Salivary Microbial Profiles of Dental Caries among Lisu Preschool Children in Yunnan Province
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摘要:
目的 研究云南省5岁傈僳族高龋和无龋儿童的唾液优势菌，并分析与当地汉族儿童的差异。 方法 选取云南省怒江州傈僳族高龋（dmfs≥6）及无龋儿童（dmfs = 0）各20名，同时选取同样的高龋和无龋汉族儿童作为对照，采集唾液样本，运用illumina Hiseq平台对16SrRNA V4区进行单端测序，分析微生物的群落结构和多样性。 结果 基于97%的相似度聚类获得傈僳族、汉族高龋、无龋儿童口腔微生物物种注释（operational taxonomic unit，OTU）数目共3965个，归属于16个门，23个纲，57个目，102个科，202个属；4个组间Alpha多样性及丰富度指数差异无统计学意义（P > 0.05），4组菌群主坐标分析（principal co-ordinates analysis，PCoA分析）差异无统计学意义（ P > 0.05）；在傈僳族中，高龋组链球菌属（ Streptococcus）丰度高于无龋组（P < 0.05），而嗜血杆菌属（ Haemophilus）、志贺氏埃希菌属（Escherichia-Shigella）、梭杆菌属（Fusobacterium）丰度低于无龋组（P < 0.05）；在高龋组中，傈僳族孪生球菌属（ Gemella）丰度高于汉族（P < 0.05），志贺氏埃希菌属（ Escherichia-Shigella）丰度低于汉族（P < 0.05）。 结论 云南傈僳族、汉族高龋无龋儿童的唾液微生物群落丰度、多样性、组成相似，但2个民族不同患龋状态有其特异性菌属，造成差异的原因需要进一步研究。 Abstract:Objective To study the salivary predominant bacteria in 5-year-old Lisu children with and without dental caries in Yunnan Province and to analyze the differences with local Han children. Methods 20 Lisu children with high caries （dmfs≥6） and 20 children without caries （dmfs = 0）were selected from Nujiang Prefecture of Yunnan Province. Local Han children were also selected with the same inclusion criteria as comparison. Saliva samples were collected. The 16SrRNA V4 hyper variable region was sequenced using illumina Hisequencing platform. The community structure and diversity of microorganisms were analyzed using Mothur software. Results A total of 3965 oral microbial species annotations （Operational taxonomic unit , OTU） were obtained based on 97% similarity clustering in Lisu and Han Chinese children with and without dental caries, belonging to 16 phyla, 23 classes, 57 orders, 102 families and 202 genera. The differences in Alpha diversity and richness indices among the four groups were not statistically significant （P > 0.05）, and the differences in principal co-ordinates analysis （PCoA analysis） among the four groups were not statistically significant （ P > 0.05）. The abundance of Streptococcus in the Lisu caries-active group is higher than that of the caries-free group, while the