噬菌体是一类可以感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒总称，它自发现以来有100多年的历史，随着抗生素的应用，噬菌体疗法一直没有得到重视及广泛应用，只有东欧个别国家坚持临床应用至今。近年来，全球细菌耐药性问题的日益严重，高水平耐药的“超级细菌”频繁出现，新型抗生素的研发速度赶不上耐药菌的产生速度^{[1, 2]}。噬菌体治疗重新引起了科学家们的重视，成为新近研究的热点 ^{[3, 4]}。 与抗生素相比，噬菌体能有效地破坏生物膜，不仅可以感染裂解生物膜外层的细菌，还可以通过复制形成新的噬菌体，进一步穿透生物膜内层并感染剩余的细菌直至完全清除细菌^[5]，大量研究还表明，噬菌体疗法在人体中的应用是安全有效的^[6-9]。

本文作者向盈盈^[10]在前期实验中分离到E. faecalis YN771的噬菌体PEf771，并进行其生物学特性及全基因组分析，这是国内发现的首株粪肠球菌肌尾科噬菌体。后期研究需要高滴度的噬菌体，为此，笔者进行了噬菌体PEF771的3种不同富集培养方法的滴度比较，为研究噬菌体PEf771治疗E. faecalis YN771引起的感染提供了实验材料和依据。

1.   材料与方法

1.1   实验试剂

心脑培养基

（Brain Heart Infusion）：简称 BHI 培养基，OXOID，英国贝星斯托克。

1.2   实验方法

1.2.1   不同比例法和挖斑法

采用不同比例（噬菌体∶菌 = 4∶5；1∶2.5；8∶5；1∶3）的富集方法和挖斑法先确定在小体积内不同时间段（24 h，48 h，72 h）的滴度，然后挑选出噬菌体滴度高的方法，扩大体积富集，计算各时间段的滴度。

1.2.2   丝裂霉素C诱导培养法：

（1） 取保存在4 ℃的E. faecalis YN771菌悬液作为菌种，接种于5 mL BHI液体培养基中，37 ℃，150 r/min过夜培养，次日按1%接菌量接种于100 mL新鲜BHI液体培养基内，约3 h至对数期（OD₆₀₀ = 1）。（2） 加入丝裂霉素C，终浓度为1 μg/mL，37 ℃，100 r/min，诱导培养2 h，取出备用。（3） 在超净工作台中取出E. faecalis YN771的噬菌体原液，梯度稀释至10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6，10^-7备用。（4） 在超净工作台中取出4 mL高温灭菌后的EP管，加入各个稀释梯度的噬菌体100 μL，每管中分别加入300 μL的经过丝裂霉素C诱导后的细菌，做好编号标记，在37 ℃恒温箱中静止吸附10 min。（5） 向静置后的样品中加入冷却至40 ℃、琼脂浓度为0.75%的BHI半固体培养基5 mL，混匀后快速的倾倒于普通BHI固体培养基上，形成双层平板。于超净工作台下静置15 min左右，使其充分凝固，做好标记，倒置于37 ℃恒温箱静置培养过夜，24 h后观察双层平板中噬菌斑长出情况并计数。（6） 未经过丝裂霉素C处理过的菌液作为对照进行实验。稀释梯度同上，实验过程同上。（7） 以上实验均平行3次。

1.2.3   E.faecalis YN771对数早期（OD₆₀₀ = 0.3）加入噬菌体富集：

（1） 取保存在4 ℃E. faecalis YN771菌悬液作为菌种，接种于5 mL BHI液体培养基中，37 ℃，150 r/min过夜培养后按1%的接菌量接种于100 mL新鲜BHI液体培养基内，约2 h至对数生长早期（OD₆₀₀ = 0.3）。（2） 加入滴度为10⁸ pfu/mL的噬菌体原液15 mL，放置37 ℃恒温箱中静止吸附10 min，37 ℃，150 r/min，6 h后观察到混合液由浑浊变清亮，底部有细菌裂解絮状物。（3） 将混合液10 000 r/min离心10 min，收集上清液，先用0.45 μm微孔滤膜抽滤，再用0.22 μm无菌微孔滤膜过滤，除去混合液中的细菌。梯度稀释至10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6，10^-7备用。（4） 在超净工作台中取出4 mL高温灭菌后的EP管，加入各个稀释梯度的噬菌体100 μL，每管中分别加入300 μL的对数早期的E. faecalis YN771，做好编号标记，在37 ℃恒温箱中静止吸附10 min。（5） 向静置后的样品中加入冷却至40 ℃、琼脂浓度为0.75%的BHI半固体培养基5 mL，混匀后快速的倾倒于普通BHI固体培养基上，形成双层平板。于超净工作台下静置15 min左右，使其充分凝固，做好标记，倒置于37 ℃恒温箱静置培养过夜，24 h后观察双层平板中噬菌斑长出情况并计数。（6） E. faecalis YN771对数生长期（OD₆₀₀ = 1）加入噬菌体富集菌液作为对照进行实验。稀释梯度同上，实验过程同上。（7） 以上实验均平行3次。

