Effect of Hematopoietic Function Recovery and MRD Status after Induction Chemotherapy on the Prognosis of Patients with Newly Diagnosed Acute Myeloid Leukemia
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摘要:
目的 探讨诱导化疗后造血功能的恢复情况和MRD状态在对AML预后的影响。 方法 回顾性分析2017年1月至2020年12月昆明医科大学第二附属医院血液内科初诊的100例急性髓系白血病患者的临床资料。对比分析了形态学完全缓解时外周血血细胞计数完全恢复组(CR)与未完全恢复组(CRi or CRp)患者临床特征的差异性及2组患者OS和EFS的差异;及其对比分析了诱导治疗后第28天血小板完全恢复组(PLT≥300×109/L)与未完全恢复组(PLT < 300×109/L)2组患者OS和EFS的差异。采用Cox回归分析影响预后的危险因素。采用独立样本t检验和Pearson卡方检验或Mann-Whitney检验评估各种参数的差异性,Kaplan-Meier法及Cox回归进行生存分析。 结果 中位随访时间为1.6(0.9,2.6)a,CR组与CRp or CRi组组间比较显示:2组患者在形态学缓解时MRD状态、预后基因(NPM1、FLT3-ITD、C-KIT、CEBPA)、预后存在统计学差异(P < 0.05);形态学缓解时外周血细胞计数恢复不完全的AML患者预示着更差的结局,其中未完全恢复组(CRi or CRp)组与完全恢复组(CR)比较,总体生存时间(OS)明显缩短(3.2 a VS 1.8 a,P = 0.016);和无进展生存期(EFS)也明显缩短(未达到 VS 1.2 a,P = 0.041)。诱导治疗第28天血小板未完全恢复组(PLT < 300×109/L)与血小板计数完全恢复组(PLT≥300×109/L)相比,总体生存时间(OS)明显缩短(5.2 a VS 2.5 a,P = 0.001);EFS也缩短(3.2 a VS 2.7 a,P = 0.237)。Cox回归分析显示:第28天血小板恢复情况、形态学缓解时MRD状态是影响AML患者预后的独立危险因素。 结论 对于初诊的AML患者,诱导化疗后的造血功能再生,特别是血小板的恢复,是AML患者预后的重要预测因子。尽管造血功能恢复情况与MRD状态是相关的,但2者都是AML患者复发、OS和EFS的独立预后因素。 Abstract:Objective To investigate the recovery of hematopoietic function after the induction chemotherapy and the effect of MRD status on the prognosis of AML by analyzing retrospectively the clinical data of 100 newly diagnosed AML patients. Methods The clinical data of 100 patients with acute myeloid leukemia initially diagnosed in the Department of Hematology of the Second Affiliated Hospital of Kunming Medical University from January 2017 to March 2021 were retrospectively analyzed. The differences of clinical characteristics between complete recovery group (CR) and incomplete recovery group (CRi or CRp) and the differences of OS and EFS between the two groups were compared and analyzed. Cox regression was used to analyze the risk factors affecting the prognosis. The difference of OS and EFS between the platelet complete recovery group (PLT ≥ 300×109 / L) and the incomplete recovery group (PLT < 300×109 / L) on the 