HLA-G Enhances the Killing Effect of NK Cells on Cervical Cancer Cells by Promoting the Expression of Activated Receptor
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摘要:
目的 探索宫颈癌细胞中HLA-G表达差异对NK细胞表面活化性受体的影响。 方法 实时定量PCR（real-time PCR）及免疫印迹法（Western-Blot WB）检测宫颈癌细胞及正常宫颈细胞中 HLA-G的表达差异。利用慢病毒载体构建 HLA-G稳定下调的宫颈癌细胞株，并与 NK 细胞共培养，CCK8法检测共培养后宫颈癌细胞增殖能力的变化，流式细胞术检测宫颈癌细胞凋亡水平。同时，流式细胞术检测共培养后NK细胞表面活化性受体NKG2D、NKP30的表达水平及颗粒素（Granzyme）、穿孔酶（Perforin）的表达差异。 结果 RT-PCR及WB法检测结果显示：与H8细胞相比，C33a、SiHa细胞中HLA-G的表达显著升高（P < 0.05）。CCK8法检测结果显示：HLA-G下调后，C33a及SiHa细胞与NK细胞共培养，C33a及SiHa细胞的增殖能力显著减弱（P < 0.05），同时，C33a及SiHa细胞的凋亡水平显著升高（P < 0.05）。流式细胞术检测结果显示：C33a及SiHa细胞HLA-G下调后，与其共培养的NK表面NKG2D表达显著升高（P < 0.05），与C33a共培养的NK细胞表面NKP30及Granzyme、Perforin表达显著升高（P < 0.05），与SiHa共培养的NK细胞表面NKP30及Granzyme、Perforin表达存在升高趋势，但差异均无统计学意义（P > 0.05）。 结论 HLA-G在宫颈癌细胞中高表达，HLA-G表达升高可促进活化性受体的表达，增强NK细胞对宫颈癌细胞的杀伤作用。 Abstract:Objective To explore the effect of HLA-G expression on NK cell surface activation receptor in cervical cancer cells. Methods Real-time PCR （RT-PCR） and Western Blot （WB） methods were used to examine the expression of HLA-G in cervical cancer cells and normal cervical cells, respectively. The cervical cancer cell lines transfected with lentivirus to silence the expression of HLA-G were co-cultured with NK cells. The proliferation ability of co-cultured cervical cancer cells was measured by the method of CCK8, and the level of apoptosis in cervical cancer cells was measured by the flow cytometry method, as well as the expression of NKG2D and NKP30, Granzyme and Perforin. Results The results of RT-PCR and WB showed that compared with H8 cells, the expressions of HLA-G in C33a and SiHa cells were significantly increased （P < 0.05）. Results of CCK8 showed that the proliferation of C33a and SiHa cells was significantly decreased （P < 0.05） when C33a and SiHa cells were co-cultured with NK cells after transfection. The levels of apoptosis in C33a and SiHa cells were significantly increased （P < 0.05）.The results of Flow cytometry showed that the expression of NKG2D on