Optimization of Heating Reflux Extraction Process for Qingyangshengenin
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摘要:
目的 考察药用植物青阳参根茎中青阳参苷元的最佳提取工艺。 方法 利用加热回流法提取、HPLC法检测青阳参苷元，在单因素实验基础上，通过正交设计法研究乙醇体积分数、料液比、提取时间对青阳参苷元提取效果的影响。 结果 最佳提取工艺条件为乙醇体积分数70%、料液比1∶15（g/mL）、提取时间2 h，验证得到青阳参苷元提取率可达0.3090%。 结论 经过优化的青阳参苷元加热回流提取工艺有效、稳定、绿色，为进一步开展青阳参苷元药理活性、结构修饰等研究提供基础。 Abstract:Objective To investigate the optimum extraction technology of Qingyangshengenin from the medicinal plant Cynanchum otophyllum Schnei. Methods The reflux method is used to extract and HPLC method is used to detect Qingyangshengenin. On the basis of single factor experimental, orthogonal design method is selected to explore the conditions of ethanol volume fraction, solid-liquid ratio and extraction time on the extraction of Qingyangshengenin. Results The optimal extraction conditions were as follows: ethanol volume fraction 70%, solid-liquid ratio 1∶15（g/mL）, extraction time 2 h, and the extraction rate was up to 0.3090%. Conclusion The optimized heating reflux extraction process was effective, stable and environment-friendly, which provided a foundation for further studies on pharmacological activity and structural modification of Qingyangshengenin. -
Key words:
- Cynanchum otophyllum Schnei /
- Qingyangshengenin /
- Reflux extraction /
- 0rthogonal design.
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青阳参（Cynanchum otophyllum Schnei）属于萝藦科鹅绒藤属植物[1]，广泛的分布于云南、四川、贵州等西南地区，药用部位为干燥根，常用于治疗癫痫、抑郁、创伤后应激障碍等病症，起到中枢镇静作用[2-4]，同时发现其具有抗病毒、细胞毒等潜在药理活性[5-7]。
青阳参包含的化合物大部分是C21甾体苷元与糖基形成的皂苷[7-8]，其中主要甾体苷元之一为青阳参苷元（Qingyangshengenin），见图1[9]。以往文献用青阳参苷元含量来反映青阳参皂苷制剂的质量标准[10-11]，很少针对苷元本身展开药效学或结构修饰等方向的研究。笔者希望通过探索青阳参苷元的提取工艺，大量、稳定地获得该化合物，为开发利用苷元提供物质基础。
青阳参苷元提取的相关报道较少，且所得青阳参苷元提取率不理想[2, 12]。本文用盐酸水解皂苷，乙醇-水作提取溶剂，加热回流法处理材料，弱碱NaHCO3调节供试液酸碱度，HPLC法检测苷元含量。以单因素实验确定乙醇体积分数、料液比、提取时间的水平范围，采取正交设计优化三因素条件，获得了青阳参苷元提取率的最佳加热回流提取工艺。
1. 材料与方法
1.1 实验仪器
Waters e2695型高效液相色谱仪，瑞士BUCHI公司；C-MAG HS7型加热磁力搅拌器，德国IKA公司；STARTER300型pH计，常州奥豪斯仪器有限公司；GR-202型电子分析天平，日本AND公司。
1.2 实验材料
青阳参苷元标准品，上海同田生物技术股份有限公司，批号：P1548443，纯度：HPLC ≥ 98%；青阳参药材，云南千草源药业有限公司，昆明医科大学药学院暨云南省天然药物药理重点实验室陆露研究员鉴定为青阳参（Cynanchumotophyllum Schnei）的干燥根，加工成100目粉末；甲醇、乙腈，韶关高科祥高新材料有限公司，色谱纯；其它试剂为分析纯。
1.3 实验方法
1.3.1 回流法制备青阳参苷元供试液
称取青阳参粉5 g，加入乙醇和盐酸水溶液，以回流温度提取一定时长。取出冷却，用饱和NaHCO3水溶液调节pH = 7，抽滤，滤液用甲醇定容至100 mL，得到青阳参苷元供试液。
1.3.2 青阳参苷元提取率测定
