The Genetic Characteristic Analysis of the VP1 Gene of Coxsackievirus A6 in Qujing Prefecture of Yunnan Province in 2020
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摘要:
目的 对2020年云南省曲靖地区手足口病（hand,foot and mouth disease, HFMD）病例中的柯萨奇病毒A组6型（Coxsackievirus A6, CV-A6）VP1区基因特征进行分析。 方法 （1）直接从HFMD病例粪便标本中提取人类肠道病毒（human enteroviruses，EVs）RNA，先用MD91/OL68-1引物对病毒VP4/VP2结合区基因进行逆转录-聚合酶链反应（Reverse-Transcription Polymerase Chian Reaction, RT-PCR）和测序，确定病毒型别，再用各型病毒的相关引物扩增VP1区全序并测序，按测序定型标准对EVs进行VP1区定型；（2）按文献下载基因库中CV-A6病毒VP1区基因参考序列，用MEGA 5.2软件构建系统进化树，进行基因特征和分子流行病学分析。 结果 2020年共从曲靖地区HFMD 病例500份标本中检测到49株EVs，EVs阳性率为9.80%（49/500）。49株EVs中，A组病毒（enterovirus species A，EV-A） 48份，占阳性总数的97.96%（48/49），B组病毒（enterovirus species B，EV-B）1份，占2.04%（1/49）。A组病毒共4个血清型，其中CV-A4 3株，占6.12%（3/49）；CV-A6 36株，占73.47%（36/49）；CV-A10 5株，占10.20%（5/49）；CV-A16 4株，占8.16%（4/49）。B组病毒只检测到1株，一个血清型（CV-B4）。用MEGA 5.2软件对36株CV-A6病毒的VP1基因完整序列（915bp）和Yang Song、Mizuta K等发表的26株参考株序列共62株病毒作基因进化分析，曲靖地区36株均为D3a亚型。 结论 2020年云南省曲靖地区HFMD流行以CV-A6（占73.47%）为主。基因进化分析表明，跟以往中国内地的情况一样，云南省曲靖地区2020年流行的CV-A6为D3a基因亚型，加强CV-A6病毒的实验室和分子流行病学监测是今后曲靖地区乃至云南省HFMD监测的重要工作。 Abstract:Objective To analyze the genetic characteristics of the VP1 gene of coxsackievirus A6 （CV-A6） from hand, foot and mouth disease （HFMD） cases collected from Qujing prefecture in 2020. Methods （1） Virus RNA was directly abstracted from stool samples of HFMD cases and virus VP4/VP2 junction region sequence was firstly amplified and sequenced by MD91 and OL68-1 primer pairs, then the virus serotype was determined. The virus entire VP1 gene sequences were determined by relative primer pairs according to the references. （2） The reference sequences of CV-A6 virus entire VP1 gene were downloaded from the GenBank and the phylogenetic tree was constructed and the genetic characteristics and molecular epidemiology were analyzed. Results In 2020, a total of 49 strains of enteroviruses （EVs） were identified with a positive rate of 9.80% （49/500）. Among 49 EVs strains, 48 were enterovirus species A （EV-A）, accounting for 97.96% （48/49）, 1 was enterovirus species B （EV-B）, accounting for 2.04% （1/49）. A total of 4 serotypes were identified from EV-A, among which, 3 were CV-A4, accounting for 6.12% （3/49）; 36 were CV-A6, accounting for 73.47% （36/49）; 5 were CV-A10, accounting for 10.20% （5/49） and 4 were CV-A16, accounting for 8.16% （4/49）. Only one strain of EV-B viruses was identified （coxsackievirus B4, CV-B4）, accounting for 2.04% （1/49）. The phylogenetic characteristics of the entire VP1 gene sequences of 36 strains of CV-A6 identified in this study and 26 reference strains published by Yang Song and Mizuta K were analyzed by MEGA software 5.2. The results showed that all 36 Qujing strains belonged to D3a sub-genotype. Conclusion The outbreaks of HFMD in Qujing prefecture in 2020 are mainly caused by CV-A6, accounting for 73.47%. Phylogenetic analysis shows that, similar to the situation in Mainland of China during the past years, the sub-genotype D3a of CV-A6 is the predominant virus in this outbreak. Strengthening the laboratory and molecular epidemiological surveillance is the important work in Qujing prefecture and even in the whole Yunnan province in the future. -
Key words:
- Hand foot and mouth disease （HFMD） /
- Pathogen /
- Coxsackievirus A6 /
- VP1 gene /
- Genetic analysis
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胆石症为肝胆外科的常见疾病，其产生可能与饮食习惯、胆汁代谢异常、妊娠、解剖变异等多种因素有关[1]。其中发生在肝门部胆管汇合部以下的结石称为肝外胆管结石，肝外胆管结石又分为原发性与继发性胆总管结石，临床上以继发性胆总管结石常见，为胆囊内结石落入胆管形成。多数胆石症患者无症状，但10%～25%的患者可能发展为疼痛，胆道梗阻以及继发胆道感染等相关症状，需采用及时，恰当的方法处理。目前临床上对于胆总管未扩张的胆囊结石合并胆总管结石的患者，行内镜与腹腔镜联合探查取石术，而对于胆总管扩张的患者目前共识为行腹腔镜-胆道镜联合探查取石术联合胆囊切除术，术后留置T管或一期缝合[2]。但留置T管存在诸多不便，例如长期带管的生理性不适，T管非计划脱出以及T管相关并发症等，而胆道探查术后一期缝合围术期最担心的并发症为术后胆瘘。本中心为了解决扩张性胆总管结石患者胆道探查术后长期留置T管以及单纯一期缝合后胆漏的问题，创新性采用胆道探查术后放置鼻胆管的手术方式，并取得了较好的治疗效果，现收集相关病例并报道如下。
1. 资料与方法
1.1 一般资料