28th day after the induction treatment was compared and analyzed. The differences of various parameters were evaluated by independent sample t-test, Pearson chi-square test or Mann-Whitney test. Kaplan-Meier method and Cox regression were used for survival analysis. Results The median follow-up time was 1.6 (0.9, 2.6) a. The comparison between CR group and CRp or CRi group showed that there were significant differences in MRD status, prognostic genes (NPM1, FLT3-ITD, C-KIT, CEBPA) and prognosis between the two groups (P < 0.05); AML patients with incomplete recovery of peripheral blood cell count during the morphological remission predicted worse outcomes. The overall survival time (OS) in the incomplete recovery group (CRi or CRp) was significantly shorter than that in the complete recovery group (CR) (3.2 a VS 1.8 a, P = 0.016); And the progression free survival (EFS) was also significantly shortened (less than 1.2 a, P = 0.041). On the 28th day of the induction treatment, the overall survival (OS) of incomplete platelet recovery group (PLT < 300×109 / L) was significantly shorter than that of complete platelet recovery group (PLT ≥ 300 ×109 / L) (5.2 a vs 2.5 a, P = 0.001); EFS was also shortened (3.2 a VS 2.7 a, P = 0.237). Cox regression analysis showed that platelet recovery on day 28 and MRD status in morphological remission were independent risk factors affecting the prognosis of AML patients. Conclusion For newly diagnosed AML patients, hematopoietic regeneration after the induction chemotherapy, especially the recovery of platelets, is an important predictor of the prognosis of AML patients. Although hematopoietic recovery and MRD status are related, both are independent prognostic factors for recurrence, OS and EFS in patients with AML. -
Key words:
- Acute myeloid leukemia /
- Hematopoietic function recovery /
- Platelets on day 28 /
- MRD status /
- Prognosis
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心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia-reperfusion injury,MIRI)是心肌冠状动脉闭塞后,当血流恢复时再灌注可能导致比缺血本身更严重的心肌损伤,包括缺血损伤和再灌注损伤[1]。在心肌缺血再灌注时还会伴随着大量炎性因子的释放,当血流再灌注时随着血液循环可对未受累心肌细胞造成损伤,也可加重受累心肌细胞的损伤,常常导致严重的不良后果,如心力衰竭、心律失常,甚至心脏骤停[2]。