NK surface was significantly increased after C33a and SiHa were transfected （P < 0.05）. Of C33a, The expression of NKP30 on the surface of NK cells and Granzyme, Perforin were significantly increased （P < 0.05）. However, of C33a, the expression of NKP30 on the surface of NK cells and Granzyme, Perforin were increased, but the difference was not statistically significant （P > 0.05）. Conclusion The high expression of HLA-G is in cervical cancer cells, and it may enhance the killing effect of NK cells on cervical cancer cells by promoting the expression of activated receptor. -
Key words:
- Cervical cancer /
- HLA-G /
- NK cell /
- Immune escape
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全世界范围内，女性宫颈癌的发病率位居第4，仅次于乳腺癌、结直肠癌和肺癌。其中三分之一以上病例出现在中国和印度[1]。在中国，由于缺乏广泛的筛查，宫颈癌仍然是中低等收入地区妇女的常见生殖系统恶性肿瘤[2]。
研究表明，人类白细胞抗原G （HLA-G）是孕妇对胎儿提供免疫耐受的中心蛋白，在肿瘤组织中，HLA-G表达显著升高[3]。在乳腺癌、胰腺癌以及卵巢癌细胞中过表达HLA-G可抑制NK细胞的杀伤，HLA-G表达水平降低可恢复NK细胞对肿瘤细胞的杀伤[4]。许多研究表明，HLA-G及其受体可能是肿瘤免疫治疗中重要的检查点[5]。
自然杀伤（natural killer，NK）细胞是机体抵抗肿瘤的重要屏障，与淋巴细胞不同，NK细胞不需要特异性抗原致敏，可通过分泌γ-干扰素（interferon-γ，IFNγ），肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等细胞因子介导细胞毒性作用[6]。多项研究表明，NK细胞可通过多种途径发挥强大的抗肿瘤作用。NK细胞表达一系列免疫受体，以识别靶细胞上的相关配体，维持NK细胞活化与耐受之间的免疫平衡[7]。NK细胞对靶细胞的杀伤依赖于NK细胞表面活化性受体的上调，继而释放穿孔素（Granzyme）、颗粒酶（Perforin）等杀伤介质，发挥抗肿瘤作用。肿瘤细胞可以通过劫持这些受体-配体系统来破坏免疫细胞介导的细胞溶解来逃避免疫监视[8]。研究表明，HLA-G可作为配体抑制NK细胞上表达的活化性受体，可直接降低NK细胞的肿瘤杀伤能力[9]。然而，在NK细胞的活化性受体中，NKG2D、NKP30已被深入研究，但其表达水平与NK细胞对宫颈癌细胞杀伤的影响报道较少。
本研究拟在宫颈癌细胞及正常宫颈上皮细胞中检测HLA-G的表达差异，并进一步探讨HLA-G 如何影响NK细胞对宫颈癌细胞的杀伤能力，HLA-G及其活化性受体NKG2D、NKP30是否可作为新的宫颈癌免疫检查点，以期为宫颈癌免疫治疗新的靶点发现提供一定的理论支持。
1. 材料与方法
1.1 宫颈癌细胞株培养，构建HLA-G稳定低表达细胞株
本课题所使用的宫颈癌细胞系C33a（HPV16+）、SiHa（HPV16-），正常宫颈上皮细胞H8均购自普诺赛（武汉）细胞库。3种细胞系培养基一致，DMEM中加入10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素、链霉素混合物。细胞在37 ℃、5% CO2条件下，放入细胞培养箱（Thermo Fisher Scientific，美国）中培养。每隔2 d更换培养基并在显微镜下观察细胞状态。
将C33a、SiHa接种至6孔板中，待细胞长至40%时，将HLA-G稳定低表达慢病毒载体（吉凯，上海）加入细胞上清液中，感染宫颈癌细胞（shHLA-G-C33a，shHLA-G-SiHa）。约20 h后加入含嘌呤霉素（1 µg/mL）的培养基培养5～7 d，后加入含嘌呤霉素（0.5 µg/mL）的培养基继续维持浓度，进行扩大培养并收集蛋白，采用WB法进行转染效率的检测。
1.2 实时定量PCR（real-time PCR）