abundance of Haemophilus, Escherichia-Shigella, Fusobacterium, Capnocytophaga, Megasphaera is lower than that of the caries-free group. For caries-active children, the abundance of Gemella was higher in Lisu than in Han, and the abundance of Escherichia-Shigella was lower in Lisu than in Han. Conclusions The diversity, richness and composition of salivary microbial communities were similar among the Lisu and Han children with and without dental caries in Yunnan. However, the dental caries bio-markers of the two ethnic minority were different. The reasons underline the findings need further invesitigation. -
Key words:
- Lisu ethnic minority /
- Children /
- Dental caries /
- 16SrRNA /
- Salivary microorganism
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脑胶质瘤是最常发生的中枢神经系统恶性肿瘤之一，源于颅内的神经上皮组织，在颅脑肿瘤中所占比例 > 40%[1]。一般情况下，低级别的胶质瘤的预后良好;高级别胶质瘤存在较强的侵袭性，预后极不理想。高级别胶质瘤-间变型胶质瘤的5 a生存率约30%，胶质母细胞瘤的5 a生存率只有5.5%，胶质母细胞瘤患者的生存期小于1 a的超过了50%[2]。胶质瘤的治疗方法较多有显微外科手术治疗；术后辅助治疗（放化疗等）；免疫及基因靶向治疗等，但几乎所有的胶质瘤都会复发，导致病患预后不佳[3]。复发胶质瘤的再治疗十分必要但任务艰巨，且没有标准选择的治疗方式[4]，对于复发脑胶质瘤的治疗通常包括再次外科手术治疗、全身化疗、局部放射等综合治疗，外科手术治疗复发脑胶质瘤并非只追求全切肿瘤，而是在最大限度进行肿瘤切除的基础上尽可能对患者的神经功能进行保护，使其生存期得到延长。对28例脑胶质瘤手术后复发再手术患者的临床资料进行回顾性分析，再次手术治疗的临床疗效用KPS（Karnofsky physical status scores）进行评估，通过影像学资料评价肿瘤切除程度、术后病理诊断对比复发脑胶质瘤的病理变化、术后辅助治疗、随访患者生存期等总体进行疗效评价，现就其手术情况及治疗效果报告如下。
1. 资料与方法
1.1 研究对象
选取2017年9月至2020年12月昆明某三甲医院神经外科收住的脑胶质瘤手术后复发再手术患者的全套病历资料，按纳入及排除标准筛选脑胶质瘤复发后再手术的患者作为研究对象，共28例。28例患者，男性15例、女性13例，年龄（11～68）岁；平均年龄（45.46±12.26）岁，男性平均年龄（44.56±14.03）岁，女性平均年龄（47.79±9.45）岁，发病多集中于（40～50）岁之间。
1.2 纳入标准
首次接受神经外科的显微手术切除，病理诊断最终结果为脑胶质瘤；术后MRI随访证实为肿瘤复发；针对性的进行再次手术治疗，病理诊断最终结果为脑胶质瘤；临床病历、术后随访的资料完整。
1.3 排除标准
首次神经外科手术经病理诊断证实为非脑胶质瘤患者或虽为脑胶质瘤但因各种原因未行二次手术治疗的患者，影像学、随访资料不完整；根据观察术后的并发症、肿瘤复发情况随访结果，确认有影响同时出现其他的系统疾病、或存在严重的脏器功能障碍。
1.4 临床资料
研究对象首次手术病理的诊断结果：WHOⅠ-Ⅱ级患者13 例；WHO Ⅲ-Ⅳ 级患者15例；胶质母细胞瘤12例；星形细胞瘤15例；少突胶质细胞瘤1例；首次手术后进行相关辅助治疗（放疗、化疗、靶向治疗等）的患者 22 例、未进行 相关辅助治疗（放疗、化疗、靶向治疗等）的患者 6 例，见表1。
表 1 临床资料分析结果Table 1. Clinical data analysis results病理分型 n 构成比（%） 胶质母细胞瘤 12 42.86 星形细胞瘤 15 53.57 少突胶质细胞瘤 1 3.57 患者再次入院后，临床表现包括头痛头晕、恶心呕吐、言语功能及肢体功能障碍、癫痫发作等，其中头晕头痛21例；肢体功能障碍15例；言语功能障碍7例；恶心呕吐6例；癫痫发作4例；视力下降3例；面神经功能障碍、平衡功能障碍、精神症状各1例；再次入院查体的阳性体征主要以肢体肌力减退、面神经功能障碍、共济失调、病理征阳性等为主，其中肢体肌力减退15例、面瘫2例、共济失调3例、Romberg征阳性2例、指鼻试验阳性1例、跟膝胫试验阳性1例，见表2。首次手术后距再手术时间，平均（31.75±43.82）月，最长时间204月，最短时间1月，WHOⅠ-Ⅱ级患者手术间隔时间平均（37.30±35.42）月，WHOⅢ-Ⅳ级手术间隔时间平均（25.31±50.08）月。
