Network Pharmacology-based Analysis of the Anti-atherosclerosis Mechanism of Scutellarin and Experimental Validation in Vivo
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摘要:
目的 基于网络药理学分析灯盏乙素（Scutellarin） 治疗动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS） 潜在的分子生物学机制。 方法 通过PubChem数据库进行灯盏乙素潜在的靶点预测，运用Disgenet，CeneCards筛选与AS关联的靶基因，利用Cytoscape 3.9.0建立疾病-靶点-成份可视化网络，使用String构建蛋白互作网络图，利用David数据库进行GO及KECG的网络构建。另外，高脂喂养复制APOE-/-小鼠AS模型， 用不同浓度的灯盏乙素灌胃治疗，利用RT-PCR方法验证筛选所得核心通路的表达变化。 结果 （1）网络药理学预测结果：灯盏乙素治疗AS的核心靶点共有肿瘤坏死因子-α （TNF-α），AKT丝氨酸/苏氨酸激酶（AKT serine/threonine kinase，MAPK），低密度脂蛋白受体（Low density lipoprotein receptor），载脂蛋白E（apolipoprotein E，APOE）等共106个。灯盏乙素调控PI3K/AKT信号通路（hsa04151）、Ras信号通路（hsa04014）、MAPK信号通路（hsa04010）（P < 0.05）等涉及细胞的增殖，炎症反应，氧化应激，及细胞凋亡等生物学过程来治疗AS；（2） 体内实验验证的结果：和模型组相比，灯盏乙素组呈浓度依耐性地下调PI3K、AKT、mTOR和Bcl-2 的mRNA表达，上调Bax和Caspase-3的mRNA表达，（ P < 0.05）。另外，和模型组相比，灯盏乙素则呈浓度依耐性地下调小鼠血清TNF-α和IL-1β的含量（ P < 0.05）。 结论 经过网络药理学筛选和RT-PCR验证，灯盏乙素通过调控PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制APOE-/-小鼠AS模型炎症反应，促进细胞凋亡而治疗AS。 -
关键词:
- 网络药理学 /
- 灯盏乙素 /
- 动脉粥样硬化 /
- APOE-/- 小鼠AS模型 /
- PI3K/AKT/mTOR
Abstract:Objective To analyze the potential molecular biological mechanism of scutellarin for the treatment of atherosclerosis （AS） based on network pharmacology. Methods The PubChem database was used to predict the potential targets of scutellarin, and the Disgenet and CeneCards databases were used to predict and screen the genes related to atherosclerosis, and the Cytoscape 3.7.0 software was used to establish and construct the component-target-disease network visualization network. The GO and KECG pathways were analyzed using the David database. In addition, an APOE-/- mouse AS model was developed and treated with different concentrations of scutellarin, and the expression changes of the core targets were verified by RT-PCR. Results 1. Network pharmacological prediction results: the core targets of Scutellarin for AS treatment were tumor necrosis factor-α （TNF-α）, AKT serine/threonine kinase 1 （MAPK）, low density lipoprotein receptor （LDLR）, apolipoprotein E （APOE）, among other targets, with 106 in total. The key targets of Scutellarin are PI3K/AKT signaling pathway （hsa04151）, Ras signaling pathway （hsa04014） and MAPK signaling pathway （hsa04010） （P < 0.05）, which are involved in cell proliferation, inflammatory response, oxidative stress and apoptosis, to treat AS. 2. Results of in vivo experiments: compared with the model group, the mRNA expression of PI3K, AKT, mTOR and Bcl-2 was down-regulated and the mRNA expression of Bax and Caspase-3 was up-regulated in the Scutellarin group. In addition, compared with model group, Scutellarin down-regulated the contents of TNF-α and IL-1β in serum concentration-dependent （P < 0.05）. Conclusion Through network pharmacology screening and RT-PCR verification, Scutellarin inhibits the process of inflammatory response in a mouse model of AS by regulating the PI3K/AKT/mTOR signaling pathway. -
