YLR358C Regulates Cell Wall Integrity of Saccharomyces cerevisiae
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摘要:
目的 观察酿酒酵母YLR358C缺失对细胞壁完整性的调控作用。 方法 通过点板实验观察YLR358CΔ酵母的生长情况；Calcofluor White（CFW）染色及透射电镜分析YLR358C对酵母细胞壁的影响；转录组分析及qRT-PCR检测YLR358C调控的信号通路。 结果 在含有不同浓度的细胞壁干扰剂CFW、刚果红（CR）和十二烷基硫酸钠（SDS）的培养基上，YLR358C敲除酿酒酵母的生长受到明显抑制。CFW染色显示YLR358CΔ酵母细胞壁几丁质下调，透射电镜也观察到细胞壁厚度变薄。转录组测序和分析表明，YLR358C基因可能参与CWI信号通路的调控。qRT-PCR检测发现YLR358C敲除后WSC3、SWI4和HSP12有差异表达（P < 0.05）。 结论 YLR358C可能调控酵母细胞壁的完整性，在发酵工程中具有一定的应用潜力。 Abstract:Objective To observe the effect of Saccharomyces cerevisiae （S. cerevisiae） YLR358C deletion on cell wall integrity. Methods The growth of YLR358CΔ yeast was observed by spot assay; the effect of YLR358C on yeast cell wall was analyzed by Calcofluor White （CFW） staining and transmission electron microscopy （TEM）; the signal pathway regulated by YLR358C was detected by transcriptome analysis and qRT-PCR. Results The growth of S. cerevisiae knockout with YLR358C was significantly inhibited on medium containing CFW, congored （CR） and sodium dodecyl sulfate （SDS） at different concentrations. The cell wall chitin was down-regulated by CFW staining and the cell wall thickness was reduced by TEM. Transcriptome sequencing and analysis indicated that YLR358C gene may be involved in the regulation of CWI signaling pathway. qRT-PCR showed that WSC3, SWI4 and HSP12 were differentially expressed after YLR358C knockout （P < 0.05）. Conclusion YLR358C may regulate the integrity of yeast cell wall, and has certain application potential in fermentation. -
Key words:
- Saccharomyces cerevisiae /
- Cell wall integrity /
- YLR358C /
- Transcriptome analysis
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甲状腺术后甲状旁腺功能减退（post surgical hypoparathyroidism，HypoPT）是甲状腺手术常见并发症之一[1]。因下位甲状旁腺（parathyroid gland，PG）位置不固定，使PG难以原位保留，导致HypoPT的发生率增加。朱精强等[2]提出术前诸多情况可能影响术中对甲状旁腺的辨认及保护，如：术前中-重度甲状腺功能亢进、严重甲状腺功能减退、维生素D缺乏等均可增加PG损伤风险。若纠正影响因素可提高手术安全性。大量文献研究HypoPT的发生率与这4种危险因素：VI区淋巴结清扫（central lymph node dissection，CLND）、淋巴结转移、PG自体移植、周围侵犯中的至少1个有关[3-11]，但代谢综合征（metabolicsyndrome，MS）和同时存在风险因素的数量与HypoPT的发生率之间的关系研究很少。
1. 资料与方法
1.1 纳入和排除标准及诊断标准
收集整理2021年7月至2022年3月云南省肿瘤医院行甲状腺全切（单侧全切或双侧全切）术后患者的病例资料。
2004年MS诊断标准[12]：（1）超重和（或肥胖），BMI≥25.0 kg/m2；（2）甘油三脂≥1.7 mmol/L或HDL-C：男性 < 0.9 mmol/L、女性 < 1.0 mmol/L；（3）血压（收缩压/舒张压）≥140/90 mmHg或既往诊断高血压并治疗者；（4）空腹血糖≥6.1 mmol/L或糖负荷后2 h FBG≥7.8 mmol/L或有糖尿病史。
据2018年ATA指南甲状旁腺功能减退的诊断标准[5，13]：（1）生化型：iPTH水平低于正常参考值下限伴低钙血症；（2）低钙血症：血清总钙水平低于实验室参考范围下限；（3）临床型：在生化甲旁减的基础上，伴有低钙血症的症状和（或）体征。