表 2 再入院临床症状分析Table 2. Analysis of clinical symptoms of readmission分类 n 占比（%） 头晕头痛 21 75.00 恶心呕吐 6 21.43 言语功能障碍 7 25.00 肢体功能障碍 15 53.57 癫痫发作 4 14.29 视力下降 3 10.71 面神经功能障碍 1 3.57 平衡功能障碍 1 3.57 精神症状 1 3.57 1.5 影像学检查
本组 28 例患者均行MRI和/或CT随访复查，MRI序列在胶质瘤术后随访中起重要作用，胶质瘤病灶信号在T1上低，T2上混杂，瘤周水肿高，DWI/SWI/PWI/MRS/DTI 等多序列在胶质瘤的生长中起重要的提示作用。CT可显示肿瘤卒中或肿瘤伴钙化。首次手术后MRI诊断结果，复发部位：额叶18例（64.3%）；颞叶10例（35.7%），见表3。中线移位、侧脑室受各12例（42.9%）；脑积水5例（17.9%）；大脑镰下疝3例（10.7%）；四脑室受压2例（7.1%）；大脑中动脉被包裹、大脑前动脉被包裹各1例（3.5%）。应用多田氏体积计算法，计算肿瘤体积平均（37.15±45.90）cm3，最大体积 178 cm3，最小体积 0.19 cm3。
表 3 复发情况分析Table 3. Analysis of clinical symptoms of readmission属性 n 构成比（%） 累计部位 单个脑区 12 42.86 多个脑区 16 57.14 复发种类 原位复发 13 46.43 周边复发 11 39.29 浸润复发 4 14.29 肿瘤表现 实性占位 18 64.29 囊性占位 9 32.14 囊性占位 1 3.57 1.6 手术治疗
（1）术前处理：根据术前影像学检查，给予患者脱水降颅压、甲强龙等激素治疗改善肿瘤周围水肿。
（2）手术原则：瘤内分块进行肿瘤切除，在尽量全部切除的基础上，最大程度保护正常的脑组织。
（3）手术方式：本研究28例患者均行再手术治疗，26例（92.9%）患者行开颅肿瘤切除，肿瘤活检术及V-P分流术（流行脑室腹腔分流术）2例（7.1%），其中患者联合术中超声实时指导肿瘤边界8例（28.6%）。3患者联合术中超声 MRI 融合影像技术指导肿瘤切除例（10.7%），患者行术中唤醒清醒状态下肿瘤切除2例（7.1%），患者术中显微镜联合神经内镜技术切除肿瘤2例（7.1%），全部患者均应用术中电生理监测技术指导手术切除，术后1周内MRI平扫+增强+弥散证实肿瘤全切（切除率 > 90%）21例（75%），次全切（切除率 > 60%， < 90%）5例（17.9%），肿瘤活检（仅留取少量组织行病理活组织检测）2例（7.1%）。
（4）术后处理及随访：对患者的血压、神志、瞳孔等生命体征的变化情况进行密切观察，防止术区出血、术后脑水肿、继发性癫痫等并发症出现。对出院患者进行定期随访，用KPS进行神经功能缺损的评估。采用MR复查，进行肿瘤切除程度及患者颅内情况判断。对神经功能缺损、颅内感染、脑疝形成、癫痫发作、脑积水及肺部感染的并发症发生率、患者术前术后症状改善率进行统计分析。
1.7 统计学处理
通过Graphpad Prism（V8.4.2.679）软件，进行数据分析、作图。用均数±标准差（
$\bar x \pm s $ ）描述连续性变量。用例数和百分比或构成比描述非连续性变量，术前及术后的KPS评分差异性用配对t检验分析，检验水准α = 0.05。2. 结果
2.1 肿瘤切除程度
本组28例患者均进行再手术治疗，术后1周内MRI平扫+增强+弥散证实肿瘤全切（切除率 > 90%）21例（75%），次全切（切除率 > 60%， < 90%）5 例（17.9%），肿瘤活检（仅留取少量组织行病理检测）2例（7.1%）。2例（7.1%）行V-P分流患者脑积水改善明显，见图1。
图 1 63岁男性患者手术前后的影像学及病理资料a~c：首次术前MRI 增强扫描提示病变明显强化；d~f ：首次术后MRI 增强扫描证实肿瘤全部切除；g~i：首次术后 9 月 MRI 增强扫描提示肿瘤存在复发；j~l：二次手术后 MRI 增强扫描证实肿瘤全部切除；m：首次术后病理示胶质母细胞瘤 WHOⅣ级（HE×40）；n ：二次术后病理示胶质母细胞瘤 WHO Ⅳ级（HE×40）。Figure 1. Imaging and pathological data of a 63-year-old male patient before and after surgery2.2 术后病理结果