使用Trizol（索莱宝，北京）从C33a、SiHa及H8细胞株中提取RNA，并进行RNA浓度及纯度检测，确保RNA溶液的A260/A280的范围在1.8～2.1之间。按照说明书描述，将RNA逆转录为cDNA。然后对HLA-G的引物（生工生物，上海）（表1）进行PCR扩增（SYBR Green PCR Kit，天根，北京雅安达生物）。用Ct值计算HLA-G mRNA相对表达水平，以GAPDH 的表达量作为内参。
表 1 RT-PCR引物序列Table 1. RT-PCR primer sequence基因 引物序列 HLA-G F：GAGAGGAGCAGAGATACATGTG
R：TCAATCTGAGCTCTTCTTCCTCGAPDH F：GAGAAGGCTGGGGCTCATTTGC
R：GCTGATGATCTTGAGGCTGTTGTC1.3 免疫印迹法（western-blot WB）
检测C33a、SiHa、H8细胞株及shHLA-G-C33a，shHLA-G-SiHa稳转株中HLA-G蛋白的相对表达量。弃培养基，用PBS溶液将培养好的贴壁细胞漂洗2～3遍，用预冷的RIPA裂解液（索莱宝，北京）裂解细胞株中的总蛋白，刮落细胞，转移至EP管，用Bradford法测定上清中蛋白浓度。采用SDS-PAGE法，取20～30 µg蛋白进行电泳，采用槽式湿转法转移至PVDF膜，封闭，加入兔抗人HLA-G多克隆抗体（1∶500）（Abcam美国），于4 ℃摇床过夜，洗涤后加入抗兔二抗（1∶2000），加入5%脱脂奶粉室温孵育2 h。以GAPDH（碧云天生物，上海）为内参。
1.4 NK细胞分选，NK细胞与宫颈癌细胞共培养
取正常妇女抗凝外周全血累计20 mL，利用淋巴细胞分离液提取单个淋巴细胞，后用PBS漂洗2遍。将离心好的沉淀中加入250 µLCD56+磁珠（BD 美国），避光静置30 min。后加入2 mL的PBS，用移液器吹匀，放置于磁力架上，避光放置10 min，吸出管中上清液，吸取干净后，加入1 mL PBS，重复上述操作并弃去上清。加入培养基，放入细胞培养瓶中过夜培养。调整细胞浓度为1×106 个/mL，培养备用。流式细胞仪检测NK细胞纯度为93.53%（图1）。
实验共培养细胞共分为6组：（1）C33a组，（2）C33a+NK组，（3）shHLA-G-C33a+NK组，（4）SiHa组，（5）SiHa+NK组，（6）shHLA-G-SiHa+NK组。细胞共培养效靶比为1∶10，培养48 h后，收取细胞用于后续检测。
1.5 细胞增殖检测（CCK8）
采用CCK8法检测共培养后C33a和SiHa细胞增殖的改变，将对数生长期的C33a和SiHa细胞接种于96孔板。再加入分选的NK细胞干预48 h后吸出悬浮的NK细胞后，各孔加入10 µL的CCK8工作液（博奥森，北京），将96孔板置于含5% CO2 的37 ℃培养箱中避光孵育4 h。用酶标仪于450 nm处测定各孔的吸光度（OD）值。
1.6 细胞凋亡
收集1～5×10 5细胞，PBS洗涤2遍。离心后加入0.5 mL的Binding Buffer（BD 美国）悬浮细胞。加入5 μL AnnexinⅤ-FITC混匀后，再加入5 μL PI，混匀。室温避光反应5～15 min，流式细胞仪检测各组细胞凋亡状况。
1.7 流式细胞术
与宫颈癌细胞共培养48 h后，收集悬浮的NK细胞，PBS漂洗2遍，分别加入流式抗体NKG2D、NKP30、Granzyme、perforin（Thermo Fisher Scientific，美国）后，用流式细胞仪进行检测。采用FlowJo分析软件10.8.1进行数据分析。
1.8 统计学处理
采用IBM SPSS 21.0软件及Graphpad Prism 5对所有实验数据进行统计学分析。计量资料服从正态分布采用均数±标准差描述，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两多重比较采用Dunnett法，P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 HLA-G在宫颈癌细胞株中的表达高于正常宫颈上皮细胞
RT-PCR检测结果显示：3组间表达差异有统计学意义（F = 25.870，P = 0.010），与H8（1±0.061）细胞系相比，HLA-G在C33a细胞（1.294±0.068）及SiHa细胞（1.411±0.045）中的表达明显增高（P < 0.05），C33a与SiHa间的表达差异无统计学意义（P = 0.263），见图2A。
