颈动脉粥样硬化性狭窄或闭塞约占了缺血性卒中病因的1/3^[1]。侧支循环目前是缺血性卒中的研究热点。颈动脉重度狭窄或闭塞后颅内侧支循环代偿状况与发生远期缺血事件的风险及预后具有相关性，也是选择治疗方式的重要依据。亚甲基四氢叶酸还原酶（5，10-methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR） 是同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）代谢途径的重要成分，目前有研究表明，高同型半胱氨酸血症是颈动脉粥样硬化的独立危险因素之一，MTHFR基因多态性可能通过增加血管内血栓形成的风险等成为颈动脉狭窄的独立危险因素^[2-3]，但其对颈动脉狭窄侧支循环的影响目前少有报道。研究MTHFR 基因多态性对颈动脉狭窄侧支循环形成的影响，可能对早期干预颈动脉狭窄及改善预后有较大意义。

1.   对象与方法

1.1   研究对象

纳入昆明医科大学第二附属医院脑血管病科2018年10月至2021年3月经数字减影血管造影（digital subtraction angiography，DSA）诊断颈动脉中重度狭窄及慢性闭塞患者65例。同期门诊或住院相匹配的无明显颈动脉狭窄者45例为对照组。

排除标准：具有以下任何一项：（1）癫痫、脑外伤、颅内肿瘤、颅内感染、脑出血、颅内动脉瘤、动静脉畸形等其他严重中枢神经系统疾病患者；（2）既往有严重卒中史，改良Rankin 量表（Modified Rankin Scale，mRS） > 2分；（3）急性颈动脉闭塞及发生在1月内的新发脑梗死患者；（4）合并有中重度颅内动脉狭窄者；（5）有严重的心脏病、肝肾功能不全和其他严重内科系统疾病；（6）有严重血小板异常、凝血功能异常等出血倾向者；（7）有碘过敏史及其他手术禁忌。

1.2   一般情况评定

评估所有入组患者的一般情况，并进行常规实验室及辅助检查：包括血细胞分析，凝血功能，肝肾功能检验；心电图、胸部CT、心脏超声等一般检查。所有患者均完成同型半胱氨酸检测。完成头颅CT或磁共振检查，排除脑出血、急性缺血性卒中及其他颅内病变。

1.3   研究方法

（1）所有患者采用计算机断层扫描血管成像（computed tomography angiography，CTA）检查完成脑血管的初步筛查，检查提示有中重度颈动脉狭窄或慢性闭塞的患者进一步行DSA检查：以2%利多卡因局部浸润麻醉，穿刺针在“Seldinger技术”下，穿刺右侧股动脉，置入"5F股动脉鞘"，给全身肝素化。以“5F猪尾巴、单弯造影导管”，分别经“血管成型术套件（Y阀）”连接滴注装置，在“035泥鳅导丝”导引下，选择性插管于主动脉弓上、双侧锁骨下动脉（必要时超选椎动脉）、双侧颈总动脉、行“全脑血管造影”。评估颈动脉狭窄程度、颅内外其他血管情况及侧支循环外代偿情况。（2）颈动脉狭窄的计算方法：狭窄程度 = （狭窄远端血管管径-最狭窄处管径）/狭窄远端血管管径×100%。判断血管狭窄的标准：正常；轻度狭窄（0～29%）；中度狭窄（30%～69%）；重度狭窄（70%～99%）；闭塞（100%）。（3）侧支循环代偿能力评估：ASITN评分^[4]：0级：无侧支血流到达缺血区域；1级：缓慢的侧支血流到达缺血部位外围，侧支血管显影伴持续充盈缺损；2级：快速的侧支血流到达缺血周边区域，侧支血管显影伴持续充盈缺损；3级：静脉晚期可见缓慢但是完全的血流到达缺血区；4级：快速而完全的侧支血流到达整个缺血区。3～4级为侧支循环开放良好。（4）MTHFR C677T 基因多态性检测：所有入组对象抽取晨空腹血3 mL，24 h内通过荧光定量PCR法完成MTHFR C677T 基因多态性检测。检测流程如下：①血液样本提取DNA。②试剂分装及上机，试剂分装：试剂完全化冻后，彻底混匀后瞬时离心。将反应液分装到PCR管中（每个反应液每孔23 μL）。将提取好的DNA样本彻底涡旋混匀，每个反应液加2 μL的DNA样本，盖好盖后瞬时离心，转移至荧光定量PCR仪上； 通道设置（三通道）：荧光通道FAM（波长465-510）-野生信号；荧光通道VIC（波长533-580）-突变信号；荧光通道ROX（波长 618-660）-内参信号；程序设置：37 ℃ 10 min；95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s；60 ℃（2C9&VKORC1&2C19项目为62 ℃） 60 s（收集荧光信号），40个循环；反应体积设置25 μL。③结果判读 通过每个位点的不同通道有无信号情况进行判读：根据该位点FAM通道Ct值及有无明显扩增曲线判定该位点为纯合野生型、杂合突变型以及纯合突变行。 基因亚型的判断：677TT 为MTHFR 酶222位缬氨酸纯合子，与677CC 酶活性相比降低50％～60％；677CT 为MTHFR 酶222位丙氨酸/缬氨酸杂合子，酶活性居中；677CC 为MTHFR 酶222位丙氨酸纯合子，酶活性正常。