收集昆明医科大学第二附属医院自2019年12月至2021年10月收治的胆囊结石合并扩张性胆总管结石（胆总管直径≥0.8 cm）患者81例，其中A组行三镜联合腹腔镜下胆囊切除术（LC） + 腹腔镜 - 胆道镜联合探查取石术（LCBDE） + 内镜下鼻胆管引流术（ENBD） + 胆总管一期缝合术（PS）（n = 40），其中男16例，女24例，年龄（54.10±15.03）岁；B组行腹腔镜下胆囊切除术（LC）+腹腔镜-胆道镜联合探查取石术（LCBDE） + 胆总管一期缝合术（PS）（n = 41），其中男16例，女25例，年龄（52.78±15.79）岁。2组年龄、性别经卡方及t检验比较差异无统计学意义（P > 0.05），可以进行组间比较。本研究经昆明医科大学第二附属医院医学伦理委员会审核通过（审-PJ-2021-211）。
1.2 纳入及排除标准
1.2.1 纳入标准
（1）患者术前完善B超，MRCP检查，明确诊断为胆囊结石合并扩张性胆总管结石患者（直径≥0.8 cm）；（2）患者既往无腹部手术史，外伤史；（3）病例资料完整[3]。
1.2.2 排除标准
（1）既往曾行腹部手术；（2）术前检查检验提示胆道系统存在急性炎症（急性梗阻性胆管炎，胆源性胰腺炎等）；（3）术前存在心肺功能不全或其他疾病不能耐受手术；（4）病例资料不完整。
1.3 手术方法
1.3.1 A组序贯行LC+LCBDE+ENBD+PS（三镜联合术式）
常规“三孔法”行腹腔镜下胆囊切除术，分离暴露胆总管，锐性纵行切开胆总管前壁，置入胆道镜行胆道镜直视下胆道探查取石术。取石完毕后，于胆道镜直视下将4F输尿管导管送入十二指肠（图1A，1B），后将输尿管导管尾端与鼻胆管缝合固定，台下消化内镜医师经消化内镜在十二指肠找到被送入的输尿管导管端（图1C），通过内镜下使用抓钳抓紧（图1D），将输尿管导管以及鼻胆管经鼻引出，固定。之后腹腔镜下将留置腹腔内的鼻胆管端置入胆总管内，可吸收缝线连续缝合胆总管（图1E），缝合完毕后通过胆汁注水试验验证有无胆漏（图1F），温室孔以及胆总管一期缝合处各留置腹腔引流管一根后关腹。术后第2天间断夹闭鼻胆管以观察有无胆漏，若无胆漏则术后第5～7天拔除鼻胆管。
图 1 同步三镜手术示意图A：胆道镜直视下置入输尿管导管；B：置入胆道内的输尿管导管；C：全麻下置入内镜；D：内镜下使用抓钳抓紧被送入十二指肠内的输尿管导管；E：胆总管一期缝合；F：缝合完毕，注水试验提示胆漏。Figure 1. Schematic diagram of synchronous trioscopic surgery1.3.2 B组序贯行LC+LCBDE+PS（双镜联合术式，不放置鼻胆管）
常规“三孔法”切除胆囊后，分离暴露胆总管，锐性切开胆总管前壁，置入胆道镜行胆道镜直视下胆道探查取石术，并探查确认oddi括约肌功能良好。反复探查确认无结石残余后，可吸收缝线连续缝合胆总管，温氏孔及胆管缝合前各留置腹腔引流管一根于腹壁引出，固定。
1.4 观察指标
（1）术前指标，包括胆管直径，结石大小；（2）术中指标，包括手术时间及出血量；（3）术后指标：术后近期并发症严重程度，包括胰腺炎，胆管炎，胆漏及残石率等；远期并发症严重程度，包括结石再发等，各组患者均进行了门诊或电话随访，并要求患者当地医院复查，检查项目包括彩超，MRCP等，但因本研究中疾病为良性疾病，部分患者拒绝行相应检查而仅为患者主观感受。各组术后通过近远期并发症情况采用下列方法：术后近期并发症指术后1月内出现的并发症，描述采用Clavien-Dindo分级[4]：Ⅰ级常见并发症止痛等对症治疗； Ⅱ级需要Ⅰ级以外的药物治疗 ；Ⅲ级需要手术内镜放射干预；Ⅳ级危及生命的并发症需ICU处理；远期并发症指术后1月后出现的并发症，描述采用Terblanche分级[5]：Ⅰ级无胆道相关症状，Ⅱ级偶有胆道相关症状，无需治疗，Ⅲ级有明显胆道相关症状，需要治疗。近远期并发症主要比较Ⅲ级以上并发症发生率；（4）经济学指标：总住院日及术后住院日。
1.5 统计学处理
统计学分析使用SPSS26.0软件进行，计量资料符合正态分布以
$\bar x \pm s $ 表示，组间比较采用独立样本t检验，偏态分布则用中位数±四分位数间距表示，比较采用秩和检验。计数资料以率表示，组间比较采用Pearson Chi-Square检验及Fisher精确检验。P < 0.05认为差异有统计学意义。2. 结果
2.1 术前指标
B组平均胆管直径大于A组，差异有统计学意义（P < 0.05），见表1。
表 1 2组患者一般资料比较[$\bar x \pm s $ /M（P25，P75）]Table 1. Comparison of general conditions between two groups of patients [$\bar x \pm s $ /M（P25，P75）]项目 A组（n = 40） B组（n = 41） t/z P 年龄（岁） 54.10 ± 15.03 52.78 ± 15.79 0.385 0.701 男/女 16/24 16/25 0.008 0.928 胆管直径（mm） 9.35 ± 2.723 12.46 ± 3.57 −4.404 < 0.001* 结石大小（mm） 5.65 ± 3.04 6.02 ± 2.87 −0.570 0.570 手术时间（min） 180（148.5，180） 120（110，150） −3.654 < 0.001* 出血量（mL） 30（20，65） 50（20，50） −0.203 0.840 *P < 0.05。 2.2 术中指标