图 2 HLA-G在宫颈癌及正常宫颈上皮细胞系中的表达差异A：RT-PCR 检测结果；B：WB检测结果。*P < 0.05；**P < 0.01；****P < 0.001。Figure 2. Difference in HLA-G expression between cervical cancer and normal cervical epithelial cell linesWB检测结果显示：3组间表达差异有统计学意义（F=1455，P < 0.001），与H8（1±0.000）细胞系相比，HLA-G在C33a细胞（1.373±0.030）及SiHa细胞（3.101±0.065）中的表达明显增高（P < 0.05），C33a与SiHa间的表达差异有统计学意义（P < 0.001），图2B。
2.2 宫颈癌细胞系C33a和SiHa细胞慢病毒转染后HLA-G蛋白表达水平降低
WB检测结果显示，C33a细胞中，4组间表达差异有统计学意义（F = 29.980，P < 0.05），HLA-G在C33a细胞中NC组（0.109±0.028）的表达量显著高于shHLA-G-1组（0.037±0.003）、shHLA-G-2组（0.021±0.004）及shHLA-G-3组（0.007±0.001）（P < 0.05），见图3A。SiHa细胞中，4组间表达差异有统计学意义（F = 30.890，P<0.05），HLA-G在NC组（0.372±0.055）中的表达明显高于shHLA-G-1组（0.219±0.016）、shHLA-G-2组（0.160±0.013）及shHLA-G-3组（0.092±0.016）（P < 0.05），见图3B。2株细胞检测结果一致。
图 3 慢病毒转染宫颈癌细胞系后HLA-G表达情况A：C33a细胞系；B：SiHa细胞系。*P < 0.05；**P < 0.01；***P < 0.001。Figure 3. HLA-G expression after transfection in cervical cancer cell lines2.3 HLA-G下调后促进人外周血NK细胞对宫颈癌细胞的杀伤
HLA-G下调后，NK细胞与C33a及SiHa细胞共培养，CCK8法检测共培养后肿瘤细胞增殖能力，结果显示：C33a细胞中，3组间差异有统计学意义（F = 707.300，P < 0.001），与C33a细胞株（1.916±0.046）相比，C33a+NK组（1.453±0.054）及shHLA-G-C33a+NK（0.747±0.039）组细胞增殖能力明显减弱（P < 0.001），且C33a+NK组与shHLA-G-C33a+NK间差异有统计学意义（P < 0.001），见图4A。同样的，SiHa细胞中，3组间差异有统计学意义（F = 682.400， P < 0.001），与SiHa细胞株（1.943±0.032）相比，SiHa+NK组（1.095±0.048）及shHLA-G-SiHa+NK（0.472±0.071）组细胞增殖能力明显减弱（P < 0.001），且SiHa+NK组与shHLA-G-SiHa+NK间差异有统计学意义（P < 0.001），见图4B。
图 4 CCK8法检测各组宫颈癌细胞增殖能力A：C33a细胞株；B：SiHa细胞株。****P < 0.0001。Figure 4. CCK8 was used to detect the proliferation of cervical cancer cellsHLA-G下调后，NK细胞与C33a及SiHa细胞共培养，流式细胞术检测共培养后肿瘤细胞凋亡程度，结果显示：C33a细胞中，3组间差异有统计学意义（F = 348.100， P < 0.001），与C33a细胞株（3.153±0.360）%相比，C33a+NK组（7.130±1.404）%及shHLA-G-C33a+NK（23.050±0.873）%组细胞凋亡水平明显增加（P < 0.05），且C33a+NK组与shHLA-G-C33a +NK间差异有统计学意义（P < 0.001），见图5A。SiHa细胞株中，3组间差异有统计学意义（F = 21.310，P = 0.002），与SiHa组（4.330±1.564）%相比，SiHa+NK组（15.240±1.804）%凋亡水平存在升高趋势，但差异无统计学意义（P = 0.061），shHLA-G-SiHa+NK（28.810±7.603）%组细胞凋亡水平明显升高（P = 0.002），且SiHa+NK组与shHLA-G-SiHa+NK间差异有统计学意义（P = 0.026），见图5B。
图 5 HLA-G下调后NK细胞与C33a及SiHa细胞共培养，肿瘤细胞凋亡程度A：C33a 细胞；B：SiHa 细胞。*P < 0.05；**P < 0.01；****P < 0.0001。Figure 5. After HLA-G transfection，NK cells were co-cultured with C33a and SiHa cells，detection the degree of apoptosis of tumor cells2.4 HLA-G下调促进NK细胞表面激活性受体NKG2D、NKP30的表达