1.4   统计学处理

应用SPSS 11.5软件进行统计分析，计量资料符合正态分布，用（ $\bar x \pm s $ ）表示，2组间比较采用t检验。计数资料用n（%）表示，组间比较用χ²检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

2.   结果

2.1   一般情况分析

与对照组相比，颈动脉中重度狭窄及慢性闭塞的患者既往卒中发生率显著增高（P < 0.05）。颈动脉中重度狭窄及慢性闭塞组的年龄、吸烟史、高血压、糖尿病史、总胆固醇、低密度胆固醇脂蛋白、同型半胱氨酸及MTHFR 基因CT/TT型占比较对照组比较差异有统计学意义（ P < 0.05），提示上述因素均可能是颈动脉狭窄及慢性闭塞的危险因素，见 表1。

表  1  颈动脉狭窄及慢性闭塞组与对照组一般情况比较[n（%）]

Table  1.  Comparison of the general conditions of patients with carotid stenosis or chronic occlusion [n（%）]

项目	颈动脉中重度狭窄及慢性闭塞（n = 65）	对照组（n = 45）	t/χ2	P
性别
男	43（65.2）	25（55.6）	1.265	0.260
女	22（33.8）	20（44.4）
年龄（岁， $\bar x \pm s $）	68.81 ± 12.65	64.10 ± 8.16	−2.039	0.0445*
吸烟史	36（55.4）	16（35.6）	4.194	0.040*
饮酒史	22（33.8）	10（22.2）	1.741	0.187
高血压	48（73.8）	19（42.2）	11.168	0.008*
糖尿病	31（47.7）	13（28.9）	7.351	0.007*
缺血性心脏病	11（16.9）	6（13.3）	0.262	0.608
既往卒中史	51（78.5）	16（35.5）	20.559	< 0.001*
TG（mmol/L， $\bar x \pm s $）	2.35 ± 0.53	2.11 ± 0.74	−1.791	0.077
TC（mmol/L， $\bar x \pm s $）	6.89 ± 1.86	3.85 ± 1.19	−8.967	< 0.001*
HDL（mmol/L， $\bar x \pm s $）	0.96 ± 0.20	1.16 ± 0.56	1.728	0.191
LDL（mmol/L， $\bar x \pm s $）	2.98 ± 0.77	2.01 ± 0.75	−6.007	< 0.001*
Hcy（umol/L， $\bar x \pm s $）	26.97 ± 9.14	15.13 ± 6.96	−6.769	< 0.001*
CC基因型	27（41.5）	31（68.9）	7.98	0.0047*
CT/TT基因型	38（58.5）	14（31.1）
*P< 0.05。

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2.2   颈动脉狭窄与慢性闭塞侧支循环分级与MTHFR C677T 基因多态性关系