B组手术时间短于A组，这是因为A组额外进行了鼻胆管的放置，出血量2组间比较差异无统计学意义（P > 0.05），见表1。
2.3 术后并发症及残石率情况比较
A组中，近期Ⅱ级并发症6例表现为胆道感染，Ⅲ级并发症中1例为术后黄疸不减退，行鼻胆管造影后发现残石，予以内镜下取石后出院，1例为术后鼻胆管脱出后胆漏，内镜下重新放置鼻胆管，胆漏愈合后拔管出院；B组中近期Ⅱ级并发症表现为2例为胆道感染，Ⅲ级并发症中1例为胆道出血，行鼻胆管造影提示胆总管残石，内镜下止血及取石治疗后治愈出院，3例为一过性胆漏，加强营养后胆漏愈合出院，4例表现为胆漏不愈合，内镜放置鼻胆管待胆漏愈合后出院。近期Ⅲ级并发症发生率A组较B组低，差异有统计学意义（P < 0.05）。
远期并发症方面，A组2例为胆汁反流性胆管炎（Ⅱ级），1例为结石再发（Ⅲ级）；B组Ⅱ级并发症中1例表现为轻症胰腺炎，3例为偶发胆管炎，Ⅲ级并发症2例为结石再发，予以内镜手术取石。远期Ⅲ级并发症发生率差异无统计学意义（P > 0.05），见表2。
2.4 总住院日，术后住院日比较
A组中鼻胆管拔除时间平均为（5.77±1.90） d（均为出院后在门诊随访拔除鼻胆管），2组总住院日，术后住院日比较差异无统计学意义（P > 0.05），见表3。
表 2 术后近远期并发症情况 [n（%）]Table 2. Postoperative short-term and long-term complications [n（%）]并发症 A组（n = 40） B组（n = 41） χ2 P 术后并发症（Ⅲ级以上） 近期 2（5.0） 8（19.5） 3.940 0.047* 远期 1（2.5） 2（4.9） 0.321 0.571 残石率 1（2.5） 1（2.4） 0.000 0.986 *P < 0.05。 表 3 2组经济学指标比较[M（P25，P75）]Table 3. Comparison of economic indicators between the two groups [M（P25，P75）]项目 A组（n = 40） B组（n = 41） t/z P 术后住院时间（d） 5.5（4，7） 4（3，6） −1.477 0.140 总住院时间（d） 12（8.25，17） 10（10，14.5） −1.986 0.057 3. 讨论
胆石症为胆道外科的常见病，多发病，目前肝外胆管结石的治疗主要通过微创手段进行。胆囊结石的金标准为胆囊切除术，若合并胆总管结石，则需根据胆管扩张程度不同，合理选用消化内镜，腹腔镜及十二指肠镜联合治疗[6]。对于扩张性胆总管结石（胆总管直径≥0.8 cm）患者，目前广泛认可的术式为腹腔镜-胆道镜联合探查取石术，该术式可在胆道镜直视下观察胆管内结石数量，大小，胆管有无变异狭窄等，避免了盲目取石，而常规胆道探查术后需留置T管，目的在于：（1）便于术后直接经T管窦道造影明确有无结石残余，若有残石或复发则可经T管窦道取石；（2）防止胆囊切除术后胆道压力一过性增高所导致的胆漏出现。但T管留置易导致体液大量丢失，进一步导致水，电解质平衡紊乱等[7]，且术后常规留置2～3个月T管，导致患者的生活质量下降以及存在如非计划T管脱出，T管周围感染，结石再发等多种T管相关性并发症[8-9]，严重者需再行手术治疗，增加了患者的痛苦及住院费用[10]，Gurusamy KS等[11]发表的一篇荟萃分析表示，胆道探查术后常规留置T管引流获益不高，胆道探查后行T管引流术可能会增加手术时间及住院时间，CBDE后常规放置T管是不合理的，除非存在胆管远端梗阻需行胆总管减压。
为了避免留置T管所导致的不良影响，越来越多的中心在胆道探查术后采用胆管一期缝合技术[12]，而一期缝合最担心的莫过于术后残石与术后胆漏[13]。随着胆道镜技术的成熟以及检查技术的不断进步，术前明确胆道系统内结石数量、大小，术中通过胆道镜直视下取石可以尽量避免残余结石的发生[7]；而一期缝合后胆漏的发生笔者为与无T管注水回抽实验有一定关系。本研究中三镜组（A组）为了防止一期缝合后胆道压力一过性增高，采用胆道探查术后留置鼻胆管方式进行常规胆管减压，与常规通过十二指肠镜逆行插管置入鼻胆管方式不同，4F规格大小的输尿管导管更细，更容易通过Oddi括约肌且能尽量避免对Oddi括约肌的刺激，因此笔者采用将鼻胆管与4F规格输尿管导管缝合，胆道镜直视下将输尿管导管送过Oddi括约肌，随后“逆行”通过消化内镜将输尿管导管经口引出，将鼻胆管固定，待一期缝合完毕后，通过鼻胆管注水实验术中验证是否有胆漏，达到降低术后胆漏发生率的目的。通过表2可知，术后近期III级并发症（胆漏、残石）发生率相比，A组（5%）明显低于B组（19.5%），但远期并发症及残石率并未增加，也验证了这一点。
