Orthogonal Experiment for Optimization of Ultrasonic Extraction Process of Six Components from Geranium wilfordii Maxim
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摘要:
目的 采用L9（34）正交实验优化老鹳草中老鹳草素、没食子酸、柯里拉京、金丝桃苷、鞣花酸、原儿茶酸6种成分的超声提取方法。 方法 在单因素实验基础上，选取甲醇体积分数、超声提取时间、料液比3个主要因素进行L9（34）正交实验，研究各因素相互作用对老鹳草中6种成分提取率的影响。 结果 老鹳草中6种成分的超声法最佳提取工艺为：甲醇溶液体积分数：60%，料液比：1.0 g/10 mL，超声波提取时间：40 min。 结论 此方法操作简便，重复性高，准确度好，可用于老鹳草中老鹳草素、没食子酸、柯里拉京、金丝桃苷、鞣花酸、原儿茶酸6种成分的同时提取。 Abstract:Objective T o optimize the ultrasonic extraction method for Geraniin, Gallic acid, Corilagin, Hyperoside, Ellagic acid, Protocatechuic acid from Geranium wilfordii Maxim by L9（34） orthogonal experiment. Methods On the basis of single factor experiments, using L9（34） orthogonal experiment, three main factors, methanol volume fraction, extraction time, solid-liquid ratio are chosen for three main component to study the effect of the interaction of various factors on the extraction rate of six components fromGeranium wilfordiiMaxim. Results The results show that the optimum extraction process are as follow: the methanol volume fraction was 60%, the solid-liquid ratio was 1∶10（g∶ml）, the extraction time was 40 min. Conclusion This method is simple, repeatability and accuracy. It can be to extract Geraniin, Gallic acid, Corilagin, Hyperoside, Ellagic acid, Protocatechuic acidfrom Geranium wilfordii Maxim. -
Key words:
- Geranium wilfordii Maxim /
- Ultrasonic Extraction /
- Orthogonal Experiment /
- HPLC
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近年来，人口老龄化，再加之广谱抗生素、糖皮质激素、免疫抑制剂以及细胞毒药物的广泛应用，患者免疫功能受损，免疫力严重低下，使得侵袭性肺真菌感染（invasive pulmonary fungal infection，IPFI）的发病率及死亡率在全球范围内呈逐年升高趋势[1]。我国存在宿主因素的患者发病率为4.1%～41.2%，病死率为9.8%～60%[2]。国外研究证明慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）患者也是侵袭性真菌感染的易患宿主[3]。且有资料显示22.2%的COPD患者存在不同程度的肺部真菌感染[4]。COPD作为一种严重威胁人类健康的疾病，存在病情反复，急性加重的特点，极易出现二重感染，其中以IPFI多见，而IPFI症状及影像学表现无特异性，进展快，病死率高，因此对COPD并发IPFI早期诊断及治疗具有十分重要的意义[5]。近年来，具有无创、敏感、特异优点的血清1，3-β-D葡聚糖检测（G试验）和半乳甘露聚糖检测（GM试验）已被逐渐开始广泛应用，成为真菌感染的诊断标准之一[6-7]。本研究对2018年10月至2019年10月昆明医科大学第二附属医院急诊重症医学科收治的AECOPD存在肺真菌感染的26例患者的临床资料进行了统计分析，探讨肺泡灌洗液（BALF）G试验、GM试验对AECOPD患者并发IPFI的诊断价值。
1. 资料与方法
1.1 一般资料