2.   结果

不同富集噬菌体的方法见表1，可以看出，24 h液体比例的各组滴度已达到10⁷ pfu/mL，挖斑法滴度达到了10⁸ pfu/mL。48 h液体比例的各组滴度有所不同，噬菌体∶菌 = 1∶2.5的滴度达到10⁸ pfu/mL，噬菌体∶菌 = 1∶3滴度达到10⁹ pfu/mL，挖斑法滴度达到了10⁹ pfu/mL。72 h噬菌体∶菌 = 1∶3和挖斑法的滴度仍然能达到10⁸ pfu/mL。表明噬菌体∶菌 = 1∶3和挖斑法得到的噬菌体滴度较其他组高。但本实验仅在小体积中进行，用这两个方法扩大体积富集培养，以得到高滴度，大体积的富集液。

表  1  不同方法富集噬菌体的滴度比较

Table  1.  Comparison of titer of phage enriched by different methods

实验分组	噬菌体	对数期粪肠球菌 （OD = 1）（μL）	新鲜BHI （mL）	噬菌体∶菌	24 h滴度 （pfu/mL）	48 h滴度 （pfu/mL）	72 h滴度 （pfu/mL）
一	200 μL	250	5	4∶5	0.9×107	3.6×107	1.5×106
二	200 μL	500	5	1∶2.5	3.0×107	4.1×108	2.1×107
三	400 μL	500	5	4∶5	1.3×107	8.0×107	7.4×106
四	400 μL	250	5	8∶5	1.9×107	5.3×107	6.8×106
五	100 μL	300	5	1∶3	4.6×107	1.2×109	6.1×108
六	挖斑（2块）	1000	100		2.2×108	1.8×109	7.4×108

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上述实验中噬菌体∶菌 = 1∶3和挖斑法滴度较其他方法高，笔者把这两种方法扩大体积培养，24 h各组的滴度都达到10⁸ pfu/mL，噬菌体∶菌 = 1∶3滴度达到10⁸ pfu/mL，48 h滴度都在10⁷ pfu/mL，72 h滴度都在10⁶ pfu/mL，这就提示两者在500 mL体积中富集效果无明显统计学差异（P > 0.05），且在24 h时滴度达到10⁸ pfu/mL，这时应停止培养，放置4 ℃冰箱保存，备用，以保持滴度，见表2。

表  2  两种方法富集培养的滴度比较

Table  2.  Comparison of enrichment culture by two methods

实验分组	噬菌体	对数期粪肠球菌 （OD = 1）（mL）	新鲜BHI （mL）	24 h滴度 （pfu/mL）	48 h滴度 （pfu/mL）	72 h滴度 （pfu/mL）
噬菌体：菌 = 1∶3 一组	10 mL	30	500	4.7×108	3.6×107	2.1×106
噬菌体：菌 = 1∶3 二组	10 mL	30	500	1.1×108	0.5×107	0.4×106
噬菌体：菌 = 1∶3 三组	10 mL	30	500	1.2×108	0.8×107	0.7×106
噬菌体：菌 = 1∶3 四组	10 mL	30	500	2.2×108	1.0×107	0.9×106
挖板法一组	挖斑（10块）		500	7.5×108	6.2×107	8.0×106
挖板法二组	挖斑（10块）		500	5.3×108	4.2×107	2.8×106
挖板法三组	挖斑（10块）		500	6.4×108	4.5×107	3.9×106
挖板法四组	挖斑（10块）		500	7.6×108	6.0×107	4.2×106

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上述实验结果显示，方法一（噬菌体∶菌 = 1∶3）和方法二（挖斑法）均可以得到滴度为10⁸ pfu/mL的噬菌体富集液，但仍然未得到理想滴度（10¹⁰ pfu/mL）的噬菌体富集液。利用丝裂霉素C诱导法验证能否提高滴度。

实验组（加丝裂霉素C组）和对照组（未加丝裂霉素C组）24 h滴度都在10⁸ pfu/mL，48 h滴度都在10⁷ pfu/mL，两者无明显统计学差异（P > 0.05），说明丝裂霉素C诱导法也未能有效提高富集液噬菌体的滴度，见表3。

