PEG6000修饰的流感疫苗脂质体的制备和稳定性

李漂; 刘晓琳; 杨艾; 张茜; 鲁卫东

doi:10.12259/j.issn.2095-610X.S20220307

PEG6000修饰的流感疫苗脂质体的制备和稳定性

doi: 10.12259/j.issn.2095-610X.S20220307

昆明医科大学药学院暨云南省天然药物药理重点实验室，云南昆明　650500

基金项目: 云南省生物医药重大科研专项基金资助项目（2018ZF006）

详细信息

作者简介:
李漂（1997～），女，四川雅安人，在读硕士研究生，主要从事颗粒型疫苗佐剂研究工作

通讯作者:
鲁卫东，E-mail：13064244163@163.com

中图分类号: R392
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出版历程
- 收稿日期: 2022-01-12
- 网络出版日期: 2022-02-18
- 刊出日期: 2022-03-22

Preparation and Stability of Influenza Vaccine Liposomes Modified by PEG6000

School of Pharmaceutical Science and Yunnan Key Laboratory of Pharmacology for Natural Products，Kunming Medical University，Kunming Yunnan 650500，China

摘要

摘要: 目的筛选出PEG6000流感疫苗脂质体的最佳制备工艺并且评价其稳定性。方法将小鼠免疫7 d，通过MTT法确定加入PEG6000的最佳摩尔百分比和最佳制备工艺。采用冻融冻干法制备PEG修饰的流感疫苗脂质体，将样品分别储存于不同温度[4 ℃、（25±2） ℃、（37±2） ℃]下，在设定时间取样测定包封率、胸腺指数和抗体滴度，考察其物理和生物稳定性。结果 MTT实验结果表明，PEG6000占磷脂摩尔百分比为4%时为最佳用量（P < 0.01），最佳工艺为后修饰法。PEG6000修饰的流感疫苗脂质体冻干粉在（37±2） ℃条件下放置6个月后，包封率仍在80%以上；在（25±2） ℃放置3个月后抗体滴度比 > 4，表明仍具有较好的免疫效应。结论 PEG6000占磷脂摩尔百分比为4%时为最佳用量，采用后修饰法制备为最佳工艺；PEG6000脂质体具有良好的物理稳定性及生物稳定性。
- 脂质体 /
- PEG6000 /
- 流感疫苗 /
- 稳定性
Abstract: Objective To screen out the best method of PEG6000 modified liposomes for influenza vaccine and evaluate its stability. Methods After 7 d of immunization, the optimal molar percentage of PEG6000 and the optimal preparation method were assumed by MTT method. The PEG-modified influenza vaccine liposomes were prepared by freeze-thaw freeze-drying method. The samples were stored at different temperatures （4 ℃, 25±2 ℃, 37±2 ℃）, and the encapsulation rate and thymus index and antibody titer were measured at a fixed time. So the physical and biological stability of the samples were investigated. Results The MTT experiment showed that PEG6000 was the best dosage when the molar percentage of phospholipid was 4% （P < 0.01）, and the best process was post-modification method.The entrapment rate of PEG6000 modified liposome for influenza vaccine was still higher than 80% when stocked at 37±2 ℃ for 6 months.At 25±2 ℃ for 3 months, the antibody titer was more than 4, indicating that the antibody still had nice immune effection. Conclusions PEG6000 best dosage of phospholipid when the molar percentage of PEG6000 is 4%, and post-modification method is the best preparation process. PEG6000 liposome has nice physical stability and biological stability.
- Liposomes /
- PEG6000 /
- Influenza vaccine /
- Stability

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脂质体（liposome，Lip）具备良好的生物相容性、靶向性和增强药物稳定性作用，是近年来较为前沿的一种颗粒型疫苗佐剂和靶向药物载体^[1-2]，利用脂质体包裹药物可以提高其稳定性并且产生靶向作用。但是，普通脂质体极易从体内清除^[3-4]，PEG是聚乙二醇英文名polyethylene glycol的简称，安全性和水溶性高，与生物组织有良好的相容性^[5-7]。PEG6000修饰的脂质体能有效降低吞噬细胞识别摄取作用，从而延长其在体内的循环时间，有利于药物靶向浓集于病灶组织^[8]，极大地提高目标药物的治疗指数和疗效^[9-12]。除此之外，阳离子脂质体实际上也是一种很好的免疫佐剂，可以增强机体免疫应答。本文通过实验探究，筛选出PEG6000修饰流感疫苗脂质体中PEG6000的最佳用量和制备工艺，并且对所制备的脂质体进行初步的稳定性考察，探究其储存的时效性。