microRNAs(miRNAs)是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA,可与多个靶信使 RNA(mRNA) 结合进而调节靶基因的表达,近来有研究显示miRNAs在心肌缺血再灌注损伤中起着重要的调控作用,表明miRNAs参与了心肌缺血再灌注损伤过程[3]。miR-208a是一种心肌特异性miRNA,由α-心肌肌球蛋白重链基因(Myh6)的内含子编码,可以参与多种心脏疾病的发生和发展。在大鼠缺血再灌注损伤模型中发现上调miR-208a可引起心肌细胞凋亡增加,沉默miR-208a可以减轻心肌细胞凋亡和心脏功能障碍[4]。
RNA结合蛋白(QKI)属于信号转导与RNA活化蛋白家族(signal transduction and activation of RNA,STAR)中的一员,是一类具有信号转导功能的蛋白质,此外还具有与mRNA结合的功能,QKI有三种主要亚型,即QKI5、-6和-7[5]。QKI蛋白的表达分布及功能在神经系统的研究较多,有研究确认该蛋白在脑和心肌中均有高丰度表达,而QKI5在心脏组织中大量表达,可以抑制缺血/再灌注(I/R)诱导的心肌细胞凋亡[5]。
根据miRNA靶基因预测数据库发现心脏疾病相关基因QKI5是miR-208a候选靶基因,因此,笔者初步研究miR-208a在大鼠心肌缺血再灌注损伤中表达变化对QKI5的影响,探索miR-208a在MIRI中的作用机制,为以后心肌缺血再灌注损伤寻找新的治疗方向。
1. 材料与方法
1.1 主要材料与试剂仪器
miR-208a antagomir(广州锐博生物有限公司)、Trizol试剂(美国Invitrogen公司)、DNA逆转录试剂盒(日本Takara公司)、荧光定量检测试剂(大连宝生物)、苏木素染色(福建迈新公司)、RT-qPCR试剂盒及相关试剂( 广州东盛生物科技有限公司) 、cTnT 及CK-MB 检测试剂盒( 上海佰晔生物公司)、IL-6及IL-1β和肿瘤坏死因α( TNF-α)试剂盒(上海酶联生物公司)、兔抗人QKI5单克隆抗体(武汉Bioswamp公司)、RNA提取分离试剂盒(北京天根生化公司)、伯乐qT-PCR仪(美国Bio-Rad公司)、TUNEL凋亡试剂盒(ROCHE公司)、Bradford蛋白浓度测定试剂盒(碧云梯生物研究所)、PVDF膜(美国Millipore公司)。
1.2 实验方法
1.2.1 实验动物分组
选择32只SPF级的雄性SD大鼠(6~8周龄,220~250 g),采用简单随机分组将大鼠分为Sham组、I/R组、I/R+anta-miR-NC组及I/R+anta-miR-208a组,每组8只。实验动物购自于昆明医科大学动物实验中心,在动物舍中保持约22 ℃的室温、55%的相对湿度和12 h的交替光照,清洁养殖和饮用水定期供应。本研究动物实验及处置符合昆明医科大学实验动物中心动物实验伦理要求。
1.2.2 实验动物模型构建
称重SD大鼠,用2%戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉大鼠后,将大鼠固定住;行气管行插管术后连接RWD-407小动物呼吸机,设置通气频率为60~80次/min,潮气量50 mL/kg,呼吸比2∶1,并将针刺电极插入四肢皮下进行全程监测大鼠的肢体II导联心电图(迈瑞)。将SD大鼠胸前区去毛后,皮肤擦拭碘伏消毒,纵行切开皮肤在胸骨左缘第3~4助间处,依次纵深行进。最后将心包剪开,心脏暴露后用6/0线迅速在距离冠状动脉前降支(left anteriordescending artery,LAD)的根部约2~3 mm处系一个拌,其间穿过一根塑料管后将拌拉紧,大鼠心电图ST段的抬高,缺血区域的左室壁颜色发绀或呈浅红色,并伴有室壁运动减弱。结扎LAD 45 min后,拔出塑料管,使冠状动脉恢复血流,随后迅速关闭胸腔,再灌注120 min。Sham组开胸后即缝合,I/R+anta-miR-NC组和I/R+anta-miR-208a组先经尾静脉连续注射antagomir miR-NC 和miR-208a antagomir 2 d后于第3天构建心肌I/R模型。
1.2.3 实验动物心功能检测和标本采集