纳入标准[14]：（1）病例资料记录准确完整；（2）初次行甲状腺手术；（3）无其他恶性肿瘤病史；（4）术前有完整的MS诊断指标；（5）术后第1天血清甲状旁腺素（parathyroid hormone，PTH）；（6）手术由同一组医生操作完成。
排除标准：（1）有颈部放射治疗史;（2）合并甲状旁腺腺瘤或慢性肾功能不全导致继发性甲状旁腺功能亢进者；（3）病检提示PG受损者；（4）术前Mg2+、Ca2+、P5+水平异常；
1.2 资料收集
患者临床资料收集与整理：年龄、性别、是否绝经、 体重指数（body mass index，BMI）、高血压、雌激素水平、糖尿病、血脂、血糖、血压、术前和术后第1天的PTH及电解质水平、MS、肿块性质、T分期、是否行CLND、局部是否侵犯、甲状腺全切范围、PG自体移植、淋巴结是否转移，见图1。
1.3 统计学处理
应用SPSS26.0软件进行统计学分析，因为研究中相关的计量资料不服从正态分布，故采用中位数（四分位数）的方式对患者的计量资料进行描述，采用例数（百分比）的方式对患者的计数资料进行描述。采用秩和检验进行计量资料的组间比较，采用卡方检验的统计学方法进行计数资料的组间比较。采用Logistic回归的方法进行多因素分析。P < 0.05为差异有统计学意义。用Graphpad Prism 9软件对结果行结果可视化的处理。
2. 结果
2.1 患者一般情况及是否发生HypoPT的临床病理特征比较结果
根据纳入及排除标准，最终有266例数据纳入研究。一般情况如下：女219例（82.3%），小于55岁184例（69.2%），发生HypoPT的105例（39.5%），PG自体移植45例（16.9%）。年龄、BMI、高血压、MS、肿块的性质、T分期、CLND、淋巴结转移、周围侵犯、甲状腺全切方式均可以影响HypoPT的发生（P < 0.05），见 表1。
表 1 患者临床病理特征比较情况[n（%）/M（P25，P75）]Table 1. Comparison of clinicopathological characteristics of patients [n%/M（P25，P75）]临床病理特征 患者甲状旁腺功能情况 Z/χ2 P 减退（n = 105） 正常（n = 121） 年龄 ≥55岁 28（26.7） 14（11.6） 8.468a 0.004* < 55岁 77（73.3） 107（88.4） 性别 女 102（97.1） 117（96.7） 0.038a 1.000 男 3（2.9） 4（3.3） 绝经 是 36（35.3） 29（24.8） 2.883a 0.09 否 66（64.7） 88（75.2） BMI（kg/m2） ≥25 46（43.8） 36（29.8） 4.805a 0.028* < 25 59（56.2） 85（70.2） 高血压 是 22（21.0） 11（9.1） 6.343a 0.012* 否 83（79.0） 110（90.9） MS 是 21（20.0） 10（8.3） 6.542a 0.011* 否 84（80.0） 111（91.7） CLND 无 6（5.7） 16（13.2） 53.308a < 0.001* 单侧 47（44.8） 97（80.2） 双侧 52（49.5） 8（6.6） 淋巴结转移 N0 65（61.9） 93（76.9） 5.977a 0.014* N+ 40（38.1） 28（23.1） 侵犯外周 是 15（14.3） 4（3.3） 8.802a 0.003* 否 90（85.7） 117（96.7） 肿块性质 恶性 62（59.0） 92（76.0） 23.512a < 0.001* 良性 20（19.0） 27（22.3） 恶性+良性 23（21.9） 2（1.7） T分期 T1 72（83.7） 89（94.7） 8.938a 0.031* T2 1（1.2） 2（2.1） T3 6（7.0） 2（2.1） T4 7（8.1） 1（1.1） 甲状腺全切范围 单侧 32（30.5） 111（91.7） 90.785a < 0.001* 双侧 73（69.5） 10（8.3） 旁腺移植 是 23（21.9） 22（18.2） 0.489a 0.485 否 82（78.1） 99（81.8） 雌激素水平 39.3（17.8，91.9） 43.1（25.7，81.5） 1.043 0.297 *P < 0.05；“a”表示连续校正 χ2。 据单因素分析，同时排除一些可能存在交互影响的因素（因MS已经包含：BMI、高血压指标；纳入的指标中肿块的性质、CLND、淋巴结是否转移、周围侵犯已经可以决定手术的方式及T分期），所以将年龄、MS、肿块性质、CLND、 周围侵犯、淋巴结转移进行多因素Logistic分析，得出：（1）年龄、周围侵犯、淋巴结是否转移对HypoPT发生无统计学意义（P > 0.05）；（2）有MS发生HypoPT的可能性是无MS的 2.89倍，有MS易发生HypoPT；（3）双侧CLND发生HypoPT的可能性是无CLND的12.4倍；（4）两腺叶分别为良恶性混合发生HypoPT的可能性是良性的9.493倍，见 表2。
