Effect of Cathelicidin LL-37 on Transmembrane Barrier Function of Urothelial Cells
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摘要:
目的 探索LL-37对膀胱尿路上皮细胞跨膜屏障功能破坏的具体作用，构建适于体外研究间质性膀胱炎（interstitial cystitis，IC）的细胞实验模型。 方法 分别用不同浓度的LL-37处理人尿路上皮永生化细胞SV-HUC-1，通过跨上皮电阻测量仪测量跨上皮细胞电阻，CCK-8检测细胞增殖活力，流式细胞仪检测细胞周期和钙离子浓度，RT-qPCR和WB检测葡萄糖胺聚糖（GAGs）关键成分硫酸乙酰肝素的表达水平。 结果 体外细胞跨上皮电阻测量显示，100和200 μg/mL LL-37可显著抑制细胞的跨上皮电阻，破坏SV-HUC-1细胞的跨膜屏障功能。CCK-8和PI染色流式细胞检测显示，100 μg/mL 以上的LL-37可显著降低SV-HUC-1细胞的增殖活力，提高SV-HUC-1细胞处于G0/G1期的比例（P < 0.05），提示细胞增值受到显著抑制。进一步流式细胞术检测SV-HUC-1细胞中的钙离子浓度显示，LL-37处理后的尿路上皮细胞内钙离子浓度显著升高（P < 0.05），且增高量与LL-37浓度相关。RT-qPCR和WB检测证实经LL-37处理后SV-HUC-1细胞的GAGs关键成分硫酸乙酰肝素表达显著上调（P < 0.05）。 结论 抗菌肽LL-37可抑制SV-HUC-1细胞内GAGs关键成分硫酸乙酰肝素的表达，并破坏SV-HUC-1的细胞增殖和跨膜屏障功能。 Abstract:Objective To explore the specific effect of LL-37 on the destruction of the transmembrane barrier function of bladder urothelial cells and develop a cellular experimental model suitable for studying interstitial cystitis （IC） in vitro. Methods Human urothelial immortalized cells SV-HUC-1 were treated with LL-37 at different concentrations. The transepithelial electrical resistance （TEER） was measured by a transepithelial resistor, and the cell proliferative activity was detected by CCK-8 kit. Cell cycle and calcium ion concentration were detected by flow cytometry. The expression levels of heparan sulfate, a key component of glycosaminoglycan （GAGs）, were detected by RT-qPCR and WB. Results In vitro measurement showed that 100 and 200 μg/mL of LL-37 significantly inhibited the TEER and destroyed the transmembrane barrier function of SV-HUC-1. The CCK-8 test and PI staining flow cytometry results showed that LL-37 above 100 μg/mL could significantly reduce the proliferation activity of SV-HUC-1 and increase the proportion of SV-HUC-1 in the G0/G1 phase （P < 0.05）, suggesting that cell proliferation was significantly inhibited. Further flow cytometry analysis showed that the calcium ion concentration in SV-HUC-1treated with LL-37 was significantly increased （P < 0.05）, and the increase was related to LL-37 concentration. RT-qPCR and WB assays confirmed significant up-regulation of heparan sulfate, a key GAGs component, in the LL-37-treated SV-HUC-1 （P < 0.05）. Conclusion The cathelicidin LL-37 can inhibit the expression of GAGs and destroy the cell proliferation and transmembrane barrier function of SV-HUC-1. -
上颌磨牙根管系统的解剖形态变异较大，尤其是近中颊侧第二根管（second mesiobuccal，MB2）增加了临床治疗难度。已有研究发现接受根管治疗的上颌第1磨牙有46.5%遗漏MB2，其中72.7%与其根尖周病变有关[1]。MB2发生率有明显地区和种族差异，我国人群上颌第1磨牙MB2平均发生率为85.4%[2]。笔者采用锥形束CT（cone-beam computed tomography，CBCT）对来自昆明人群上颌第1和第2磨牙的根管系统进行分析研究，总结MB2发生率及根管口分布规律。
1. 资料与方法
1.1 研究对象
选取2018年10月至2018年12月到云南省第一人民医院口腔医学中心进行诊治并行CBCT检查的403名患者，按照准入标准筛选人群，分析上颌第1和第2磨牙的CBCT检查资料。
1.2 准入标准[3]