再灌注120 min后,使用Vivid 7.0高频探头检测左心室的长轴和靠近胸骨的左心室的短轴,记录LVEF、LVFS和SV。并在超声检测后常规麻醉,分离大鼠腹主动脉血液,离心(3000 r/min,10 min),取血清,编号后存于-20 ℃冰箱内,按照酶联免疫吸附法(ELISA)检测心肌损伤标志物CK-MB及cTnI和炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α。分离出心脏,一部分置于4%多聚甲醛中固定,另一部分暂存于-80 ℃冰箱中保存。
1.2.4 HE染色检测心肌组织损伤及TUNEL检测心肌组织细胞凋亡
取留置于多聚甲酸固定的心肌组织,一部分进行常规的切片制作和HE染色,另一部分进行TUNEL染色,严格按照试剂盒说明进行操作,光镜下观察心肌组织病理变化和心肌组织细胞凋亡。
1.2.5 RT-PCR检测心肌组织miR-208a表达
取存于-80℃冰箱内的心肌组织,匀浆后根据miRNA提取试剂盒的说明书提取缺血心肌组织中总miRNA。再使用miRNA RT-PCR试剂盒对miR-208a的3′ 末端加多聚A尾Poly A,并对Poly A修饰的miR-208a进行逆转录反应生成1st Strand cDNA,再行RT-PCR反应,操作参照试剂盒说明书。miR-208a上游引物为5′-ATAAGACGAGCAAAAAGCTTGT-3′ ,下游引物为5′-GGAACGATACAGAGAAGATTAGC-3′ ,以U6为内参,采用2-△△CT法检测miR-208a的相对表达量,每个样品重复3次。
1.2.6 RT-PCR检测心肌组织QKI5 mRNA表达
根据mRNA提取试剂盒说明书提取缺血心肌组织中总mRNA。再使用mRNA逆转录试剂盒对总mRNA进行逆转录反应生成相应的cDNA,再进行RT-PCR反应,操作参照试剂盒说明书。QKI5上游引物5′ -AACATTAAATCACCAGCCCTTGC-3′ ,下游引物为 5′ -CAGCTGGCGTAGGAGTACG-3′ ,并以β-action为内参,采用2-△△CT法检测QKI5 mRNA的相对表达量,每个样品重复3次。
1.2.7 Western blot 检测心肌组织中QKI5和Caspase3蛋白表达
取存于-80 ℃冰箱中的大鼠心肌组织,提取总蛋白,进行凝胶电泳、转膜,质量分数5%脱脂牛奶室温封闭30min,加入一抗稀释液(QKI5,1∶1000;Caspase3,1∶500),4 ℃孵育过夜,次日洗膜后加HRP标记的二抗,室温孵育1 h,添加化学发光试剂,于暗室中显影分析。采用TANON GIS软件进行灰度分析,以GAPDH为内参计算总蛋白相对表达量。
1.3 统计学处理
采用SPSS 21.0统计软件对实验所得数据进行统计学分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差(
$\bar x \pm s $ )表示,多组间应用单因素方差分析,两两比较采用 SNK-q 检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。两变量之间的相关性采用Pearson相关性分析。2. 结果
2.1 miR-208a对I/R大鼠心脏功能的影响
心脏超声对心脏功能检测结果显示I/R组大鼠LVEF、LVFS和SV值低于Sham组(P < 0.05),I/R+anta-miR-208a组大鼠的LVEF、LVFS和SV明显高于anta-miR-NC组和I/R组(P < 0.05),而I/R+anta-miR-NC组与I/R组大鼠LVEF、LVFS和SV差异无统计学意义(P > 0.05),见图1。
2.2 各组I/R大鼠心肌组织病理变化
Sham组大鼠心肌组织HE染色中未见明显异常的心肌细胞;而I/R组和I/R+anta-miR-NC组中显示心肌细胞有明显的的变性坏死,且伴有大量的炎性细胞浸润;I/R+anta-miR-208a组中变性坏死的心肌组织细胞较I/R+anta-miR-NC组和I/R组明显减少,见图2。
2.3 miR-208a对I/R大鼠心肌损伤标注物和炎性因子的影响
I/R组大鼠血清中的心肌损伤标志物CK-MB、cTnI以及炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平高于Sham组(P < 0.05),I/R+anta-miR-208a组血清中的CK-MB、cTnI以及炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α均低于I/R+anta-miR-NC组和I/R组(P < 0.05),而I/R+anta-miR-NC组与I/R组血清中的心肌标志物CK-MB、cTnI以及炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平差异无统计学意义(P > 0.05),见图3。
2.4 miR-208a对I/R大鼠心肌组织细胞凋亡的影响