65例患者MTHFR C677T 基因多态性检测：TT型10例；TC型28例；CC型27例。DSA诊断慢性闭塞20例，重度狭窄38例，中度狭窄7例。所有患者均有不同程度的侧支循环开放（部分病例见图1、2、3）。在慢性颈动脉闭塞患者中，侧支循环开放良好者（3～4级）CC型所占比例高于TT/CT型，组间比较差异有统计学意义（P < 0.05）。同样，在中重度颈动脉狭窄侧支循环开放良好者中，CC型比例显著高于TT/CT型，而侧支循环开放1、2级的患者，以TT/CT型为多，组间比较差异有统计学意义（ P < 0.05），见 表2，表3。

图  1  男性患者，58岁，左侧颈内动脉慢性闭塞

　侧支循环代偿评估：后交通动脉开放，大脑后动脉通过后交通动脉向大脑前动脉供血区供血；大脑前动脉软膜支代偿大脑中动脉供血。 ASITN/SIR 分级2级。

Figure  1.  male，58 years old， chronic left carotid artery occlusion. The collateral circulation assessment.

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图  2  男性，52岁，左侧颈总动脉慢性闭塞，侧支循环代偿评估

　前交通动脉开放，右侧大脑前动脉通过前交通动脉代偿左侧大脑前动脉、大脑中动脉供血区，ASITN/SIR 4级。

Figure  2.  male，52 years old， chronic left carotid artery occlusion. The collateral circulation assessment.

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表  2  慢性颈动脉闭塞侧支循环分级与MTHFR C677T 基因多态性关系[n（%）]

Table  2.  Relationship between the grade of collateral circulation and MTHFR C677T gene polymorphism in patients with chronic carotid artery occlusion [n，（%）]

项目	n	慢性颈动脉闭塞侧支循环分级（n = 20）
		4 级（n = 5）	3级（n = 9）	2级（n = 5）	1级（n = 1）
CC	11	4（36.37）	6（54.55）	1（9.10）	0
TT/TC	9	1（11.11）	1（11.11）	6（66.67）	1（11.11）
χ2		9.8413
P		0.02*
组间比较，*P< 0.05。

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表  3  中重度颈动脉狭窄侧支循环分级与MTHFR C677T 基因多态性关系[n（%）]

Table  3.  Relationship between t the grade of collateral circulation and MTHFR C677T gene polymorphism in patients with moderate and severe carotid stenosis [n（%）]

项目	中重度颈动脉狭窄侧支循环分级（n = 45）
	4 级（n = 6）	3级（n = 11）	2级（n = 20）	1级（n = 8）
CC （n= 16）	4（25）	7（43.75）	4（25）	1（6.25）
TT/TC （n= 29）	2（6.89）	4（13.79）	16（55.12）	7（24.14）
χ2	10.288
P	0.016*
组间比较，*P< 0.05。

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图  3  女性，64岁， 左侧颈内动脉重度狭窄，侧支循环代偿评估

　前交通动脉开放，右侧大脑前动脉通过前交通动脉代偿左侧大脑前动脉供血，ASITN/SIR 1级。

Figure  3.  female，64 years old， severe left carotid stenosis. The collateral circulation assessment.

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3.   讨论

甲基化途径是Hcy代谢的重要途径之一，由叶酸代谢循环途径提供的5-甲基四氢叶酸是其甲基供体。MTHFR是该代谢途径中的还原酶，它的基因错义突变可引起此酶的缺乏或降低，其中677C—T 的碱基突变最常见，等位基因“T”可导致酶活性的降低和血同型半胱氨酸水平的增高。有研究证实在低叶酸水平存在时，MTHFRC677T 的碱基突变者血中的同型半胱氨酸浓度明显增高，这类人群发生动脉粥样硬化及缺血事件的几率明显增高^[5]，在没有常见脑血管病危险因素的青年卒中者更为明显^[6]。国内外目前对MTHFR基因多态性与颈动脉狭窄的关系研究结果尚不一致，有研究报道^[7-8]，TT 型的血Hcy水平明显高于CT 型和CC 型，而CT 型和CC的患者颈动脉内膜厚度则低于TT型。MTHFRC677T 的碱基突变可能增加了老年人，尤其是合并高血压患者颈动脉粥样斑块形成的风险。还有研究表明，MTHFRC677T基因多态性与颈动脉的内中膜增厚有关^[9-10]，同时也是自发性颈动脉夹层引起的血管狭窄的危险因素^[11]。但也有研究认为^[12]，MTHFR C677T基因多态性虽与血浆Hcy水平相关，但不是颈动脉粥样硬化的独立危险因素。多数学者研究发现MTHFR C677T基因多态性与颈动脉狭窄有相关性^[9-10]，然而颈动脉狭窄与侧支循环形成的关系研究尚未成体系。