同步三镜手术无需经十二指肠逆行插管，避免了过度刺激oddi括约肌或插管入胰管而造成的内镜相关胰腺炎的发生[14-15]，术后第1天患者即可进食流质饮食，间断夹闭鼻胆管，1 d后无不适即可完全夹闭鼻胆管，同时观察腹腔引流管情况，有无胆漏等，若出现胆漏则加强营养，继续保证鼻胆管的通畅引流，待胆漏愈合后夹闭鼻胆管，同步三镜联合组（A组）术后平均住院日为（5.95±3.76） d，实际上术后2～3 d患者完全夹闭鼻胆管后一般情况良好情况下便可出院，待留置鼻胆管1周后至门诊随访拔除即可。
本研究中术者皆为腔镜经验丰富的外科医生团队，且严格掌握该术式的前提条件，包括：（1）术前联合术中确认胆管无狭窄，无急性炎症；（2）Oddi括约肌功能良好。本中心针对LC+LD+PS+ENBD术式（同步三镜联合术式）积累了以下经验：（1）术中将输尿管导管与鼻胆管平行缝合固定后，胆道镜直视下将输尿管导管端送入十二指肠，因输尿管导管端更细，更易送过Oddi括约肌；（2）通过胆道镜直视下确认Oddi括约肌功能良好，若术中导管不能通过Oddi括约肌，则不排外胆胰管汇合异常可能，建议改行T管引流术；（3）取石完毕后使用倒刺线连续缝合胆总管可减少术后胆漏发生率，且较留置T管的缝合更为简便，安全性更高；（4）鼻胆管放置完毕，胆道缝合后，可通过鼻胆管注水试验确认胆漏与否，降低术后胆漏发生几率；（5）当胆管扩张 > 20 mm时，需考虑是否有胆管囊性扩张和（或）先天性胆胰管发育异常可能，此时应考虑胆管病损切除+胆肠吻合术式。
本研究中2组手术时间相比较，A组较B组耗时长，一方面因为胆道探查术后增加了放置鼻胆管步骤，另一方面，本研究中内镜医师与腔镜医师为同一人，也增加了手术时长，故三镜联合技术在临床应用过程中，需建立相应医疗团队，团队成员应包括麻醉医生，内镜及腔镜医师，消化内科医师等，来保证手术顺利进行。配合熟练的医疗团队可缩短手术时间，减少术后并发症的发生，同时有更好的手术疗效[16]。
综上，三镜联合一期缝合技术在胆管扩张胆石症患者中的应用，能减轻胆管一期缝合技术中胆漏的发生率，减少患者带管时长，同时并未增加近远期并发症发生率，患者获益度高，依从性强，值得临床推广使用。
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图 1 2020年曲靖地区CV-A6的基因进化树（●和大三角：曲靖地区分离株）
Figure 1. The phylogenetic tree of CV-A6，Qujing prefecture，2020 （● and big triangle: Qujing isolates）
表 1 云南省曲靖地区2020年500份标本中HFMD病原分离率（%）
Table 1. Etiological isolation rates from 500 samples of HFMD patients，Qujing prefecture，Yunnan province，2020 （%）
病毒组别 病毒型别 分离数 分离率 EV-A CV-A4 3 6.12 CV-A6 36 73.47 CV-A10 5 10.2 CV-A16 4 8.16 EV-B CV-B4 1 2.04 
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表 2 2019～2020年曲靖地区HFMD病原检测比较n（%）
Table 2. Pathogen detection from HFMD patients，Qujing prefecture，2019～2020 n（%）
病毒组别 病毒型别 2019年 2020年 EV-A CV-A4 1（1.61） 3（6.12） CV-A6 8（12.90） 36（73.47） CV-A10 21（33.87） 5（10.20） CV-A16 12（19.35） 4（8.16） EV-B CV-B4 − 1（2.04） E11 3（4.84） − E12 3（4.84） − E14 1（1.61） − E30 2（3.22） − EV-C PV1 11（17.74） − 注：“−”表示无。
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