采用TUNEL染色发现I/R组大鼠心肌组织细胞的凋亡率高于Sham组(P < 0.05),I/R+anta-miR-208a组大鼠心肌组织细胞的凋亡率低于I/R+anta-miR-NC组和I/R组(P < 0.05),而I/R+anta-miR-NC组与I/R组心肌组织细胞凋亡率差异无统计学意义(P > 0.05),见图4。
2.5 各组心肌组织miR-208a及QKI5 mRNA表达水平
利用RT-PCR检测各组心肌组织中miR-208a和QKI5 mRNA的表达后发现,与Sham组相比,I/R组中miR-208a的表达水平升高,而QKI5 mRNA的表达降低(P < 0.05);与I/R+anta-miR-NC组和I/R组相比,I/R+anta-miR-208a组中miR-208a表达水平下降,QKI5 mRNA表达水平升高(P < 0.05),I/R+anta-miR-NC组和I/R组miR-208a和QKI5 mRNA的表达差异无统计学意义(P > 0.05),见图5。
2.6 miR-208a对大鼠心肌组织中QKI5和凋亡蛋白表达的影响
利用 Western blot检测4组大鼠心肌组织中QKI5蛋白和凋亡信号通路蛋白Caspase3的表达水平。与Sham组相比,I/R组QKI5蛋白的表达水平降低,而Caspase3蛋白的表达明显升高(P < 0.05),与I/R+anta-miR-NC组和I/R组相比,I/R+anta-miR-208a组中QKI5的蛋白表达增加,而Caspase3蛋白的表达降低(P < 0.05),I/R+anta-miR-NC组和I/R组蛋白表达差异无统计学意义(P > 0.05),见图6。
2.7 miR-208a与QKI5的相关性分析
使用DIANA数据库预测了QKI5可能是miR-208a的靶基因(图7A),通过对两者的表达相关性分析发现,miR-208a与QKI5蛋白表达呈负相关,miR-208a表达越高,QKI5表达越低(P < 0.05),说明miR-208a可以调控QKI5在心肌I/R中发挥作用(图7B)。
3. 讨论
MIRI是心血管疾病中常见的临床病理现象,多发生于经皮冠状动脉介入治疗术(PCI)、冠脉搭桥术、体外循环下的心脏直视手术等冠脉血流恢复过程中。MIRI涉及钙超载、炎症反应、氧化应激、内质网应激、线粒体功能障碍和蛋白酶激活等[6]。目前临床上还没有预防和治疗心肌缺血再灌注损伤的特效药物和方法。miR-208a属于MyomiRs家族,具有心脏特异性,几乎只在心脏表达[4]。在体内外实验以及临床研究中均发现在心肌缺血再灌注损伤时组织或血清中miR-208a有着明显的升高,其升高的水平与心肌损伤的程度相关[7-9]。本研究中也探讨了miR-208a在I/R大鼠心肌中的表达变化,结果显示在I/R大鼠心肌组织中miR-208a表达较Sham组明显增加,而给予miR-208a antagomir后可以降低I/R大鼠心肌组织中miR-208a的表达,且miR-208a在心肌组织中的表达变化和心肌损伤标志物CK-MB、cTnI的水平基本一致。CK-MB、cTnI是临床判断心肌损伤常用的指标,广泛存在于心肌细胞中,可以反应心肌细胞损伤的程度。本研究结果表明,抑制miR-208a表达时可以降低血清中CK-MB、cTnI水平,改善缺血再灌注损伤大鼠的心脏功能,同时可以减轻I/R损伤大鼠心肌组织病理变化,降低心肌细胞的凋亡。
由于miR-208a在MIRI过程中对心肌细胞凋亡起着重要作用,笔者进一步研究了它的下游通路,通过生物信息学分析发现QKI5可能是miR-208a的靶基因。有研究[10-11]发现QKI5是主要的心脏内源性保护蛋白,可以抑制FOXO1的表达,这是一种重要的转录因子,可以调节心肌细胞的代谢、增殖、氧化应激、免疫功能和细胞死亡。 在增加QKI5表达时,可以降低心肌组织中导致细胞凋亡的因子Bax、Cas-3以及FOXO1的表达,从而可以减轻心肌细胞的损伤。在本究中同样发现抑制miR-208a可以增加心肌组织中QKI5的表达,减轻大鼠MIRI。在心肌缺血时可激活炎症反应系统,急性炎症反应又引起继发性心肌损伤,而再灌注又加重心肌急性炎症反应的程度,心肌缺血再灌注引起机体炎症反应激活炎症细胞释放IL-1β、IL-6和TNF-α等大量炎性因子,而这三种因子是机体严重炎症反应的关键因子,可以加重心肌功能紊乱、组织纤维化和心肌细胞的坏死[12]。过度炎症刺激导致心肌细胞凋亡级联途径激活,促进凋亡蛋白Cas-3的表达和激活。Cas-3可以水解各种细胞内蛋白质并引起细胞凋亡。此外,心肌细胞中Bax和Bcl2表达水平的比值也随着炎症水平的增加而增加,从而促进心肌细胞的凋亡[13]。本研究结果显示I/R大鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α水平高于Sham组,表明心肌缺血再灌注大鼠体内存在持续性炎症反应,与相关文献报道[14]一致,而抑制miR-208a表达可以有效降低炎性因子水平及心肌组织中凋亡蛋白Cas-3的表达,减轻心肌组织缺血区域细胞的坏死和炎性细胞的浸润,增加心肌组织中QKI5蛋白的表达,从而达到保护I/R大鼠心肌细胞的作用。