（1）标准品溶液的配制：称取青阳参苷元标准品10 mg，用甲醇定容至10 mL，即得到1 mg/mL的青阳参苷元标准品溶液。（2）色谱条件：Diamonsil C18，4.6×250 mm，5 μm；VWD紫外检测器；乙腈-水梯度洗脱，30%：70%～90%：10%，流速1 mL/min；柱温 25 ℃；进样量10 μL；检测波长259 nm。（3）标准曲线的绘制：用甲醇稀释青阳参苷元标准品溶液至0.001、0.025、0.050、0.125、0.250、0.500、1.000 mg/mL的浓度，按色谱条件测定。峰面积Y为纵坐标，质量浓度ρ （mg/mL） 为横坐标，得回归方程Y = 17174520ρ−68757，R2 = 0.9999，n = 7。青阳参苷元含量在0.001～1.000 mg/mL与峰面积呈良好线性关系。（4）精密度实验：将青阳参苷元标准品溶液按色谱条件连续测定6次，峰面积RSD = 1.00%，说明进样精密度良好。（5）重复性实验：将青阳参苷元标准品溶液按色谱条件连续测定6次，峰面积RSD = 1.30%，说明方法重复性良好。（6）稳定性实验：将青阳参苷元供试液按色谱条件24 h内每隔3 h测定1次，峰面积RSD = 1.40%，说明供试品溶液24 h内稳定。（7）样品测定：将青阳参苷元供试液和标准品溶液按色谱条件分别进样，以峰面积按外标法测定含量，计算青阳参苷元的提取率。
1.3.3 盐酸浓度检测方法
称取青阳参粉5 g，以乙醇体积分数50%、料液比1∶10（g/mL）、提取时间2 h和回流温度为基础，研究提取溶液的盐酸浓度达到0.10、0.12、0.14、0.16、0.18、0.20 mol/L对供试液中青阳参苷元含量的影响。
1.3.4 单因素实验方法
称取青阳参粉5 g，以最佳盐酸浓度、回流温度为基础，分别研究乙醇体积分数、料液比和提取时间3个单因素对供试液中青阳参苷元含量的影响。
1.3.5 正交实验方法
在单因素实验基础上，以乙醇体积分数、料液比和提取时间为对象，采用L9（34）正交设计表安排优化实验研究青阳参苷元提取工艺。
1.4 统计学处理
制图使用Origin8.0软件。利用Excel 2010和SPSSAU系统对实验数据进行整理、分析，P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 盐酸浓度对提取率的影响
提取溶液的盐酸浓度达到0.16 mol/L时青阳参苷元提取率最高，因此后续实验的盐酸浓度都固定在0.16 mol/L，见表1。
表 1 盐酸浓度对青阳参苷元提取率的影响Table 1. Effect of Hydrochloric acid concentrationon extraction rate of Qingyangshengenin序号 盐酸浓度（mol/L） 青阳参苷元提取率（%） 1 0.10 0.2144 2 0.12 0.2209 3 0.14 0.2239 4 0.16 0.2404 5 0.18 0.2237 6 0.20 0.2323 2.2 单因素实验结果
2.2.1 乙醇体积分数
固定料液比1∶ 10（g/mL）、提取时间2 h，选取考察的乙醇体积分数为10、30、50、70、90%，测定青阳参苷元提取率。随乙醇体积分数增加，提取率升高后降低，乙醇体积分数为70%时提取率达到峰值，见图2。
图 2 乙醇体积分数对青阳参苷元提取率的影响Figure 2. Effect of ethanol volume fraction on extraction rate of Qingyangshengenin2.2.2 料液比
固定乙醇体积分数70%、提取时间2 h，选取考察的料液比为1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g/mL），测定青阳参苷元提取率。随料液比增加，提取率升高后显著下降，料液比为1∶10（g/mL）时提取率达到峰值，见图3。
图 3 料液比对青阳参苷元提取率的影响Figure 3. Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of Qingyangshengenin2.2.3 提取时间
固定乙醇体积分数70%、料液比1∶10（g/mL），选取考察的提取时间为1、2、3、4、5 h，测定青阳参苷元提取率。随提取时间增加，提取率升高后下降并逐渐平稳，提取时间为2 h时提取率达到峰值，见图4。
2.3 正交设计实验结果
2.3.1 结果与分析
根据单因素实验结果确定了乙醇体积分数、料液比和提取时间的因素水平，利用L9（34）正交设计表进行优化实验，得到各条件下的提取率结果，见表2、表3。
表 2 因素水平表Table 2. The table of factor and level因素 X-乙醇体积分数（%） Y-料液比（g/mL） Z-提取时间（h） 1 50 1∶15 1 2 70 1∶10 2 3 90 1∶5 3 表 3 不同提取条件下青阳参苷元的提取率Table 3. The extraction rate of Qingyangshengenin under various extraction conditions实验序号 因素 提取率（%） X-乙醇体积分数（%） Y-料液比（g/mL） Z-提取时间（h） 1 1 1 1 0.2828 2 1 2 2 0.2809 3 1 3 3 0.2631 4 2 1 2 0.3041 5 2 2 3 0.3017 6 2 3 1 0.2839 7 3 1 3 0.2956 8 3 2 1 0.2944 9 3 3 2 0.2870 ${\rm{ \overline K1}}$ 0.2756 0.2941 0.2870 ${\rm{ \overline K2}} $ 0.2965 0.2923 0.2906 ${\rm{ \overline K3}} $ 0.2923 0.2780 0.2868 $R $ 0.0210 0.0162 0.0039 从表3、表4的极差分析与方差分析可看出，提取青阳参苷元的最佳工艺条件组合为X2Y1Z2，即乙醇体积分数70%、料液比1∶ 15（g/mL）、提取时间2 h。影响因素水平依次是：X > Y > Z，即乙醇体积分数 > 料液比 > 提取时间。乙醇体积分数对青阳参苷元提取影响尤为显著（P < 0.05)，其次是料液比，提取时间影响不明显。