随机选取2018年10月至2019年10月昆明医科大学第二附属医院急诊重症医学科收治的AECOPD合并肺真菌感染的患者26例，其中男性患者19例，女性患者7例，年龄56～82岁，平均（72.5±8.3）岁，将这些患者作为观察组。另选取同一时期昆明医科大学第二附属医院急诊重症医学科收治的AECOPD仅存在细菌感染的患者26例，作为对照组。其中男性患者21例，女性患者5例，年龄61～82岁，平均（71.4±8.5）岁。两组患者的一般资料比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。本试验所选病例均有行纤维支气管镜检查的适应症且无禁忌症，由家属或本人签署知情同意书，并经过伦理委员会批准。
1.2 诊断标准
参照中华医学会2007年制定的《慢性阻塞性肺疾病诊治指南》[8]和中华医学会呼吸病学分会感染学组中华结核、呼吸杂志编辑委员会制定的“肺真菌病诊断和治疗专家共识”[9]。
1.3 排除标准
（1）家属或患者本人不同意行纤维支气管镜检查；（2）患者病情危重，不能耐受纤维支气管镜检查或存在纤维支气管镜的禁忌症；（3）行G、GM试验前已经验性使用抗真菌治疗；（4）在行G、GM试验前近期有应用可能干扰该试验结果的治疗（如使用可能导致假阳性的抗生素、白蛋白、免疫球蛋白及使用纤维素膜透析等）。
1.4 样本采集与处理
所有研究对象均在规范操作的纤维支气管镜下采集BALF，同时抽血采集血清标本，同时送检进行G和GM试验检测。
1.4.1 血清G/GM试验
血清标本均送昆明医科大学第二附属医院实验室检查，由实验人员统一规范操作，具体操作步骤严格按照试剂和仪器说明书进行。
1.4.2 BALF G/GM试验
BALF采集方法如下：纳入病例的患者在行纤维支气管镜检查前均行肺部CT检查，根据检查结果判定纤维支气管镜检查的目标段或亚段支气管。然后进行规范支气管镜操作，规范地采集标本，灌洗液回收量不少于5 mL。BALF经低温、离心处理后，采集上清液进行G/GM试验，原理和操作步骤同血清G/GM试验。
1.5 结果判定
G试验阳性的标准为测定值 > 100 pg/mL，GM试验阳性的标准为测定值 > 0.65 μg/mL。
1.6 观察指标
对比血清与BALF测定G/GM试验的水平，并统计G/GM试验的敏感度、特异性、阴性预测值、阳性预测值、假阳性率和假阴性率。
1.7 统计学处理
数据统计分析采用SPSS 20.0软件，以均数±标准差（
$\bar x $ ±s）表示计量资料，组间比较采用t检验；用n（%）表示计数资料，组间比较采用χ2检验；P < 0.05为差异有统计学意义。2. 结果
2.1 两组患者不同标本（BLAF和血清）G、GM试验结果
观察组中，BALF G试验阳性结果22例，GM试验阳性结果18例，血清G试验阳性结果20例，GM试验阳性结果16例，BALF GM联合G试验阳性23例；血清GM联合G试验阳性22例。无论是BLAF还是血清，观察组的G和GM试验阳性结果例数均明显高于对照组，且观察组中BALF测定G/GM试验的水平均高于血清测定值，差异有统计学意义（P < 0.05），见 表1、表2。
2.2 不同标本（BLAF和血清）G、GM试验诊断价值比较
BALF G试验联合GM试验检测特异性、灵敏度、阳性预测值、阴性预测值、假阳性率和假阴性率分别为92.3%、88.5%、93.5%、93.2%、7.7%和11.5%。BALFG试验联合GM试验检测诊断AECOPD并发侵袭性肺真菌感染的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、假阳性率和假阴性率均优于其他各项，见表3。
表 1 不同标本G、GM试验检测阳性率比较 [n （%）]Table 1. Comparison of G and GM test positive rate between different specimens[n （%）]组别 G试验 GM试验 BALF Blood BALF Blood 观察组（n = 26） 22（84.623） 20（76.871） 18（69.213） 16（61.521） 对照组（n = 26） 6（23.132） 7（26.872） 3（11.532） 4（15.412） χ2 21.672 15.061 19.742 13.587 P < 0.001 < 0.001 < 0.001 < 0.001 表 2 不同标本G、GM试验检测值比较（$\bar x \pm s $ ）Table 2. Comparison of G and GM test result between different specimens（$\bar x \pm s $ ）组别 G试验 GM试验 BALF Blood BALF Blood 观察组（n = 26） 37.512 ± 18.362 26.213 ± 12.579 1.862 ± 1.692 0.852 ± 0.687 对照组（n = 26） 14.803 ± 13.213 12.873 ± 7.731 0.221 ± 0.232 0.372 ± 0.253 t 4.253 5.423 4.314 4.262 P < 0.001 < 0.001 < 0.001 < 0.001 表 3 不同标本G、GM试验单项及联合检测结果（%）Table 