在大鼠MIRI模型中QKI5的表达水平显著降低,而给与miR-208a抑制剂后QKI5出现明显升高,这说明两者之前存在调控关系,QKI5可能是miR-208a在MIRI过程中的靶基因。笔者利用Western blot检测了QKI5的蛋白表达水平,与mRNA表达相似,QKI5蛋白在MIRI中表达下降。通过分析miR-208a和QKI5蛋白表达的相关性分析发现miR-208a与QKI5表达呈负相关,miR-208a表达越低,QKI5表达越高,说明miR-208a很可能是通过QKI5在MIRI中发挥作用的。
本研究初步探索了miR-208a在大鼠MIRI中的作用及机制,提示其可能是通过调控QKI5蛋白的表达在心肌缺血再灌注中发挥作用的,这可能成为心肌缺血再灌注损伤一种新的有前途的治疗靶点。但是本研究仍存在一点局限性,目前只是在动物模型中发现两者相关,未进行双荧光素酶实验进行验证,在后续的研究中笔者将进一步深入研究。
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表 1 CR与CRp or CRi 2组相关临床特征之间的差异n(%)
Table 1. Differences in relevant clinical features between CR and CRp or CRi groups n(%)
因素 CR组(n = 63) CRi or CRp组(n = 37) χ2 P 年龄(岁) 48(36,60) 49(35,60) 0.100 0.920 性别 0.131 0.718 男 33(52.4) 18(48.6) 女 30(47.6) 19(51.4) 体能评分 9.843 0.002* PS(0~1分) 31(49.2) 6(16.2) PS(2~4分) 32(50.8) 31(83.8) 细胞遗传学风险 5.517 0.019* 预后良好或中等 44(69.8) 17(45.9) 预后不良 19(30.2) 20(54.1) 形态学缓解时MRD 34.602 < 0.001* MRD阳性 15(23.8) 23(62.2) MRD阴性 48(76.2) 14(37.8) 融合基因突变 NPM1+ 33(52.4) 9(24.3) 8.060 0.005* FLT3-ITD+ 25(39.7) 25(67.6) 7.511 0.006* C-KIT+ 17(27) 27(73) 20.443 < 0.001* CEBPA+ 36(57.1) 8(21.6) 10.691 0.001* *P < 0.05。 表 2 单因素Cox回归分析
Table 2. Univariate Cox regression analysis
因素 HR 95%CI P 男性 2.333 1.173~4.639 0.056 年龄≥60岁 2.104 1.050~4.217 0.036* WBC≥30×109/L 0.142 0.018~1.090 0.061 LYM< 0.8×109/L 2.066 0.974~4.383 0.059 PLT< 100×109/L 1.601 0.621~4.127 0.330 PS≥2分 3.892 1.515~9.996 0.005* 预后不良核型 40.588 9.739~169.152 < 0.001* 治疗反应(CRp or CRi) 2.206 1.134~4.291 0.020* 第28天PLT< 300×109/L 3.913 1.627~9.415 0.002* 形态学缓解时MRD+ 4.488 2.200~9.159 < 0.001* *P < 0.05。 表 3 多因素Cox回归分析
Table 3. Multivariate Cox regression analysis
因素 HR 95%CI P 年龄≥60岁 1.690 0.784~3.641 0.180 PS≥2分 3.167 0.944~10.627 0.062 治疗反应(CRp or CRi) 1.060 0.512~2.192 0.876 第28天PLT< 300×109/L 3.436 1.394~8.470 0.007* 形态学缓解时MRD+ 3.384 1.547~7.400 0.002* *P < 0.05。 -
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