表  3  丝裂霉素C诱导法对噬菌体滴度的影响

Table  3.  Effects of mitonmycin C induction on phage titer

实验分组	24 h滴度（pfu/mL）	48 h滴度（pfu/mL）
加丝裂霉素C组	3.2×108	4.5×107
对照组	5.3×108	2.9×107

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E. faecalis YN771不同生长时期加入噬菌体富集结果见表4，可以看出，E. faecalis YN771对数生长早期加入噬菌体进行富集培养，仅培养6 h其滴度就高达10¹⁰ pfu/mL，24 h滴度仍然可保持10¹⁰ pfu/mL，达到了理想的滴度，为之后的实验提供了高滴度的噬菌体富集液。因此后续实验都采用此法进行噬菌体的制备，实验样品也为高滴度的噬菌体纯培养液。

表  4  E. faecalis YN771对数早期加入噬菌体富集

Table  4.  Enrichment of PEf771 by E. faecalis YN771 at different culture phases

实验分组	6 h滴度（pfu/mL）	24 h滴度（pfu/mL）
对数生长早期组 （OD600 = 0.3）	1.6×1010	1.3×1010
对数生长期组 （OD600 = 1）	5.1×106	2.4×108

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3.   讨论

获取噬菌体富集液的方法主要有挖斑法、噬菌体/菌比例以及丝裂霉素C诱导法3种方法。在探索噬菌体/菌比例的时候，笔者发现噬菌体/细菌 = 1∶3比例富集方法优于其他比例。用挖斑法和按噬菌体∶菌 = 1∶3比例富集噬菌体均可以得到滴度在10⁸ pfu/ml的噬菌体富集液，而利用丝裂霉素C诱导法富集噬菌体在本实验中未能提高富集液噬菌体的滴度，但 Yoon等^[11]利用丝裂霉素C诱导法富集粪肠球菌KBL101噬菌体EFC-1可以提高滴度，可能与未达到最佳实验条件有关。文献报道FeCl₃沉淀法与PEG沉淀法均可以用于浓缩噬菌体颗粒。在本实验中，PEG沉淀法较FeCl₃沉淀法得到的PEf771基因组浓度高，纯度高，杂质少，而FeCl₃沉淀法得到的基因组有杂质。John^[12]和Hurwitz ^[13]认为FeCl₃沉淀法可以快速浓缩湖水中噬菌体颗粒，在本实验中，笔者用了文献中FeCl₃的10倍量处理样本，快速、便捷的得到了粪肠球菌噬菌体的浓缩液，两种沉淀法提取噬菌体基因组后比较，PEG沉淀法虽然实验冗长，但是得到的基因组浓度高，纯度高，杂质少。琼脂糖电泳图可以看出FeCl₃沉淀法得到的基因组在胶图上有拖尾现象，而且条带不清晰，说明噬菌体降解而且有杂质。分析原因可能是因为文献中的样本多为湖水，噬菌体浓度小，而且培养基为稀薄的LB培养基，所需FeCl₃量少，虽然在实验中已经加大FeCl₃用量，但由于BHI培养基粘稠而且样品浓度高，即使加大FeCl₃的用量仍然不能完全沉淀噬菌体颗粒，之后的实验还要探讨FeCl₃的用量。本实验证实在相同的噬菌体滴度下PEG沉淀法优于FeCl₃沉淀法，后续实验中浓缩噬菌体的方法均采用PEG沉淀法。

文献报道均采用细菌对数生长期来富集噬菌体，未指出对数生长期的具体阶段是否会影响噬菌体的富集^{[14, 15]}。本章实验发现E. faecalis YN771生长期的不同阶段会影响噬菌体PEf771的富集，在E. faecalis YN771对数生长期中期（OD₆₀₀ = 1）加入噬菌体PEf771富集，得到的噬菌体滴度一直在10⁷～10⁸，但是在E. faecalis YN771对数生长早期（OD₆₀₀ = 0.3）加入噬菌体富集，6 h后富集液清亮，有絮状悬浮物，细菌被很好的裂解，滴度高达10¹⁰ pfu/mL，继续培养24 h后滴度仍然可保持10¹⁰ pfu/mL。结果表明E. faecalis YN771对数生长早期与对数生长期加入噬菌体PEf771富集相比，对数生长早期得到的噬菌体滴度更高，实验结果可能与对数生长早期的细菌生长速度快，活力强，而噬菌体喜好感染生长活跃的宿主菌细菌有关。当OD₆₀₀ = 1时，可能一部分粪肠球菌已经不再处于活跃期，这就使得噬菌体能侵染的细菌减少，滴度不能达到最高。

综上所述，在E. faecalis YN771培养早期（OD600 = 0.3）加入PEf771以噬菌体/菌 = 1∶3的方法或挖斑法富集培养可有效提高PEf771的滴度，为研究粪肠球菌噬菌体PEf771治疗E. faecalis YN771引起的感染提供了实验材料和依据。