表 2 术后甲状旁腺功能减退多因素分析Table 2. Multivariate analysis of postoperative hypoparathyroidism因素 回归系数 标准误 Wald χ2 OR（95%） P MS 1.061 0.513 4.276 2.89（1.057，7.903） 0.039* 无 30.316 0.00* CLND 单侧 0.087 0.63 0.019 1.091（0.317，3.752） 0.89 双侧 2.518 0.716 12.378 12.4（3.05，50.417） 0.00* 良性 11.042 0.004* 肿块性质 恶性 −0.422 0.486 0.752 0.656（0.253，1.7） 0.386 恶性+良性 2.251 0.901 6.237 9.493（1.623，55.523） 0.013* 年龄 0.75 0.467 2.581 2.117（0.848，5.283） 0.108 侵犯外周 0.474 0.723 0.429 1.606（0.389，6.62） 0.512 淋巴结是否转移 0.757 0.402 3.547 2.132（0.97，4.689） 0.06 注：以“未患有MS、无CLND、肿块性质良性、年龄 < 55岁、外周未侵犯、淋巴结未转移”为对照； *P < 0.05。 2.2 危险因素存在数量与HypoPT发生率的临床病理特征比较结果
在发生HypoPT的105名患者中不具备上诉4个危险因素的有6例（收治的患者大多为恶性肿瘤患者，不具备上诉4个危险因素的虽然较少，但符合临床现状，见表3。
表 3 危险因素数量的临床特征[n（%）/M（P25，P75）]Table 3. Clinical characteristics for the number of risk factors [n（%）/M（P25，P75）]项目 0 1 2 3 4 总计 人数 6（5.7） 42（40.0） 41（39.0） 11（10.5） 5（4.8） 105（100.0） 年龄 50.0（45.5，54.5） 49.0（42，59） 43.0（34.5，51.5） 40.0（36，51）
52. 0（39，66.5） 48.0（38，55） 性别 女 6（100.0） 41（97.6） 41（100.0） 10（90.9） 4（80.0） 102（97.1） 男 0 1（2.4） 0 1（9.1） 1（20.0） 3（2.9） BMI（kg/m2） 24.9（22.3） 24.2（21.9，25.8） 24.6（22.4，26.7） 25.3（21.8，28.1） 23.8（23.2，25.4） 24.3（22.3，26.7） 绝经 是 1（16.7） 20（48.8） 10（24.4） 3（30.0） 2（50.0） 36（52.3） 否 5（83.3） 21（51.2） 31（75.6） 7（70.0） 2（50.0） 66（64.7） 高血压 是 2（33.3） 13（31.0） 4（9.8） 2（18.2） 1（20.0） 22（21.0） 否 4（66.7） 29（69.0） 37（90.2） 9（81.8） 4（80.0） 83（79.0） MS 是 1（16.7） 29（69.0） 5（12.9） 1（9.0） 1（20.0） 21（20.0） 否 5（83.3） 13（31.0） 36（87.8） 10（91.0） 4（80.0） 84（80.0） CLND 无 6（100.0） 0 0 0 0 6（5.7） 单侧 0 23（54.8） 18（43.9） 4（36.4） 2（40.0） 47（44.8） 双侧 0 19（45.2） 23（56.1） 7（63.6） 3（60.0） 52（49.5） PG移植 是 0 0 12（29.3） 6（54.5） 4（100.0） 23（21.9） 否 6（100.0） 42（100.0） 29（70.7） 5（45.5） 0 82（78.1） 侵犯外周 是 0 0 4（9.8） 6（54.5） 5（100.0） 15（14.3） 否 6（100.0） 42（100.0） 37（90.2） 5（45.5） 0 90（85.7） 肿块性质 良性 5（83.3） 12（28.6） 2（4.9） 1（9.1） 0 20（19.0） 恶性 1（16.7） 22（52.4） 31（75.6） 7（63.6） 1（20.0） 62（59.0） 恶性+良性 0 8（19.0） 8（19.5） 3（27.3） 4（80.0） 23（22.0） 腺叶切除 单侧 4（66.7） 4（33.3） 12（29.3） 2（18.2） 0 32（30.5） 双侧 2（33.3） 28（66.7） 29（70.7） 9（81.8） 5（100.0） 73（69.5） 淋巴结转移 是 0 0 25（61.0） 10（90.9） 5（100.0） 40（38.1） 否 6（100.0） 42（100.0） 16（39.0） 1（9.1） 0 65（61.9） 注：4个主要的危险因素：VI区淋巴结的清扫，淋巴结是否转移，外周是否侵犯，甲状旁腺是否自体移植；*P < 0.05。 同时存在危险因素的数量与HypoPT的发生情况进行多因素分析，并将年龄、肿块性质、MS等作为混杂因素进行校正。同时存在危险因素的数量与HypoPT的发生率之间存在正相关（表4、图2）。
表 4 HypoPT与危险因素数量关系多因素分析Table 4. Multivariate analysis of the relationship between HypoPT and the number of risk factors危险因素个数 未校正 校正 P OR（95%CI） P OR（95%CI） 0 0.042 参考值 0.019 参考值 1 0.385 1.581（0.562～4.443） 0.508 1.501（0.451～4.992） 2 0.095 2.453（0.857～7.024） 0.035 4.023（1.1～14.711） 3 0.025 5.133（1.234～21.355） 0.025 6.579（1.271～34.059） 4 0.04 11.667（1.112～122.381） 0.235 5.475（0.331～90.623） 注：危险因素个数为0个为参考项；纳入年龄、肿块性质、MS为混杂因素经行校正。 