HLA-G下调后，NK细胞与C33a及SiHa细胞共培养，流式细胞术检测共培养后NK细胞表面NKG2D的表达，结果显示：C33a细胞中，3组间差异有统计学意义（F = 70.160，P < 0.001），与NK组（1.840±0.505）%相比，NK+C33a组（6.557±3.278）%存在升高趋势，但差异无统计学意义（P = 0.083），而NK+shHLA-G-C33a组（22.790±2.121）%NKG2D表达率明显升高（P < 0.001），且NK+C33a组与NK+shHLA-G-C33a组间差异有统计学意义（P < 0.001）。SiHa细胞中，3组间差异有统计学意义（F = 153.200，P < 0.001），与NK组（1.840±0.505）%相比，NK+SiHa组（11.560±1.376）%及NK +shHLA-G-SiHa组（20.600±1.739）% NKG2D表达率明显升高（P < 0.05），且NK+SiHa组与NK+shHLA-G-SiHa组间差异有统计学意义（P < 0.001），见图6A。
图 6 HLA-G下调后，NK细胞与宫颈癌细胞共培养，NK细胞表面激活性受体及杀伤介质的表达A：NKG2D；B：NKP30；C：Granzyme；D：Perforin。*P < 0.05；**P < 0.01；****P < 0.0001。Figure 6. After HLA-G transfection，NK cells were co-cultured with cervical cancer cells，the expression of NK cell surface activating receptor and killing agent was observed流式细胞术检测共培养后NK细胞表面NKP30的表达，结果显示：C33a细胞中，3组间差异有统计学意义（F = 123.500，P < 0.001）。与NK组（7.047±1.242）%相比，NK+C33a组（11.470±0.185）%及NK+shHLA-G-C33a组（19.050±1.053）% NKP30表达率明显升高（P < 0.05），且NK+C33a组与NK+shHLA-G-C33a组间差异有统计学意义（P < 0.001）。SiHa细胞中，3组间差异有统计学意义（F = 10.550，P = 0.011），与NK组相比，NK+SiHa组（12.770±0.529）%NKP30表达率存在升高趋势，但差异无统计学意义（P = 0.236），而NK+shHLA-G-SiHa组（21.240±6.455）%NKP30表达率显著升高（P = 0.009），NK+SiHa组与NK+shHLA-G-SiHa组间差异无统计学意义（P = 0.077），见图6B。
流式细胞术检测共培养后Granzyme的表达结果显示：C33a细胞中，3组间差异有统计学意义（F = 33.170，P = 0.001），与NK组（14.700%±1.455）%相比，NK+C33a组（16.350±2.528）% Granzyme的表达水平存在升高趋势，但差异无统计学意义（P = 0.689），而NK+shHLA-G-C33a组（29.110±2.894）%Granzyme表达率显著升高（P = 0.001），且NK+C33a组与NK+shHLA-G-C33a组间差异有统计学意义（P = 0.001）。SiHa细胞中，3组间差异有统计学意义（F = 6.881，P = 0.028），与NK组相比，NK+SiHa组（20.330±0.998）% Granzyme表达率略升高，而NK+shHLA-G-SiHa组（29.840±8.568）%Granzyme表达率显著升高（P = 0.024），而NK+SiHa组与NK+shHLA-G-SiHa组间差异无统计学意义（P = 0.131），见图6C。
流式细胞术检测共培养后Perforin的表达，结果显示：C33a细胞中，3组间差异有统计学意义（F = 20.81，P = 0.002），与NK组（17.330±0.503）%相比，NK+C33a组（20.170±3.947）%Perforin的表达水平存在升高趋势，但差异无统计学意义（P = 0.562），而NK+shHLA-G-C33a组（33.280±3.935）% Perforin表达率显著升高（P = 0.002），且NK+C33a组与NK+shHLA-G-C33a组之间表达差异有统计学意义（P = 0.006）。SiHa细胞中，3组间差异有统计学意义（F = 9.921，P = 0.01），与NK组相比，NK+SiHa组（24.530±0.806）% Perforin表达率存在升高趋势，但差异无统计学意义（P = 0.152），而NK+shHLA-G-SiHa组（31.980±6.910）% Perforin表达率显著升高（P = 0.010），而NK+SiHa组与NK+shHLA-G-SiHa组间差异无统计学意义（P = 0.152），见图6D。