对比首次术后患者病理检验结果，8例（28.6%）WHOⅠ-Ⅱ级胶质瘤患者出现病理级别增高，再手术后病理级别进展为 WHOⅢ-Ⅳ级，见图1。11例（39.3%）WHOⅢ-Ⅳ级胶质瘤患者再手术后病理级别无变化，9例（32.1%）WHOⅡ级胶质瘤患者再手术后病理级别无变化。
2.3 术后并发症及症状改善情况
术后1周内评估研究对象，术后22例出现并发症（78.6%），其中15例肺部感染（53.6%）；3例切口愈合不良（10.7%）；2例肢体肌力减退的2例（7.1%）； 肢体浅感觉减退、面瘫1例、听力下降、颅内感染各1例（3.5%）。颅内感染患者随访至出院后21 d死亡，肺部感染及切口愈合不良患者至出院恢复良好。至离院时评估患者症状较前改善24例，改善率85.7%。
2.4 术后随访情况
所有患者进行随访，本研究28例患者再入院前至少已进行1次外科手术切除肿瘤，最终病理检测诊断为胶质瘤，首次术后进行门诊、电话、微信随访，术后每3月复查MRI平扫+增强+弥散序列，9例（32.1%）患者再入院前1~3月MRI提示疑似复发可能，随访至入院前，肿瘤较前增大，患者出现轻微症状如头痛等再入院行外科手术治疗。对所有患者进行再入院术前的KPS评分，平均分（66.07±7.37），术后2周的KPS评分，平均分（72.14±11.00），术后KPS评分高于术前KPS评分，差异有统计学意义（P < 0.05），见表4。所有患者出院后进行随访，每3月进行随访1次，随访不足3月按最后随访日期计算，9例（32.1%）患者随访至今，按最大随访日期计算生存时间，20例（71.4%）患者随访至出院某一时间段死亡。28例患者平均生存时间（7.98±6.42）月，最大生存时间24月，最小生存期限0.6月。男性、女性患者的生存期差异没有统计学意义（P > 0.05）；再次术前进行放化疗的患者，中位生存期低于再术前未进行放化疗的患者；再次术后病理 WHOⅡ级患者生存期高于WHOⅢ-Ⅳ级患者，WHOⅢ级患者生存期与 WHOⅣ级患者无统计学差异；再发于幕上患者生存期与幕下患者无统计学差异，见图2。12例（42.9%）患者术后积极接受放化疗、靶向治疗等辅助治疗，16 例（57.1%）患者因肿瘤恶性的程度极高选择放弃辅助治疗。
表 4 术前术后KPS评分[（$\bar x \pm s $ ），分]Table 4. KPS score before and after surgery [（$\bar x \pm s $ ），points]组别 n KPS 评分 手术前 28 66.07 ± 7.37 手术后 28 72.14 ± 11.00 P 0.0016 
图 2 28 例患者术后生存曲线A：男性（man）患者与女性（female ）患者生存期无统计学差异；B：再次术前进行放化疗（Chemoradiotherapy）患者中位生存期低于再术前未进行放化疗患者；C：再次手术后病理 WHOⅡ级患者生存期高于 WHOⅢ-Ⅳ级患者，WHOⅢ级患者生存期与 WHOⅣ级患者无统计学差异；D：再发于幕上（Supratentorial）患者生存期与幕下（Subtentorial）患者无统计学差异。3. 讨论
在颅内原发肿瘤中，脑胶质瘤约占60%左右[5]。其表现为浸润生长，低级别胶质瘤经手术治疗联合放化疗的标准模式治疗后可获得较长的无进展生存期和生存期[6]，高级别胶质瘤与正常组织的边界模糊，恶性程度极高且侵袭性很强，经过标准模式治疗（手术治疗联合放化疗）手但预后效果仍然不理想，胶质母细胞瘤患者的的中位生存期仅有14～16月[7]。相关研究显示，复发脑胶质瘤的瘤周水肿区观察到胶质瘤细胞，为术后复发危险因素，故胶质瘤术后复发是一种必然结果[8] 。虽经积极治疗，但脑胶质瘤终会复发，致使其中位生存期不佳[9] 。
脑胶质瘤术后复发是脑胶质瘤行手术切除术后，不论是否合并综合辅助治疗，在术区和（或）术区以外出现的单发、多发胶质瘤。为了使患者获得最佳的预后和更长的生存期，复发肿瘤的治疗是必不可少的。对于复发的胶质瘤的最佳治疗方案仍存在争议，但手术仍然是解决急性并发症和减小肿瘤占位效应所必要的治疗手段[10]。多个研究结果表明，再次手术治疗可以延长脑胶质瘤复发患者的生存期[11]。本研究28例患者复发后均进行再手术治疗，术后症状改善率高达85.7%。复发的胶质瘤往往呈侵袭性生长，完整切除肿瘤还是保留重要脑区功能均要被考虑[12]。复发脑胶质瘤行外科手术时，不能只关注是否能全切，而是应该考虑在对肿瘤进行最大限度切除的基础上尽量对患者的神经功能进行保护，以提升患者的生活质量、使患者的生存期得到延长。本研究中的脑干胶质瘤术后复发的2例患者出现了继发的梗阻性脑积水，对患者病情进行综合评估后，行脑室腹腔分流术以缓解脑积水、使颅内高压有所降低，可以使预后情况得到相应的改善。另外，有研究表明再手术对于复发脑胶质瘤患者的无进展生存期延长、相关症状改善有一定的作用[13]。综合目前相关研究文献报告结合本研究，笔者认为以下复发脑胶质瘤患者可以从手术治疗中获益。