图 2 危险因素数量与HypoPT关系的多因素分析森林图Figure 2. Forest plot of multivariate analysis of the relationship between the number of risk factors and HypoPT3. 讨论
HypoPT轻者表现为手足口角麻木，重症者可导致膈肌麻痹、心率失常。长时间失去PG对血钙的生理性调节，易对肾、脑、心血管等损害影响患者生活质量[15]。
有很多风险因素可以导致HypoPT的发生，本文通过单因素分析：年龄、BMI、高血压、MS、肿块性质、T分期、CLND、淋巴结是否转移、周围侵犯、腺叶切除方式会影响HypoPT的发生率，这与既往研究结果相一致[3-11]。MS也是HypoPT发生的独立危险因素，可能与以下原因有关：（1）肥胖（大多MS都具备）致手术视野暴露不充分，解剖层次不清，导致手术困难增加；（2）原位保留PG其功能恢复主要依赖于丰富的血供和避免术中热损伤造成的纤维化，而MS主要影响患者血管的质量。MS的存在是否会影响患者PG功能的恢复，需增加样本量和延长随访时间去验证。
多因素分析结果MS、CLND、肿块性质、淋巴结是否转移是HypoPT发生率的独立危险因素，这也与许多既往研究相一致[3-11]。如果术前把可控的危险因素进行降低或消除，同时术中更加注重甲状旁腺的保护[16]（如双极电能量器械进行精细化背膜解剖技术），多方面提高手术的安全性[17]。
从上诉研究结果中看出具备4个危险因素的患者其OR值比3个危险因素的患者低，这可能与以下因素有关：（1）样本量较少（只有5人，在同等条件下比不具备危险因素的OR值大5.475倍）；（2）可能纳入的混杂因素与4个危险因素之间产生交互（未校正前是逐步递增）。所以初步认定同时存在危险因素的数量与HypoPT发生率之间存在正相关。
对相关风险因素的掌握，尽早识别高风险患者，做好医患沟通可减少医疗纠纷[18]；因PG功能恢复是一个长期和动态的过程[17]，但其功能恢复主要取决于血钙和PTH浓度的恢复，术后1月血钙维持在2.07 mmol/L或更高[19]，会对PG产生抑制而对PG起到保护作用[20]。
在本次研究中，存在以下缺陷：（1）女性患者占主导（甲状腺恶性肿瘤以女性高发，位居女性所有恶性肿瘤的第4位[1]）和MS占比较少；（2）样本量较小；（3）增加术后随访时间探讨MS对PG功能恢复的影响。期待大样本的前瞻性研究进一步验证。
综上所述，PG功能的保护最好是原位保留甲状旁腺，术前危险因素的把控，术中采取精细化背膜解剖技术，术后对高危患者尽早行预防性补钙[2, 15]、做好术后规范化管理[15, 19]。减少暂时性HypoPT的发生，进一步降低永久性HypoPT。
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图 1 敲除YLR358C提高了酿酒酵母对细胞壁干扰剂的敏感性
A：用10倍稀释的酵母在YPD平板和含不同浓度细胞壁干扰试剂CFW的YPD平板上进行点板实验检测； B：含不同浓度细胞壁干扰试剂CR的YPD平板；C：含不同浓度细胞壁干扰试剂SDS的YPD平板。
Figure 1. The YLR358C knockout increases the sensitivity of S. cerevisiae to cell wall interference reagents
图 2 酵母细胞壁中的几丁质受YLR358C调控
A：采用CFW法对酵母细胞壁几丁质进行染色； B：透射电镜结果显示YLR358CΔ突变酵母的细胞壁比WT菌株更薄。
Figure 2. The chitin in the yeast cell wall is regulated by YLR358C
图 3 R358C基因敲除和转录组分析
A： YLR358C敲除与WT酵母的样本相关性分析；B：基于YLR358CΔ和WT酵母转录组分析的差异表达基因火山图；C：差异表达基因热图。其中728个基因表达上调，931个基因表达下调。差异表达基因的热图，红色表示上调基因，绿色表示下调基因；D： YLR358CΔ酵母与WT酵母差异表达基因的KEGG分析。
Figure 3. YLR358C knockout and transcriptome analysis
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[1] Kadam A A,Kamatkar J D,Khandare R V,et al. Solid-state fermentation:tool for bioremediation of adsorbed textile dyestuff on distillery industry waste-yeast biomass using isolated Bacillus cereus strain EBT1[J]. Environmental Science and Pollution Research International,2013,20(2):1009-1020. doi: 10.1007/s11356-012-0929-6 [2] Sostaric N,Arslan A,Carvalho B,et al. Integrated multi-omics