3. 讨论
全世界范围内，女性宫颈癌发病率位居第4，占所有女性恶性肿瘤的6.6%，因此是一个重大的全球健康挑战，约90%的宫颈癌死亡病例发生在经济欠发达地区。尽管在过去十年中，有效筛查和预防性疫苗接种取得了重大进展，但晚期宫颈癌仍然缺乏有效的治疗策略。因此，新的治疗策略，如免疫治疗的研究迫在眉睫。
HLA-G的表达最初在母胎界面的细胞滋养层细胞上被发现，HLA-G可调节母亲免疫细胞的反应，有助于维持对胎儿的免疫耐受[10]。多年来，许多学者研究了HLA-G在不同类型恶性肿瘤中的表达水平，表明多种恶性肿瘤HLA-G表达升高，其中包括口腔鳞癌[11]、结直肠癌[12]和乳腺癌[13]等。许多研究表明，HLA-G在恶性肿瘤中的表达与患者不良的临床结局相关，提示HLA-G在恶性肿瘤进展中发挥重要作用。在宫颈癌中HLA-G同样发挥促进肿瘤恶性转化的作用，姜等[14]的研究中发现，HLA-G的表达水平越高，宫颈癌组织分化程度越差。在本研究中，以H8细胞作为阴性对照组，从mRNA、蛋白2种水平分别在C33a及SiHa细胞系中检测HLA-G的表达水平，结果表明，HLA-G在宫颈癌细胞中表达水平显著升高。结果与文献中报道的基本一致，说明宫颈癌的发生与HLA-G的表达水平呈正相关，它的表达升高可能使患者发生宫颈癌的风险增加。Dong等[15]的研究发现，与未感染HPV的CIN患者相比，HPV16/18感染的CIN和宫颈癌患者的HLA-G表达显著升高。本研究中，mRNA水平和HLA-G在C33a、SiHa细胞中的表达存在上升趋势，但差异无统计学意义，而蛋白水平，SiHa细胞中HLA-G的表达明显高于C33a，且差异有统计学意义，说明HLA-G蛋白的表达水平升高可能与HPV16感染密切相关，本研究选用两株宫颈癌细胞系，而Dong等的研究对象为患者组织样本，且阳性对照组为CIN组织，研究样本的不同，可能是造成结果不一致的原因。值得注意的是，本研究中转录水平和蛋白水平的检测结果不完全一致，课题组分析，从HLA-G基因到蛋白发挥功能有可能存在各种未知的调控机制，因此，HLA-G在宫颈癌中的是否能与高危型人乳头状瘤病毒（HPV）协同促进宫颈癌发生发展及具体的调控机制，课题组将进一步深入研究。
HLA-G可通过介导抗原递呈来影响宿主的免疫反应。HLA-G在肿瘤细胞中的表达升高，可能使它们逃脱宿主的免疫监视[16]。几项体外研究表明，与肿瘤细胞相比，HLA-G下调的白血病、胶质瘤、卵巢癌和肝细胞癌细胞株被NK细胞更有效地杀死。也有研究报道，用HLA-G抗体可阻断NK细胞介导的靶向癌细胞株的裂解，表明HLA-G的高表达促进肿瘤细胞逃脱宿主的免疫监视[3]。当肿瘤细胞缺乏HLA-G的表达时，可通过激活性受体的上调激发NK细胞对肿瘤细胞的杀伤，杀伤激活性受体主要包括NKG2D、NCR（NKP30、NKP44、NKP46）及CD226，其中NKG2D是具有细胞外凝集素样结构域的跨膜蛋白，它是NK细胞表面的主要激活性受体[17]。Guerra等[18]的体内研究发现，敲除NKG2D基因后，肿瘤体积明显增大，这是首次在基因水平证明NKG2D在恶性肿瘤中的重要免疫监视作用。徐等[19]的研究发现，在肺癌中，NKG2D与其配体结合后，可激活NK细胞，诱导机体的抗肿瘤免疫应答。本课题组在宫颈癌C33a及SiHa两株细胞中均发现HLA-G的表达水平与NK细胞表面NKG2D表达水平呈负相关，说明HLA-G作为NKG2D的配体，它的下调促进了NK细胞对宫颈癌细胞的杀伤裂解。此外，NK细胞还可表达天然细胞毒性受体NKP30，它与其配体HLA-G的结合将一种强烈的激活信号传递给NK细胞，介导NK细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。Pende等[20]的工作首次鉴定了NKP30，证明了该受体在恶性肿瘤细胞裂解中发挥重要作用。研究表明，NKP30的表达与机体主动清除肿瘤细胞的能力直接相关，相反，降低NKP30的活性，可一定程度的避免NK细胞对肿瘤细胞的杀伤裂解，同时，NKP30表达不足与恶性肿瘤患者的不良预后密切相关[21]。Banu等[22]的研究发现，用可溶性NKP30刺激宫颈癌细胞可降低细胞增殖和迁移能力。本研究在C33a细胞中发现，HLA-G下调后，NKP30的表达升高。而在SiHa细胞系中HLA-G下调后，NKP30的表达有上升趋势，但差异无统计学意义，说明NKP30的表达可能会一定程度的受到HPV病毒的影响，但具体影响机制还需进一步研究。因此，课题组认为HLA-G与NKG2D有望成为宫颈癌免疫治疗新的联合靶点，而HLA-G与NKP30是否可以成为宫颈癌免疫治疗的联合靶点，有待进一步深入研究。