Key words:
- Network pharmacology /
- Scutellarin /
- Atherosclerosis /
- APOE-/- mice AS model /
- PI3K\AKT\mTOR
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生物导向型预备技术（biologically oriented preparation technique，BOPT）由Loi在2008年首次提出[1]，通过临时修复体对牙龈塑形，获得满意的牙龈形态后再在永久修复体上复制穿龈部分的准确形态。BOPT理念倡导牙体预备中并不形成明确的肩台，根据牙周参数在颈部区域勾勒牙冠，以利于更加自由的调整牙龈形态。与其他牙体预备技术相比，BOPT 技术在准备印模、临时牙冠重衬和创建牙冠轮廓直至最终修复的过程更简单、更快捷[1]。
BOPT是传统水平精加工线的可靠替代方案。使用BOPT后，牙龈组织可根据修复体出现的形状进行建模，形成牙周保护组织，特别是形成新的牙周组织，在结构上等同于正常的牙周组织，以确保没有炎症的健康环境[2]。
现在BOPT已广泛应用于口腔各类修复方案中[3]，本文将从贴面、全冠、种植及总结4个方面综合论述BOPT的应用现状。
1. BOPT在贴面中的应用
BOPT技术代表了目前口腔修复领域牙体预备的新趋势。这种技术与陶瓷贴面一起使用，可将牙龈龈缘线的稳定性转移到陶瓷贴面上，从而稳定牙龈组织并避免不必要的牙龈退缩[4]。
研究发现[5]，进行正确的牙周分析后，在没有终点线的情况下进行牙体预备可纠正牙龈不对称，这有助于成功维持软组织稳定。作为常规治疗的替代方案，使用BOPT在前牙区应用陶瓷贴面有助于牙周组织的改建和改善牙龈对称性。在贴面中使用 BOPT，牙体制备不设置水平终点线，软组织能在正确的位置再生，进而达到良好的适应和稳定，甚至可以纠正软组织异常和不对称。与传统的制备技术相比，BOPT在牙体预备过程中产生更大程度的牙龈增厚，无论患者呈现薄牙龈生物型还是厚牙龈生物型，都会降低由于血管形成增加而导致牙龈移位的风险。
2. BOPT在全冠中的应用
有研究表明，固定义齿的留存率与冠修复材料无密切相关性[6]。固定义齿的牙龈边缘位置一直是口腔修复领域争论的热点[7-8]。牙龈修复位置不当会导致牙周病及龋病的发生[9]。 Maniatopoulos等[10]的前瞻性研究表明，BOPT形成良好的修复体周围结构，提高了牙龈边缘的稳定性，增加修复体周围的牙龈厚度。
固定义齿修复最常见的并发症之一是牙龈边缘的顶端迁移，这可能与牙龈边缘位置和牙体预备类型等因素有关。Serra-Pastor等[11]对25名患者使用BOPT制备前牙后行固定桥修复，在进行长达6 a的追踪评估后得出结论：使用BOPT制备的牙齿后行固定桥修复，基牙具有良好的牙周健康和牙龈边缘稳定性，且牙龈无退缩，固定桥留存率为100%。
有学者[12]使用BOPT进行单个氧化锆冠修复前牙的牙周组织评估和患者满意度进行为期 6 a的前瞻性临床研究，研究表明在前牙区用BOPT制备的牙齿在修复体周围特别在牙龈边缘的稳定性和牙龈厚度增加方面，表现出良好的牙周形态。用BOPT制备的单冠获得了优异的临床留存率，并且在6 a后获得较高的患者满意度。
3. BOPT在种植修复中的应用
种植体的长期成功率部分取决于修复体和种植体颈部周围建立的软组织圈，这一结构可以提供有效的密封，防止细菌入侵后导致的种植体周围炎[13]。临床医生能够决定和调整种植体周围软组织的边缘水平，从而改变修复体冠颈缘，提供软组织的适应性形态，软组织以受控方式侵入龈沟，从而确保种植体周围组织的健康，提供种植体周围硬组织和软组织的稳定性[14-16]。
良好的种植体周围软组织可防止牙龈组织萎缩，并可作为防止食物嵌塞的机械屏障，这是植入物支撑修复体不可避免的常见问题[17]。BOPT通过胶原纤维增强上皮组织附着和种植体周围黏膜密封，胶原纤维随着时间的推移保持牙龈组织的稳定和厚实，更加有效保护种植体周围骨组织[18-20]。
在种植体上粘结修复体与固定修复体粘结到天然牙齿的设计和美学原则一致[21]。BOPT同样适用于粘结在种植体上的固定修复体[22-23]，确保种植体周围组织健康，预防牙周组织发生炎症[21]。Cabanes-Gumbau 等[24]的研究表明，使用BOPT行种植修复，10月后种植体周围软组织厚度显着增加[25]。种植体周围软组织的形态功能及骨质流失与使用的修复体类型有关，与传统的种植体相比，采用BOPT的种植体修复表现出更好的种植体周围软组织形态，种植体周围骨质流失也较少[26-27]。
4. 小结
综上所述，BOPT在贴面、全冠及种植修复后修复体周围都表现出良好的牙周组织形态，大大提高修复的成功率及患者满意度。使用BOPT预备的修复体其周围软组织表现出良好的形态，牙龈增厚，边缘组织稳定性增加，并发症的发生率较低。在需要更换旧修复体的情况下，BOPT 是一种很好的治疗选择，表现出良好的牙周组织形态、牙龈增厚和边缘稳定性增加[8]。许多研究已经证明使用该技术治疗的牙齿的牙周组织状况有所改善[2]。随着BOPT研究的深入，BOPT的应用范围越来越广阔[3]。BOPT还可与全数字工作流程相结合，矫正和重塑牙龈形态[28]。