analysis of mechanisms underlying yeast ethanol tolerance[J]. Journal of Proteome Research,2021,20(8):3840-3852. doi: 10.1021/acs.jproteome.1c00139 [3] Omura F,Takagi M,Kodama Y. Compromised chitin synthesis in lager yeast affects its Congo red resistance and release of mannoproteins from the cells[J]. FEMS Microbiology Letters,2020,367(22):fnaa181. doi: 10.1093/femsle/fnaa181 [4] Sanz A B,Garcia R,Rodriguez-Pena J M,et al. The CWI pathway:Regulation of the transcriptional adaptive response to vell wall stress in yeast[J]. Journal of Fungi,2017,4(1):1. doi: 10.3390/jof4010001 [5] Zhao F,Yang J,Li J,et al. (2020). Multiple cellular responses guarantee yeast survival in presence of the cell membrane/wall interfering agent sodium dodecyl sulfate[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications,2020,527(1):276-282. doi: 10.1016/j.bbrc.2020.03.163 [6] Winzeler E A,Shoemaker D D,Astromoff A,et al. Functional characterization of the S. cerevisiae genome by gene deletion and parallel analysis[J]. Science,1999,285(5429):901-906. doi: 10.1126/science.285.5429.901 [7] Ohashi K,Chaleckis R. High levels of Tryptophan reduce cell wall or membrane stress tolerance in Saccharomyces cerevisiae[J]. Bioscience,Biotechnology,and Biochemistry,2021,85(10):2131-2136. [8] Li J,Zhang M M,Wan C,et al. Improved cellulase production in recombinant Saccharomyces cerevisiae by disrupting the cell wall protein-encoding gene CWP2[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering,2020,129(2):165-171. doi: 10.1016/j.jbiosc.2019.08.012 [9] Ravishankar A,Pupo A,Gallagher J E G. Resistance mechanisms of Saccharomyces cerevisiae to commercial formulations of glyphosate involve DNA damage repair,the cell cycle,and the cell wall structure[J]. G3,2020,10(6):2043-2056. doi: 10.1534/g3.120.401183 [10] Feng L,Wang J,Ye D,et al. Yeast population dynamics during spontaneous fermentation of icewine and selection of indigenous Saccharomyces cerevisiae strains for the winemaking in Qilian,China[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture,2020,100(15):5385-5394. doi: 10.1002/jsfa.10588 [11] Hara K Y,Saito M,Kato H,et al. 5-Aminolevulinic acid fermentation using engineered Saccharomyces cerevisiae[J]. Microbial Cell Factories,2019,18(1):194. doi: 10.1186/s12934-019-1242-6 期刊类型引用(1)
1. 马蕾，张丽芝. 云南省玉溪市红塔区5～16岁儿童遗尿症发病相关因素调查. 昆明医科大学学报. 2019(04): 71-75 . 
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