脑侧支循环是当脑血管狭窄或闭塞时，血流通过其他血管吻合改变血流路径而对缺血区域的血流代偿灌注的一种方式。Tallarita等^[13]研究发现，当存在颈动脉狭窄或闭塞时，脑血流自动调节机制启动，侧支循环开放代偿缺血区域的供血。侧支循环开放的主要机制可能有：脑长期低灌注可使体内相关的细胞和多种内源性促血管再生因子水平发生变化，如血管内皮生长因子等，使内皮细胞活化、迁移、增殖、黏附和再连接，定位到缺血组织，形成管腔样结构，从而建立侧支循环^[14]。Nascet研究^[15] 证实，侧支循环代偿良好的颈动脉狭窄患者发生缺血性卒中的风险显著降低，血管成形术后围手术期并发症及卒中复发较少。侧支循环代偿不良则是卒中复发的独立危险因素^[16]。

轻度颈动脉狭窄一般不影响颅内供血，也不会有明显侧支循环形成，本研究仅纳入中重度颈动脉狭窄及慢性闭塞患者。本研究表明，与对照组相比，颈动脉中重度狭窄和慢性闭塞的患者，其年龄、胆固醇水平、既往罹患糖尿病、高血压以及长期吸烟，高Hcy血症是颈动脉狭窄的危险因素。MTHFRC677T基因多态性检测中，颈动脉中重度狭窄和慢性闭塞的患者CT/TT基因型比例较对照组明显增高，该基因型亦可能为颈动脉狭窄及慢性闭塞的危险因素，这与目前国内外的部分研究结果一致^{[2-3, 17]}。进一步对颈动脉中重度狭窄及慢性闭塞的患者进行全脑血管造影进行侧支循环评估，并分析侧支循环开放程度与MTHFRC677T基因多态性的关系。结果显示，TT型患者相对较少。无论是慢性颈动脉闭塞组，还是中重度狭窄组，较TT/CT型， CC型患者总体侧支循环开放更好。MTHFR677 位点C→T碱基突变导致酶活性降低，同型半胱氨酸代谢途径改变、增加血中同型半胱氨酸浓度等对脑血管产生不利影响。高Hcy血症可能引起血NO浓度降低、血管舒张功能障碍，促进血管壁平滑肌增生，激活巨噬细胞与内皮细胞，诱导泡沫细胞生成与平滑肌细胞肥大、增生及移行，促使细胞外基质特别是胶原的合成增加等^[18]；同时高Hcy血症还通过氧化应激作用损伤血管内皮、使血管壁顺应性下降、干扰内皮细胞凝血酶调节蛋白、使机体处于高凝状态等^[19]作用，以上对血管结构和功能的不良影响可能导致Willis环血管病变及潜在的小侧支血管发育及开放不良、闭塞等，使患者在发生颈动脉严重狭窄和慢性闭塞时侧支循环开放不良。

颈动脉狭窄或慢性闭塞的患者，侧支循环代偿的程度往往预示了患者发生卒中的风险；一旦患者发生缺血性卒中时，侧支循环还决定了发生梗死后缺血半暗带及核心梗死体积大小、梗死核心发展的速度、卒中的严重程度，是卒中异质性的主要原因。本研究已排外既往曾发生过严重卒中患者，因此对于尚未发生严重神经功能缺损症状的颈动脉狭窄患者，早期进行MTHFRC677T基因多态性检测，可能对该患者的侧支循环形成有预测作用，除了干预常见的脑血管危险因素外，对于CT，尤其是TT型的患者，应更早更积极的采取促进侧支循环的相关治疗，适当放宽颈动脉狭窄外科治疗的手术指征，以期改善预后。