1. 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 流感疫苗

H1N1（批号：SA2018002），血凝素含量：225.0 μg/mL；H3N2（批号：SB2018002），血凝素含量：166.5 μg/mL；B（V）（批号：SC2018001），血凝素含量：369.1 μg/mL；B（Y）（批号：SC2018006 ），血凝素含量：326.1 μg/mL。（江苏沃森生物技术有限公司提供）。

1.1.2 实验动物

SPF级KM小鼠，雌性，标准体重（18～22g），昆明医科大学实验动物中心提供，[合格证号为SCXK9（滇）2005-0008]。本研究通过昆明医科大学伦理委员会审核批准。

1.1.3 主要试剂

大豆卵磷脂（北京美亚斯磷脂技术公司）；胆固醇（北京鼎国昌盛生物技术优先责任公司）；PEG6000（美国Sigma公司）；Folin酚蛋白定量试剂盒（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）。

1.2 方法

1.2.1 PEG6000用量与处方筛选

冻融-冻干法制备脂质体^[13]，将小鼠分为6组（n = 5），PEG6000剂量（摩尔百分比）：2%、4%、6%，PBS阴性对照组、中性组、疫苗原液组，通过脾淋巴细胞增殖实验，免疫7 d后的刺激指数（SI值）确定最佳的PEG6000的用量。以PEG6000的最佳剂量为基础，将小鼠分为5组（n = 5），PEG后修饰组、PEG共成膜组、PBS阴性对照组、中性组、疫苗原液组，免疫7 d后通过测定脾淋巴细胞增殖实验的刺激指数（SI值），筛选出PEG6000的最佳制备方法（共成膜法和后修饰法）。实验以疫苗原液组为阳性对照组，PBS为阴性对照组。

1.2.2 PEG6000修饰的流感疫苗脂质体稳定性研究

（1）PEG6000修饰的流感疫苗脂质体物理稳定性研究：将最佳工艺制备的PEG6000流感疫苗脂质体混悬液、冻干粉分别放置于不同温度[4 ℃、（25±2） ℃和（37±2） ℃]环境下进行温度加速实验。在规定时间点（0、1、2、6个月）取样，PBS复溶脂质体冻干粉，与混悬液分别于4 ℃、45000 r/min高速离心1h，用Lowry法^[14]测定其包封率。考察 PEG6000流感疫苗脂质体混悬液和冻干粉包封率在不同时间点的变化情况，初步考察其物理稳定性。（2） PEG6000修饰的流感疫苗脂质体生物稳定性研究：①PEG6000修饰的流感疫苗脂质体免疫小鼠后免疫器官指数。不同温度[4 ℃、（25±2） ℃]条件下对最佳工艺制得的PEG6000脂质体冻干粉和中性脂质体冻干粉进行温度加速实验，疫苗原液组作为阳性对照始终储存于4 ℃。小鼠分为4组（n = 5），即PBS组、PEG冻干粉组、中性冻干粉组和疫苗原液组。在设定的时间点（1、2、3个月）^[15]取样腹腔注射免疫小鼠，免疫7 d后称重，脱颈处死，取胸腺称重，计算胸腺指数。（指数 = 器官重量/体重g×10）^[16]。②体液免疫。不同温度[4 ℃、（25±2） ℃]条件下对PEG6000流感疫苗脂质体冻干粉和中性脂质体冻干粉进行温度加速实验，疫苗原液组作为阳性对照始终储存于4 ℃。在不同时间点（1、2、3个月）取样腹腔注射免疫小鼠，免疫7 d后取血清，以微量血凝抑制法（HI）测定小鼠血清抗体滴度比，评价其免疫原性。

1.3 统计学处理

采用 SPSS18.0 统计软件进行分析，统计结果以均值±标准差（$\bar x \pm s $）表示，多组间比较选择单因素方差分析，组间两两比较选择LSD法进行，P < 0.05为差异有统计学意义。