3. G test，GM test or G combined with GM test result between different specimens（%）检测项目 G试验 GM试验 G+GM试验 BALF Blood BALF Blood BALF Blood 特异度 76.9 73.1 88.5 84.6 92.3 88.5 灵敏度 84.6 77.9 69.2 61.5 88.5 84.6 阳性预测值 74.8 74.1 84.2 79.1 93.5 89.6 阴性预测值 82.3 75.6 74.5 69.2 93.2 87.3 假阳性率 23.1 26.9 11.5 15.4 7.7 11.5 假阴性率 15.4 23.1 30.8 38.5 11.5 15.4 3. 讨论
慢性阻塞性肺疾病（COPD）是一种严重威胁人类健康的呼吸系统慢性疾病，具有病程长、病情反复、迁延难愈、进行性加重的特点，多数患者为老年人，病情加重时，甚至需要使用呼吸机治疗，且在治疗过程中需长期应用抗菌药物和糖皮质激素来治疗及控制病情，对免疫系统产生了抑制作用，故而发生侵袭性肺真菌感染的风险较高。有报道表示，慢性阻塞性肺疾病急性加重期（AECOPD）并发真菌感染占因AECOPD住院总人数的4.91%[10]，真菌感染中又多以侵袭性肺部真菌感染（IPFI）为常见[11-12]。AECOPD患者并发IPFI的症状、体征，甚至影像学常常缺乏特异性，往往容易忽略或漏诊，从而导致严重后果。
近年来，血清1，3-β-D葡聚糖检测（G试验）和半乳甘露聚糖检测（GM试验），具有无创、敏感、迅速等特点，被广大临床医师所接受和认可，但仍然存在一定的误差。G试验检测的是1，3-β-D葡聚糖，该物质广泛存在于真菌细胞壁内且为真菌所特有。当真菌侵入机体后，机体的吞噬细胞吞噬真菌，持续释放1，3-β-D葡聚糖，使血液及体液中1，3-β-D葡聚糖含量增高[13]。但是在IPFI早期，真菌尚未进入血液中，因此早期血清G试验阳性率并不高[14]。且血清G试验常因病人输注白蛋白、球蛋白、抗肿瘤药物、磺胺类药物、哌拉西林/他唑巴坦等半合成青霉素等情况时呈现假阳性。GM试验检测的是半乳甘露聚糖，而曲霉菌细胞壁含有该成分，当曲霉菌侵入机体后，半乳甘露聚糖即被释放出来，从而被检测到，且该物质是最早释放的抗原，在临床或放射学征象出现之前就能被检测到[15]。但也有研究证实，其与其他真菌（双歧杆菌、新型隐球菌、镰刀菌、青霉菌）及内酰胺类抗生素有交叉反应[16]。另外，非粒缺曲霉菌患者，白细胞会吞噬GM抗原，亦可造成GM试验假阴性。因此，无论是血清G试验还是GM试验均存在一定的假阳性率和假阴性率[17-18]，为临床判断带来一定的难度。
本研究结果提示无论是BLAF还是血清，观察组的G/GM试验阳性结果例数均高于对照组；观察组中BALF测定G/GM试验的水平均高于血清测定，差异有统计学意义（P < 0.05）；BALF G试验联合GM试验检测诊断AECOPD并发IPFI的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值均高于其他各项，假阳性率和假阴性率低于其他各项，提示BALF G/GM试验对AECOPD患者并发IPFI有较高的灵敏性及特异性，具有更高的临床诊断价值，且BALF G试验联合GM试验检测能有效提高诊断AECOPD并发IPFI的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值，降低假阳性率和假阴性率，减少了误诊、漏诊情况的发生，优于单项G试验或GM试验检测及血清G试验联合GM试验检测。
综上所述，无论是血清还是肺泡灌洗液G和GM试验对早期诊断AECOPD患者并发侵袭性肺真菌感染的诊断均具有一定的临床价值，但是肺泡灌洗液G和GM试验优于血清G和GM试验，且肺泡灌洗液G和GM试验联合检测可以提高试验结果的灵敏性和特异性，降低假阳性和假阴性的发生率，对于早期诊断AECOPD患者并发IPFI提供有效的实验室数据，有临床价值。但肺泡灌洗液G和GM试验需要患者行支气管镜检查，操作有一定侵入性，若能取得患者或家属的同意，在临床诊断上更有价值，值得推广。
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图 1 供试品溶液色谱图
色谱条件：流速：1.0 mL/min；柱温：25 ℃；检测波长：280 nm；梯度洗脱程序见表1。
Figure 1. The chromatogram of Geranium wilfordii Maxim
图 2 鞣花酸对照品溶液色谱图
色谱条件：流速：1.0 mL/min；柱温：25 ℃；检测波长：280 nm；梯度洗脱程序见表1。
Figure 2. The chromatogram of Ellagic acid
图 3 原儿茶酸对照品溶液色谱图
色谱条件：流速：1.0 mL/min；柱温：25 ℃；检测波长：280 nm；梯度洗脱程序见表1。
Figure 3. The chromatogram of Protocatechuic acid
图 4 柯里拉京对照品溶液色谱图