表 4 方差分析结果Table 4. The result of variance analysis方差来源 离差平方和 自由度 均方 F P X 0.0738 2 0.0369 29.8111 0.0325* Y 0.0470 2 0.0235 19.0043 0.0500 Z 0.0028 2 0.0014 1.1401 0.4673 误差 0.0025 2 0.0012 *P < 0.05。 2.3.2 验证实验
称取青阳参粉5 g，按提取溶液的盐酸浓度0.16 mol/L以及正交实验优选提取方案（X2Y1Z2）进行验证性实验，经过3次重复，青阳参苷元提取率平均值为0.3090%，RSD值为0.1319%。
3. 讨论
青阳参作为云南民间习用药，已被开发为分散片和复方口服制剂[13-14]，临床用来治疗癫痫、肝炎等症。近年来又发现其能诱导HepG2细胞凋亡，阻滞细胞周期在G0/G1期[15]，对人结肠癌细胞HCT-116也有选择性杀伤作用[16]，说明青阳参具备广泛的抗肿瘤应用前景。青阳参苷元是青阳参的主要成分。本文运用加热回流法提取、HPLC法检测，经过单因素实验和正交设计辅助优化，获得了加热回流提取青阳参苷元的最佳条件，即提取溶液的盐酸浓度0.16 mol/L、乙醇体积分数70%、料液比1∶15（g/mL）、提取时间2 h，青阳参苷元提取率达到0.3090%，为后续开展青阳参苷元药理活性、作用机制和结构修饰等研究奠定基础。本工艺优势在于，方法经典、普及性强，操作简便，成本低廉。传统的酸水解提取液常以NaOH中和pH值，可能导致青阳参苷元成盐，改用弱碱NaHCO3调节酸度既避免了产物损失，同时无毒无害、绿色环保。优化后的青阳参苷元加热回流提取工艺，对青阳参的进一步药用开发具有重要意义。
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图 2 乙醇体积分数对青阳参苷元提取率的影响
Figure 2. Effect of ethanol volume fraction on extraction rate of Qingyangshengenin
图 3 料液比对青阳参苷元提取率的影响
Figure 3. Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of Qingyangshengenin
表 1 盐酸浓度对青阳参苷元提取率的影响
Table 1. Effect of Hydrochloric acid concentrationon extraction rate of Qingyangshengenin
序号 盐酸浓度（mol/L） 青阳参苷元提取率（%） 1 0.10 0.2144 2 0.12 0.2209 3 0.14 0.2239 4 0.16 0.2404 5 0.18 0.2237 6 0.20 0.2323 
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表 2 因素水平表
Table 2. The table of factor and level
因素 X-乙醇体积分数（%） Y-料液比（g/mL） Z-提取时间（h） 1 50 1∶15 1 2 70 1∶10 2 3 90 1∶5 3
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表 3 不同提取条件下青阳参苷元的提取率
Table 3. The extraction rate of Qingyangshengenin under various extraction conditions
实验序号 因素 提取率（%） X-乙醇体积分数（%） Y-料液比（g/mL） Z-提取时间（h） 1 1 1 1 0.2828 2 1 2 2 0.2809 3 1 3 3 0.2631 4 2 1 2 0.3041 5 2 2 3 0.3017 6 2 3 1 0.2839 7 3 1 3 0.2956 8 3 2 1 0.2944 9 3 3 2 0.2870 ${\rm{ \overline K1}}$ 0.2756 0.2941 0.2870 ${\rm{ \overline K2}} $ 0.2965 0.2923 0.2906 ${\rm{ \overline K3}} $ 0.2923 0.2780 0.2868 $R $ 0.0210 0.0162 0.0039
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表 4 方差分析结果
Table 4. The result of variance analysis
方差来源 离差平方和 自由度 均方 F P X 0.0738 2 0.0369 29.8111 0.0325* Y 0.0470 2 0.0235 19.0043 0.0500 Z 0.0028 2 0.0014 1.1401 0.4673 误差 0.0025 2 0.0012 *P < 0.05。
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