2. 结果

2.1 PEG6000用量和制备工艺筛选结果

PBS阴性对照组与其他各组间SI值差异均有统计学意义（P < 0.05），PEG6000百分摩尔比4%组SI值与其他组差异均有统计学意义（P < 0.01），且PEG6000百分摩尔比4%组的SI值高于其他各组。表明PEG6000百分摩尔比为4%时，PEG6000流感疫苗脂质体具有较好的免疫原性，见表1。

表 1 7 d 时的刺激指数[n = 5，（$ \bar x \pm s $）]

Table 1. SI on 7 d [n = 5，（$ \bar x \pm s $）]

分组	刺激指数SI值	F	P
PEG6000占磷脂的百分摩尔比 2%	1.3317 ± 0.0364^△#	119.404	< 0.001^*
PEG6000占磷脂的百分摩尔比4%	1.5943 ± 0.0184^△
PEG6000占磷脂的百分摩尔比 6%	1.4141 ± 0.0257^△##
PBS 阴性对照组	1.0458 ± 0.8870^##
中性脂质体	1.3307 ± 0.0946^△##
疫苗原液组	1.2421 ± 0.0459^△##
^*P < 0.05。与PBS阴性对照组比较，^△P < 0.05；与PEG6000占磷脂的百分摩尔比4%比较，^##P < 0.05。

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PBS阴性对照组与其他各组间SI值差异均有统计学意义（P < 0.01）；PEG6000后修饰组SI值与其他各组差异均有统计学意义（P < 0.01），且PEG6000后修饰组的SI值明显高于其余各组，表明 PEG6000后修饰为最佳制备工艺，见表2。

表 2 7 d 时的刺激指数[n = 5，（$ \bar x \pm s $）]

Table 2. SI on 7 d [n = 5，（$ \bar x \pm s $）]

分组	刺激指数SI值	F	P
PEG6000共成膜组	1.2629 ± 0.0350^△##	7.643	< 0.001^*
PEG6000后修饰组	1.3407 ± 0.0210^△
疫苗原液组	1.0808 ± 0.0410^△##
中性脂质体组	1.1647 ± 0.0450^△##
PBS阴性对照组	1.0335 ± 0.0070^##
^*P < 0.05。与PBS阴性对照组比较，^△P < 0.05；与PEG6000后修饰组比较，^##P < 0.05。

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2.2 PEG6000修饰流感疫苗脂质体的稳定性

2.2.1 PEG6000修饰流感疫苗脂质体的物理稳定性

在不同温度[4 ℃、（25±2） ℃、（37±2） ℃]放置，于设定的时间点取样测定PEG6000流感疫苗脂质体冻干粉和混悬液的包封率，可以看出冻干粉包封率明显高于混悬液，见表3。

表 3 PEG6000修饰的流感疫苗脂质体的包封率（%）

Table 3. The encapsulation rate of PEG-modifed influenza vaccine liposome

温度（℃）	时间（月）	PEG6000冻干粉r	PEG6000混悬液
4	0	95.51	62.40
	1	91.17	67.02
	2	86.54	60.35
	6	82.20	28.18
25 ± 2	0	95.69	68.08
	1	95.38	55.16
	2	95.27	42.27
	6	86.54	35.02
37 ± 2	0	97.43	70.86
	1	95.65	65.81
	2	93.12	65.69
	6	83.83	0.14

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2.2.2 PEG6000修饰流感疫苗脂质体生物稳定性研究

（1） PEG6000修饰流感疫苗脂质体免疫小鼠后免疫器官指数。不同温度[4 ℃、（25±2） ℃]中对脂质体冻干粉进行温度加速试验，在不同时间点取样腹腔注射免疫小鼠，疫苗原液始终贮藏于4 ℃。PEG6000脂质体冻干粉与中性脂质体冻干粉的胸腺指数相比具有差异，PEG6000脂质体冻干粉的胸腺指数明显高于中性脂质体，说明PEG6000脂质体冻干粉刺激小鼠免疫器官增大，反应其稳定性较好，见表4。（2）体液免疫。不同温度[4 ℃和（25±2） ℃]条件下对PEG6000脂质体冻干粉和中性脂质体冻干粉进行温度加速试验，疫苗原液始终贮藏于4 ℃，在不同时间点取样腹腔注射免疫小鼠7 d。结果表明PEG6000脂质体冻干粉的抗体滴度比高于中性脂质体， PEG6000脂质体冻干粉抗体滴度低于疫苗原液组但是却始终具有免疫原性（抗体滴度 > 4），表明PEG6000脂质体冻干粉的生物学稳定性较好，时效性较长，见表5。