（1）手术颅骨窗外凸、颅内压增高、存在明显的神经系体征、肿瘤复发占位效应明显、中线结构受压移位；（2）患者出现癫痫（药物难以控制）；（3）脑积水（脑室系统受压出现致命性）；（4）高级别胶质瘤且对其他辅助治疗效果不敏感或治疗后出现急性并发症；（5）再手术前KPS评分≥60分；定位肿瘤边界的术中超声、MRI超声影像融合技术；定位功能区的术中的电生理监测技术；适当的运用神经内镜技术对显微镜视野盲区进行了一定程度的弥补；术中唤醒技术的应用等多模态、多技术的联合应用[14-15]，能够为复发胶质瘤的手术治疗提供更为直观的证据，从而在最大程度切除肿瘤的基础上尽量对患者神经功能进行保护，从而使患者的生活质量得到提高、患者生存期得到延长。本研究28例复发胶质瘤患者中，21例患者应用了术中超声、术中超声MRI影像融合技术切除肿瘤，2例患者应用神经内镜技术联合显微外科切除，应用术中唤醒清醒状态下功能区肿瘤切除术的患者2例，在术中使用电生理监测的患者26例。经上述多模态、多技术的联合应用，患者术后症状改善率85.7%，相较于文献报道的未再手术治疗患者改善率28%更高[16]。
随着现代神经外科学的进步与发展，除手术治疗之外的众多辅助治疗手段被用于复发脑胶质瘤的治疗，例如放化疗；靶向、电场、免疫治疗等。多学科协作治疗复发胶质瘤治疗逐步成为了一种新的模式，二次放射治疗，特别是立体定向放射治疗，因为其精度高、副作用少、有效改善靶体积偏移、提高复发胶质瘤患者生存期等优势而发展成为复发胶质瘤的有效治疗手段被广泛应用[17-18] 。脑胶质瘤患者使用替莫唑胺时，ＭGＭT（O6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶）的高甲基化可以使其效果有显著提高，从而延长生存期[19] 。有研究表明，胶质瘤再复发患者使用联合化学治疗后，中位生存期可提升26%；靶向治疗时，使用贝伐单抗联合替莫唑胺，可以提升复发性脑胶质瘤患者的治疗效果，进而提高了生活质量[20]；较单纯化疗组，电场治疗联合化疗组的中位生存期明显更长且毒性更低、更安全[21] 。Cloughesy等[22]的研究结果显示，程序性细胞死亡蛋白1阻滞剂对胶质母细胞瘤复发患者的中位生存期与无进展生存期有延长效果。
综上所述，复发性脑胶质瘤治疗时，首选方式是手术为主，同时辅助综合治疗法（放化疗，靶向、电场、免疫治疗等）。术中的超声、MRI超声影像融合、神经内镜、电生理监测、及术中唤醒等技术联合应用的显微外科手术是复发脑胶质瘤的相对微创且有效的治疗方式，可有效提高患者的无进展生存期，可当做复发脑胶质瘤手术切除的选择术式之一。本研究为回顾性分析，病例数量不多，随访时间相对较短，结果可能有一定偏倚，仍需要根据胶质瘤复发患者的不同情况，全面分析，综合评估，制定适合不同个体的个性化诊疗方案。
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图 2 唾液微生物Alpha多样性指数比较（mean±SD）
A：ACE指数；B：Chao指数；C：Shannon指数；D：Simpson指数
Figure 2. Comparison of salivary microbial Alpha diversity index （mean±SD）
图 3 唾液微生物群落结构的主坐标分析（基于97%相似度的OTU分类水平）
Figure 3. Principal co-ordinates analysis of the salivary microbial community structures （OTU classification level based on 97% similarity）
图 4 门水平主要物种分布
Figure 4. The distributions of the predominant bacteria at the phylum level
图 5 属水平主要物种分布
Figure 5. The distributions of the predominant bacteria at the genus level
图 6 傈僳族高龋、无龋组唾液微生物群落属分类水平上的组间Wilcoxon秩和检验
Figure 6. Wilcoxon rank-sum test between groups at the genus taxonomic level of salivary microbial communities in the Lisu_CA and Lisu_CF groups
图 7 傈僳族、汉族高龋组唾液微生物群落属分类水平上的组间Wilcoxon秩和检验
Figure 7. Wilcoxon rank-sum test between groups at the genus taxonomic level of salivary microbial communities in the Lisu_CA and Han_CA groups
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