大量文献表明，NK细胞可通过释放含有Granzyme的细胞毒性颗粒或接触启动Caspase级联反应的死亡受体来消除肿瘤细胞。Granzyme一旦被释放，在Perforin的帮助下会被运送到靶细胞的细胞质中，对靶细胞进行杀伤[23]。值得注意的是，本研究中，采用WB法检测HLA-G的表达差异，发现与H8细胞相比，HLA-G在C33a及SiHa细胞中的表达明显升高，且C33a及SiHa细胞中HLA-G的表达存在显著性差异。同样的，在经处理的C33a及SiHa细胞中NKG2D的表达差异均有显著性差异，提示HLA-G作为癌基因，可能与HPV16感染协同促进肿瘤生成，同时通过抑制NK细胞表面活化性受体NKG2D的表达，促进肿瘤免疫逃逸的发生。进一步研究发现，以C33a细胞为研究对象，HLA-G基因干扰前后NKP30、Granzyme、Perforin的表达差异均有统计学意义，而以SiHa细胞为研究对象，HLA-G基因干扰前后NKP30、Granzyme、Perforin的表达差异均无统计学意义。因此，NKP30能否作为免疫检查点有待课题组进一步研究。
本研究已经在NK细胞的特性和触发机制的探索方面取得了部分进展，研究的目的是通过靶向NK细胞受体和癌细胞标记物来触发NK细胞对癌细胞的溶解反应。研究这些受体的基本作用，对于开发阻碍HLA-G功能的免疫检查点抑制剂具有重要意义，HLA-G及其激活性受体NKG2D可能成为肿瘤免疫治疗中免疫阻断的靶点。
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图 2 HLA-G在宫颈癌及正常宫颈上皮细胞系中的表达差异
A：RT-PCR 检测结果；B：WB检测结果。*P < 0.05；**P < 0.01；****P < 0.001。
Figure 2. Difference in HLA-G expression between cervical cancer and normal cervical epithelial cell lines
图 3 慢病毒转染宫颈癌细胞系后HLA-G表达情况
A：C33a细胞系；B：SiHa细胞系。*P < 0.05；**P < 0.01；***P < 0.001。
Figure 3. HLA-G expression after transfection in cervical cancer cell lines
图 4 CCK8法检测各组宫颈癌细胞增殖能力
A：C33a细胞株；B：SiHa细胞株。****P < 0.0001。
Figure 4. CCK8 was used to detect the proliferation of cervical cancer cells
图 5 HLA-G下调后NK细胞与C33a及SiHa细胞共培养，肿瘤细胞凋亡程度
A：C33a 细胞；B：SiHa 细胞。*P < 0.05；**P < 0.01；****P < 0.0001。
Figure 5. After HLA-G transfection，NK cells were co-cultured with C33a and SiHa cells，detection the degree of apoptosis of tumor cells
图 6 HLA-G下调后，NK细胞与宫颈癌细胞共培养，NK细胞表面激活性受体及杀伤介质的表达
A：NKG2D；B：NKP30；C：Granzyme；D：Perforin。*P < 0.05；**P < 0.01；****P < 0.0001。
Figure 6. After HLA-G transfection，NK cells were co-cultured with cervical cancer cells，the expression of NK cell surface activating receptor and killing agent was observed
表 1 RT-PCR引物序列
Table 1. RT-PCR primer sequence
基因 引物序列 HLA-G F：GAGAGGAGCAGAGATACATGTG
R：TCAATCTGAGCTCTTCTTCCTCGAPDH F：GAGAAGGCTGGGGCTCATTTGC
R：GCTGATGATCTTGAGGCTGTTGTC
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