表 4 PEG修饰的流感疫苗脂质体的胸腺指数（%）

Table 4. The thymus index of PEG-modified influenza vaccine liposome （%）

温度（℃）	时间（月）	PBS	中性脂质体组	PEG6000脂质体组	疫苗原液组
4	1	4.98	6.04	6.14	4.77
	2	4.49	5.69	5.99	5.13
	3	4.22	5.29	5.32	5.07
	6	3.89	4.62	4.90	5.16
25 ± 2	1	4.98	6.04	-	4.77
	2	4.49	5.69	-	5.13
	3	4.22	5.29	5.33	5.06
	6	3.89	4.62	4.85	5.16

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表 5 PEG 修饰的流感疫苗脂质体的抗体滴度比

Table 5. The antibody titer ratio of PEG-modified influenza vaccine liposome

温度（℃）	时间（月）	原液	中性脂质体组	PEG6000脂质体组
4	1	5.78	4.44	4.44
	2	5.54	3.98	4.19
	3	5.71	4.14	4.46
25 ± 2	1	5.78	4.17	4.37
	2	5.54	4.06	4.34
	3	5.71	3.98	4.05
免后免前抗体滴度 > 4表明具有免疫效应。

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3. 讨论

PEG修饰的脂质体已经成为新一代疫苗佐剂和长循环给药系统^[17-19]。状内皮系统细胞可轻松识别和摄取普通脂质体和免疫脂质体，以致药物在到达靶器官前即被清除，导致药效降低，维持时间变短^{[6, 20-21]}。大量临床前研究表明，PEG作为水溶性材料，可以覆盖疏水性结合位点，阻止血浆成分接近进而降低识别和摄取，延长循环时间^[22-25]。经修饰的脂质体在表面形成水化层能减弱与细胞表面配体的相互作用，以减慢磷脂双层膜的溶蚀融合作用，降低药物释放速度，因此，选择PEG修饰以期实现脂质体长循环作用^[26]。

本实验通过筛选PEG6000的用量以及制备工艺，制备出的脂质体冻干粉在不同的温度下放置的各个时间段内，均表现出良好的物理及生物稳定性。已有大量研究围绕着其作为长循环药物载体展开，本实验通过免疫学方法将其作为佐剂研究，考察方法有所不同。只对工艺和稳定性进行考察并不全面，未来仍需对其免疫原性以及安全性方面进行考察，结合各方面，对PEG6000脂质体作为疫苗佐剂进行全面评价。

表 1 7 d 时的刺激指数[n = 5，（$ \bar x \pm s $）]

Table 1. SI on 7 d [n = 5，（$ \bar x \pm s $）]

分组	刺激指数SI值	F	P
PEG6000占磷脂的百分摩尔比 2%	1.3317 ± 0.0364^△#	119.404	< 0.001^*
PEG6000占磷脂的百分摩尔比4%	1.5943 ± 0.0184^△
PEG6000占磷脂的百分摩尔比 6%	1.4141 ± 0.0257^△##
PBS 阴性对照组	1.0458 ± 0.8870^##
中性脂质体	1.3307 ± 0.0946^△##
疫苗原液组	1.2421 ± 0.0459^△##
^*P < 0.05。与PBS阴性对照组比较，^△P < 0.05；与PEG6000占磷脂的百分摩尔比4%比较，^##P < 0.05。

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表 2 7 d 时的刺激指数[n = 5，（$ \bar x \pm s $）]

Table 2. SI on 7 d [n = 5，（$ \bar x \pm s $）]

