈负相关，且年龄与血清AMH水平相关性极强。该结果与国内相关研究结果相同[13]。本研究通过差值比进一步观察血清AMH的动态变化，得出不同获卵数组AMH水平从BL到S6均呈现缓慢上升趋势，但高获卵数组较低获卵数组上升明显。从S6到trigger，AMH水平均呈现快速下降特点，下降幅度以大卵泡组最为明显。该结果再次验证了AMH的产生与卵泡的发育的相关性。
卵泡液的微环境影响着卵母细胞的生长与发育，在卵泡液中存在有一定量的AMH，从小窦卵泡阶段到排卵前大卵泡均有表达。卵泡液中AMH可促进卵子发育，从而提高受精卵发育潜能[14, 15]。国内有关卵泡液中AMH水平的报道显示，至排卵前，卵泡液中AMH 水平约为血清中的1/8[16]，本研究并未得出相同结果。关于卵泡液AMH水平与获卵数的研究，有报道显示，卵泡液AMH水平与获卵数和卵子成熟度无关[17]。本研究经过对不同获卵数分组比较后也发现卵泡液AMH的水平在不同获卵数组无显著性差异。在AMH与获卵数相关性研究中，有文献报道[11]排卵日血清及卵泡液的 AMH 水平与获卵数呈正相关性。本研究也得出相同的结论，本研究同时发现血清中AMH的动态变化与获卵数的相关性极强。
综上所述，在COH治疗过程中，不同时段血清AMH值呈波动状态，动态监测COH治疗中患者血清中AMH值的变化对获卵数具有一定的预测价值，大卵泡液中AMH水平与获卵数呈正相关性。因此，在COH治疗过程中通过动态观察血清AMH的变化对于评估卵泡的发育及获卵数存在一定价值，对于临床用药具有潜在的指导意义。
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图 1 COH过程中不同获卵组血清AMH的动态变化趋势
Figure 1. Dynamic changes of serum AMH in different oocyte retrieval groups during COH
表 1 不同时段AMH值比较（ng/mL）
Table 1. Comparison of serum AMH level at different time points （ng/mL）
分组 中位数 百分位数（P） χ2 P 25 75 血清BL值 3.32 1.85 5.01 52.051 < 0.001 S6日AMH值 3.23 1.72 5.15 trigger日AMH值 1.63 0.83 2.70 
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表 2 不同时段AMH值两两比较
Table 2. Comparison of AMH value between each two groups at different time point
比较组 Z P 血清BL值与S6日AMH值 0.159 0.874 S6日AMH值与trigger日AMH值 7.557 < 0.001 血清BL值与trigger日AMH值 7.817 < 0.001
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表 3 AMH（ng/mL）值与女方年龄作相关性分析
Table 3. Correlation between AMH （ng/ml） value and age of women
项目 BL S6 trigger 大卵泡液 中卵泡液 女方年龄 r −0.308 −0.268 −0.267 −0.217 −0.150 P 0.006* 0.017* 0.018* 0.055 0.188 *P < 0.05。
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表 4 不同年龄AMH检测结果的比较[（
$\bar x \pm s $ ），ng/mL]Table 4. Comparison of the results of AMH in different age groups [（
$\bar x \pm s $ ），ng/mL]女方年龄 n BL S6 trigger 大卵泡液 中卵泡液 ≤35岁 153 4.29 ± 3.14 4.08 ± 2.83 2.14 ± 1.68 3.99 ± 4.16 3.07 ± 2.69 > 35岁 24 2.11 ± 1.14 2.46 ± 1.59 1.16 ± 0.89 1.93 ± 1.38 1.84 ± 2.51 比较（t、P） t 11.283 7.422 7.687 5.809 4.425 P 0.001* 0.007* 0.006* 0.017* 0.037* *P < 0.05。
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表 5 大、中卵泡液AMH值比较（ng/mL）
Table 5. Comparison of AMH levels between large and medium follicles （ng/mL）
分组 中位数 百分位数（P） Z P 25 75 大卵泡 2.52 1.33 4.51 2.651 0.009 中卵泡 2.21 1.2 3.98 经配对秩和检验，同一患者中，大、中卵泡液AMH值存在显著性差异（P = 0.009），大卵泡AMH值比中卵泡AMH值高。
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表 6 血清及卵泡液AMH水平与获卵数的相关性
Table 6. Correlation of AMH levels in serum and follicular fluid with the number of retrieved oocytes
BL S6 trigger 大卵泡液 中卵泡液 获卵数 r 0.392 0.419 0.315 0.171 0.117 P < 0.001* < 0.001* < 0.001* 0.026* 0.123 *P < 0.05。
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表 7 AMH值与获卵数的比较[ M（P25，P75）]
Table 7. Comparison between AMH value and the number of retrieved oocytes [ M（P25，P75）]
获卵数 基础AMH S6AMH trigger日AMH 大卵泡液AMH 中卵泡液AMH < 5 1.19（0.79，2.47） 1.11（0.87，1.98） 0.71（0.48，1.11） 1.61（0.49，2.11） 1.55（0.61，2.60） 6～10 2.24（1.63，3.62） 2.11（1.48，4.07） 1.12（0.69，2.18） 2.59（1.15，4.55） 1.76（0.81，4.43） 11～15 3.89（2.26，5.52） 3.30（2.24，5.60） 1.82（1.15，2.67） 2.57（1.42，4.37） 213（1.38，3.70） > 15 4.37（2.82，6.51） 4.96（3.44，6.57） 2.44（1.41，3.47） 2.82（1.75，5.07） 2.55（1.48，4.30） χ2 40.263 39.425 23.596 7.877 7.846 P < 0.001 < 0.001 < 0.001 0.049 0.049
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表 8 4组获卵数 AMH值两两比较
Table 8. Comparison of that numb of oocytes retrieve from the four groups and AMH value between the two groups
比较组 基础AMH S6AMH trigger日AMH 大卵泡液AMH 中卵泡液AMH Z P Z P Z P Z P Z P 一组与二组 2.453 0.014 3.207 0.001* 2.362 0.018 1.826 0.068 1.187 0.235 一组与三组 4.341 < 0.001* 4.616 < 0.001* 3.690 < 0.001* 2.427 0.015 2.149 0.032 一组与四组 5.057 < 0.001* 5.465 < 0.001* 4.522 < 0.001* 2.696 0.007* 2.526 0.012 二组与三组 3.154 0.002* 2.859 0.004* 2.196 0.028 0.509 0.611 1.235 0.217 二组与四组 4.541 < 0.001* 4.535 < 0.001* 3.588 < 0.001* 1.069 0.285 1.607 0.108 三组与四组 1.411 0.158 2.173 0.030* 1.882 0.060 0.670 0.503 0.733 0.464 *P < 0.001。
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1. 李婉玉，郑喜. 血清及卵泡液AMH水平检测在辅助生殖领域中的应用研究进展. 延边大学医学学报. 2023(04): 347-350 . 
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