尽管BOPT有一定的局限性，对于牙龈厚度不足难以确保生物宽度有足够的空间行种植修复的临床病例，BOPT并不适用。此外，该技术非常耗时，因为在第2阶段手术期间，临床医生必须调整临时基台，这需要丰富的临床经验，对新手医生是极大的挑战[29]。但BOPT在临床中应用广泛，促进牙周组织再生，恢复良好边缘形态，具有良好的应用前景，值得临床推广。
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图 3 灯盏乙素-动脉粥样硬化-靶点网络
Figure 3. Intersection of Scutellarin predicted targets and atherosclerotic targets
图 4 灯盏乙素治疗动脉粥样硬化潜在靶点的PPI网络
Figure 4. PPI network of potential targets of Scutellarinl on anti-AS
图 6 灯盏乙素治疗动脉粥样硬化潜在靶点的GO富集分析
Figure 6. GO enrichment analysis of potential targets of Scutellarin for anti-atherosclerosis
图 7 灯盏乙素治疗AS潜在靶点的KEGG通路分析
Figure 7. KEGG pathway analysis of potential targets of Scutellarin on anti- atherosclerosis
图 8 HE染色结果 （200×）
A：正常对照组；B：模型组；C：Scutellarin 7 mg/kg组；D：Scutellarin 14 mg/kg组；E：Scutellarin 28 mg/kg组；F：ATV 10 mg/kg组。
Figure 8. HE staining results （200×）
图 9 灯盏乙素对PI3K/AKT/mTOR信号通路及炎症因子的影响[（
$\bar x \pm s $ ），n = 6）]A-a：PI3K的mRNA 表达；A-b：AKT的mRNA 表达；A-c：mTOR的mRNA 表达。B-a：Bax的mRNA 表达；B-b：Bcl-2的mRNA 表达；B-c：Caspase-3的mRNA 表达。C： 小鼠血清TNF-α的含量。D：小鼠血清IL-1β的含量。与空白对照组相比较，*P < 0.05，** P < 0.01;与模型组比较，#P < 0.05，#P < 0.01。
Figure 9. Effects of Scutellarin on PI3K/AKT/mTOR signaling pathway-related genes and inflammatory factors[（
$\bar x \pm s $ ），n = 6）]表 1 实验涉及的部分数据库
Table 1. Main databases involved in the experiment
名称 网址 用途 Pubchem https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ 化合物相关信息下载 Swiss http://www.swisstargetprediction.ch/ 药物相关靶点检索 Pharm mapper http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/ 药物相关靶点检索 Genecards https://www.genecards.org/ 疾病相关靶点检索 Disgenet https://www.disgenet.org/ 疾病相关靶点检索 Venny https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/ 疾病-药物靶点交集图 Uniprot https://www.uniprot.org/ 靶点名称翻译 David https://david.ncifcrf.gov/ KEGG、GO分析 String https://string-db.org/ 蛋白质相互作用网络 微生信平台 http://www.bioinformatics.com.cn/ 数据处理 Cytoscape v3.9.0软件 https://cytoscape.org/ 数据处理及绘图 
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表 2 引物序列
Table 2. The primer sequence
引物名称 长度（bp） 引物序列5′→3′ PI3K 20 Forward primer：CTTATGTCCTTGGCATTGGT Reverse primer：CAAAGTCTATGTGGAAGAGCTG AKT1 20 Forward primer：TCACCCAGTGACAACTCAG Reverse primer：AAACTCGTTCATGGTCACAC Bcl-2 19 Forward primer：TGACTGAGTACCTGAACCG Reverse primer：TAGTTCCACAAAGGCATCC Bax 19 Forward primer：CTGCAGAGGATGATTGCTG Reverse primer：GTCTGCAAACATGTCAGCT Caspase-3 21 Forward primer：AACTCTTCATCATTCAGGCCT Reverse primer：CCATATCATCGTCAGTTCCAC β-actin 20 Forward primer：CTTCCTGGGTATGGAATCCT Reverse primer：TCTTTACGGATGTCAACGTC mTOR 20 Forward primer：GCAGATTTGCCAACTATCTTCGG Reverse primer：CAGCGGTAAAAGTGTCCCCTG
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