分组	刺激指数SI值	F	P
PEG6000共成膜组	1.2629 ± 0.0350^△##	7.643	< 0.001^*
PEG6000后修饰组	1.3407 ± 0.0210^△
疫苗原液组	1.0808 ± 0.0410^△##
中性脂质体组	1.1647 ± 0.0450^△##
PBS阴性对照组	1.0335 ± 0.0070^##
^*P < 0.05。与PBS阴性对照组比较，^△P < 0.05；与PEG6000后修饰组比较，^##P < 0.05。

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表 3 PEG6000修饰的流感疫苗脂质体的包封率（%）

Table 3. The encapsulation rate of PEG-modifed influenza vaccine liposome

温度（℃）	时间（月）	PEG6000冻干粉r	PEG6000混悬液
4	0	95.51	62.40
	1	91.17	67.02
	2	86.54	60.35
	6	82.20	28.18
25 ± 2	0	95.69	68.08
	1	95.38	55.16
	2	95.27	42.27
	6	86.54	35.02
37 ± 2	0	97.43	70.86
	1	95.65	65.81
	2	93.12	65.69
	6	83.83	0.14

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表 4 PEG修饰的流感疫苗脂质体的胸腺指数（%）

Table 4. The thymus index of PEG-modified influenza vaccine liposome （%）

温度（℃）	时间（月）	PBS	中性脂质体组	PEG6000脂质体组	疫苗原液组
4	1	4.98	6.04	6.14	4.77
	2	4.49	5.69	5.99	5.13
	3	4.22	5.29	5.32	5.07
	6	3.89	4.62	4.90	5.16
25 ± 2	1	4.98	6.04	-	4.77
	2	4.49	5.69	-	5.13
	3	4.22	5.29	5.33	5.06
	6	3.89	4.62	4.85	5.16

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表 5 PEG 修饰的流感疫苗脂质体的抗体滴度比

Table 5. The antibody titer ratio of PEG-modified influenza vaccine liposome

温度（℃）	时间（月）	原液	中性脂质体组	PEG6000脂质体组
4	1	5.78	4.44	4.44
	2	5.54	3.98	4.19
	3	5.71	4.14	4.46
25 ± 2	1	5.78	4.17	4.37
	2	5.54	4.06	4.34
	3	5.71	3.98	4.05
免后免前抗体滴度 > 4表明具有免疫效应。

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1. 材料与方法
1.1 材料
1.2 方法
1.3 统计学处理
2. 结果
2.1 PEG6000用量和制备工艺筛选结果
2.2 PEG6000修饰流感疫苗脂质体的稳定性
3. 讨论