色谱条件：流速：1.0 mL/min；柱温：25 ℃；检测波长：280 nm；梯度洗脱程序见表1。
Figure 4. The chromatogram of Corilagin
图 5 老鹳草素对照品溶液色谱图
色谱条件：流速：1.0 mL/min；柱温：25 ℃；检测波长：280 nm；梯度洗脱程序见表1。
Figure 5. The chromatogram of Geraniin
图 6 没食子酸对照品溶液色谱图
色谱条件：流速：1.0 mL/min；柱温：25 ℃；检测波长：280 nm；梯度洗脱程序见表1。
Figure 6. The chromatogram of Gallic acid
图 7 金丝桃苷对照品溶液色谱图
色谱条件：流速：1.0 mL/min；柱温：25 ℃；检测波长：280 nm；梯度洗脱程序见表1。
Figure 7. The chromatogram of Hyperoside
图 10 不同甲醇体积分数对比图
Figure 10. The Comparison diagram of different methanol volume fraction
表 1 HPLC梯度洗脱程序表、
Table 1. The HPLC gradient elution procedures
时间（min） 0.1%磷酸（Phosphoric） 乙腈（Acetonitrile） 0 96 4 10 95 5 15 88 12 20 86 14 30 85 15 40 79 21 50 79 21 60 55 45 70 55 45 
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表 3 L9（34）正交试验表（老鹳草素）
Table 3. The results of orthogonal experiment （Geraniin）
试验 因素 老鹳草素
峰面积A B C 1 1 1 1 1103857 2 1 2 2 4837849 3 1 3 3 3661222 4 2 1 2 2185068 5 2 2 3 3675299 6 2 3 1 6156247 7 3 1 3 1361929 8 3 2 1 6736777 9 3 3 2 4823928 M1 9602928 4650854 13996881 T = 34542176 M2 12016614 15249925 11846845 y = 3838020 M3 12922634 14641397 8698450 m1 3200976 1550285 4665627 m2 4005538 5083308 3948948 m3 4307545 4880466 2899483 Rj R1 = 9346027 R2 = 3403080 R3 = 5942947 Sj S1 = 1963022889647 S2 = 23613509157143 S3 = 4734267721180 A：提取时间；B：料液比；C：溶剂体积分数； m1：实验因素一水平实验结果平均值；m2：实验因素二水平实验结果平均值；
m3：实验因素三水平实验结果平均值；Rj ：M 值极差；Sj ：反映了正交表上第 j 列所排因素的不同水平之间的差异程度，称 Sj 为第 j 列变差平方和；T：9 次实验结果之和；y：9 次实验结果平均值。在一定范围内，R值极差的大小与提取量的影响大小正比，m值大小与最佳提取条件因素成正比。
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表 4 L9（34）正交试验表（没食子酸）
Table 4. The results of orthogonal experiment （Gallic acid）
试验 因素 没食子酸
峰面积A B C 1 1 1 1 7314190 2 1 2 2 16280524 3 1 3 3 12562631 4 2 1 2 13938578 5 2 2 3 13910940 6 2 3 1 19201446 7 3 1 3 7694251 8 3 2 1 24710211 9 3 3 2 18204393 M1 36157345 28947018 51225846 T = 133817162 M2 47050964 54901675 48423495 y = 14868574 M3 50608854 49968469 34167822 m1 12052448 9649006 17075282 m2 15683655 18300558 16141165 m3 16869618 16656156 11389274 Rj R1 = 22278828 R2 = 7850711 R3 = 5480344 Sj S1 = 37797292060705 S2 = 126653568075958 S3 = 55783729621634
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表 5 L9（34）正交试验表（柯里拉京）
Table 5. The results of orthogonal experiment （Corilagin）