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PEG6000修饰的流感疫苗脂质体的制备和稳定性

doi: 10.12259/j.issn.2095-610X.S20220307

作者简介:
李漂（1997～），女，四川雅安人，在读硕士研究生，主要从事颗粒型疫苗佐剂研究工作

通讯作者:
鲁卫东，E-mail：13064244163@163.com

计量

Preparation and Stability of Influenza Vaccine Liposomes Modified by PEG6000

1. 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 流感疫苗

1.1.2 实验动物

1.1.3 主要试剂

1.2 方法

1.2.1 PEG6000用量与处方筛选

1.2.2 PEG6000修饰的流感疫苗脂质体稳定性研究

1.3 统计学处理

2. 结果

2.1 PEG6000用量和制备工艺筛选结果

2.2 PEG6000修饰流感疫苗脂质体的稳定性

2.2.1 PEG6000修饰流感疫苗脂质体的物理稳定性

2.2.2 PEG6000修饰流感疫苗脂质体生物稳定性研究

3. 讨论

计量

目录

1. 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

1.3 统计学处理

2. 结果

2.1 PEG6000用量和制备工艺筛选结果

2.2 PEG6000修饰流感疫苗脂质体的稳定性

3. 讨论

[1]	陶怡婷, 白鸽, 余丹, 周竹, 李淼. 2种方法建立慢性肾衰竭动物模型的对比研究, 昆明医科大学学报. doi: 10.12259/j.issn.2095-610X.S20241204
[2]	李丽萍, 赵洪超, 陈艳芳, 曾涛, 赵惠琼, 李俊. 不同频率强脉冲光治疗对睑板腺功能障碍患者泪膜稳定性及睑板腺功能的影响, 昆明医科大学学报. doi: 10.12259/j.issn.2095-610X.S20220708
[3]	刘晓琳, 谢青昕, 李漂, 张茜, 杨艾, 鲁卫东. 流感疫苗脂质体的制备方法及粒径对免疫原性的影响, 昆明医科大学学报. doi: 10.12259/j.issn.2095-610X.S20220508
[4]	范琪琪, 李恒, 赵鑫, 周健, 郭磊, 秦丽, 刘龙丁. M2e-HA2串联表位的自组装纳米颗粒流感疫苗的构建及血清学检测, 昆明医科大学学报. doi: 10.12259/j.issn.2095-610X.S20210905
[5]	刘艳红, 赵祥月, 谢青昕, 普梦笛, 鲁卫东. DC-Chol阳离子脂质体佐剂对流感疫苗免疫效果的影响, 昆明医科大学学报. doi: 10.12259/j.issn.2095-610X.S20210302
[6]	徐栩, 武力勇, 周明礼, 朱国富. microRNA-146a与冠心病患者斑块稳定性的相关性, 昆明医科大学学报. doi: 10.12259/j.issn.2095-610X.S20201119
[7]	朱文勇, 王明清, 宋绍辉, 李双丽, 胡文著, 廖国阳. 新工艺制备Hib结合疫苗原液长期稳定性试验, 昆明医科大学学报.
[8]	范宇超, 付围, 普梦笛, 赵祥月, 鲁卫东. 不同稀释浓度对狂犬疫苗脂质体免疫原性的影响, 昆明医科大学学报.
[9]	张健, 王楠, 赵养学, 李德成, 白蓉. 两种不同方法治疗股骨粗隆间不稳定性骨折疗效及对髋关节功能的影响, 昆明医科大学学报.
[10]	吴怡, 陈芬清, 李雅静, 喻芳, 潘红梅, 宣群, 张才军, 邹玉松. 滇重楼内生灰黄青霉抑菌产物的热稳定性, 昆明医科大学学报.
[11]	兰萍, 叶红艳, 付围, 范宇超, 赵祥月, 鲁卫东. 狂犬疫苗脂质体稳定性及稀释比例对脂质体干粉的免疫原性, 昆明医科大学学报.
[12]	何燕. 64层双源螺旋CT结合血清学标志物评价老年2型糖尿病合并冠心病患者冠脉斑块的稳定性, 昆明医科大学学报.
[13]	梁正忠. 选择性上颈椎椎弓根内固定治疗外伤性上颈椎不稳定性骨折脱位, 昆明医科大学学报.
[14]	乔建斌. 流感疫苗壳聚糖脂质体的制备工艺, 昆明医科大学学报.
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[20]	梁平. 人参皂苷Rg1脂质体的制备及稳定性研究, 昆明医科大学学报.

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PEG6000修饰的流感疫苗脂质体的制备和稳定性

doi: 10.12259/j.issn.2095-610X.S20220307

作者简介: 李漂（1997～），女，四川雅安人，在读硕士研究生，主要从事颗粒型疫苗佐剂研究工作

通讯作者: 鲁卫东，E-mail：13064244163@163.com

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出版历程

Preparation and Stability of Influenza Vaccine Liposomes Modified by PEG6000

1. 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 流感疫苗

1.1.2 实验动物

1.1.3 主要试剂

1.2 方法

1.2.1 PEG6000用量与处方筛选

1.2.2 PEG6000修饰的流感疫苗脂质体稳定性研究

1.3 统计学处理

2. 结果

2.1 PEG6000用量和制备工艺筛选结果

2.2 PEG6000修饰流感疫苗脂质体的稳定性

2.2.1 PEG6000修饰流感疫苗脂质体的物理稳定性

2.2.2 PEG6000修饰流感疫苗脂质体生物稳定性研究

3. 讨论

计量

出版历程

目录

1. 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

1.3 统计学处理

2. 结果

2.1 PEG6000用量和制备工艺筛选结果

2.2 PEG6000修饰流感疫苗脂质体的稳定性

3. 讨论

作者简介:
李漂（1997～），女，四川雅安人，在读硕士研究生，主要从事颗粒型疫苗佐剂研究工作

通讯作者:
鲁卫东，E-mail：13064244163@163.com