试验 因素 柯里拉京
峰面积A B C 1 1 1 1 1904530 2 1 2 2 3202766 3 1 3 3 1869245 4 2 1 2 3343529 5 2 2 3 2315514 6 2 3 1 3106967 7 3 1 3 2468583 8 3 2 1 4962727 9 3 3 2 2490196 M1 6976540 7716642 9974224 T = 25664055 M2 8766010 10481006 9036490 y = 2851562 M3 9921506 7466408 6653342 m1 2325513 2572214 3324741 m2 2922003 3493669 3012163 m3 3307169 2488803 2217781 Rj R1 = 2997684 R2 = 1714997 R3 = 3268164 Sj S1 = 14677993215 S2 = 18657924733 S3 = 1954110905333
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表 6 L9（34）正交试验表（金丝桃苷）
Table 6. The results of orthogonal experiment （Hyperoside）
试验 因素 金丝桃苷
峰面积A B C 1 1 1 1 477208 2 1 2 2 482219 3 1 3 3 332298 4 2 1 2 553354 5 2 2 3 325225 6 2 3 1 640846 7 3 1 3 402090 8 3 2 1 716723 9 3 3 2 450258 M1 901338 364870 1480455 T = 3378937 M2 1107751 1535964 1187781 y = 375437 M3 1369849 1478104 710701 m1 300446 121623 493485 m2 369250 511988 395927 m3 456616 492701 236900 Rj R1 = 1115586 R2 = 428214 R3 = 767403 Sj S1 = 36756108434 S2 = 290455567127 S3 = 100642735244
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表 7 L9（34）正交试验表（鞣花酸）
Table 7. The results of orthogonal experiment （Ellagic acid）
试验 因素 鞣花酸
峰面积A B C 1 1 1 1 2275146 2 1 2 2 1022426 3 1 3 3 716270 4 2 1 2 1485928 5 2 2 3 704427 6 2 3 1 1477116 7 3 1 3 868155 8 3 2 1 1545919 9 3 3 2 1044160 M1 4013842 4629228 5298180 T = 11139544 M2 3667471 3272771 3552514 y = 1237727.1 M3 3458233 3237545 2288851 m1 1337947 1543076 1766060 m2 1222490 1090924 1184171 m3 1152744 1079182 762950 Rj R1 = 428113 R2 = 131567 R3 = 389794 Sj S1 = 52494689151 S2 = 419777559602 S3 = 1522250079819
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表 8 L9（34）正交试验表（原儿茶酸）
Table 8. The results of orthogonal experiment （Protocatechuic acid）
试验 因素 原儿茶酸
峰面积A B C 1 1 1 1 477208 2 1 2 2 482219 3 1 3 3 332298 4 2 1 2 553354 5 2 2 3 325225 6 2 3 1 640846 7 3 1 3 402090 8 3 2 1 716723 9 3 3 2 450258 M1 1291724 1432652 1834777 T = 4380219 M2 1519425 1524167 1485830 y = 486691 M3 1569071 1423401 1059613 m1 430575 477551 611592 m2 506475 508056 495277 m3 523024 474467 353204 Rj R1 = 543053 R2 = 38337 R3 = 509458 Sj S1 = 14581556354 S2 = 2068250330 S3 = 100478249341
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