年龄17～80岁；无牙根吸收或折断影像；无金属或瓷类修复材料；牙根发育成熟、根尖孔完全闭合。
1.3 扫描方法
口腔放射科医师严格按照厂家说明进行扫描，仪器为RAYSCAN α-3D口腔数字化体层摄影及全景X射线机（RAY公司），扫描参数设置：90 kVp、4 mA、像素100 μm 、视野100 cm2（10×10 cm）、扫描时间9～14 s、最小层面厚度0.3 mm。
1.4 图像分析
选取上颌第1和第2磨牙轴状面（釉牙骨质界到根尖）、矢状面（近中向远中）和冠状面（颊侧向舌侧）连续观察，记录MB2有无及根管类型，测量MB2-MB1距离（MB2-MB1）、MB2-垂线（MB2与MB1-P连线的垂线）距离、MB1-P距离（MB1-P）、DB-P距离（DB-P），2名牙髓科主治医师独立分析（Xelis dental-CDViewer 1.0.5.2），有争议时与口腔放射科医师共同决定。
1.5 统计学处理
采用SPSS20.0统计软件进行统计分析，计量资料用（
$\bar x \pm s $ ）表示，计数资料用率/构成比表示，组间采用χ2检验，检验水准α = 0.05，以P < 0.05为差异有统计学意义。2. 结果
总共分析403个患者的CBCT资料，最终358名患者的1279颗牙齿获准入选，其中包括183名男性和175名女性的645颗上颌第1磨牙和634颗上颌第2磨牙。
2.1 昆明人群上颌磨牙MB2发生率
本研究人群共有645颗上颌第1磨牙，其中640颗为典型3牙根（99.2%），2颗为2牙根4根管（0.31%），还有3颗为2牙根3根管（0.47%）。上颌第1磨牙MB2平均发生率为86.51%，男性高于女性（89.16% > 83.71%，P < 0.05），左右无显著性差异（85.45%、87.58%，P > 0.05），17～19岁组MB2发生率明显低于其他3组（70.0%，P < 0.05），其他3组间无显著性差异（分别为88.61%、87.39%、79.75%，P > 0.05）。
上颌第2磨牙总共634颗，其中524颗为典型3牙根（82.6%），65颗为2牙根（10.3%），42颗为融合单根（6.6%），MB2平均发生率为52.05%，男女间无显著性差异（分别为53.96%和50.00%，P > 0.05），左右无显著性差异（分别为48.74%和55.38%，P > 0.05），各年龄组无显著性差异（分别为40.00%、51.08%、52.44%、59.38%，P > 0.05），见表1。
表 1 昆明人群上颌第1和第2磨牙MB2发生率（%）Table 1. MB2 in maxillary first and second molars in Kunming population （%）牙位项目 上颌第1磨牙 上颌第2磨牙 数量 MB2 发生率 数量 MB2 发生率 性别 男 n = 332 n = 296 89.16 n = 328 n = 177 53.96 女 n = 313 n = 262 83.71 n = 306 n = 153 50.00 牙位 左 n = 323 n = 276 85.45 n = 318 n = 155 48.74 右 n = 322 n = 282 87.58 n = 316 n = 175 55.38 年龄（岁） 17～19 n = 20 n = 14 70.00 n = 20 n = 8 40.00 20～39 n = 316 n = 280 88.61 n = 325 n = 166 51.08 40～59 n = 230 n = 201 87.39 n = 225 n = 118 52.44 > 59 n = 79 n = 63 79.75 n = 64 n = 38 59.38 2.2 上颌磨牙MB2根管类型构成比分析
根据Vertucci标准[4]进行根管类型分析，上颌第1磨牙MB2：Ⅱ型（2-1）15.59%、Ⅲ型（1-2-1）6.27%、Ⅳ型（2-2）64.52%、Ⅴ型（1-2）13.62%；上颌第2磨牙MB2类型为：Ⅱ型（17.27%）、Ⅲ型（7.27%）、Ⅳ型（50.00%）、Ⅴ型（25.46%），见表2。
表 2 昆明人群上颌第1和第2磨牙MB2根管构成（%）Table 2. The composition of MB2 in maxillary first and second molars in Kunming population （%）牙位
根管类型上颌第1磨牙 上颌第2磨牙 数量 构成比（%） 数量 构成比（%） Ⅱ n = 87 15.59 n = 57 17.27 Ⅲ n = 35 6.27 n = 24 7.27 Ⅳ n = 360 64.52 n = 165 50.00 Ⅴ n = 76 13.62 n = 84 25.46 合计 n = 558 100 n = 330 100 2.3 上颌第1磨牙各根管口间距测量
本研究人群上颌第1磨牙MB2与其它根管口关系为：与MB1距离（1.70±0.72）mm，与垂线距离（0.78±0.49）mm；有MB2上颌第1磨牙MB1-P为（6.45±1.16）mm，DB-P为（5.12±1.08）mm，无MB2上颌第1磨牙MB1-P为（5.48±0.08）mm，DB-P为（4.48±0.08）mm（表3）。
表 3 昆明人群上颌第1磨牙各根管口间距（$\bar x \pm s $ ，mm）Table 3. The distance between canal orifices in maxillary first molars in a Kunming population （$\bar x \pm s $ ，mm）上颌第1磨牙 MB1-MB2 MB2-垂线 MB1-P DB-P MB1-P/DB-P 有MB2 $\bar x \pm s $ 1.70 ± 0.72 0.78 ± 0.49 6.45 ± 1.16 5.12 ± 1.08 1.28 ± 0.08 最大值 4.58 7.63 10.72 9.74 - 最小值 0.41 0.18 0.80 2.80 - 无MB2 $\bar x \pm s $ - - 5.48 ± 0.08 4.48 ± 0.08 1.23 ± 0.02 最大值 - - 7.70 6.70 - 最小值 - - 3.97 3.19 - 3. 讨论
上颌磨牙根管治疗时MB2的存在对牙髓专科医师是一大挑战，MB2根管口常为继发性牙本质所覆盖，其位置确认、探查及疏通都比较困难[5]。近年来人们对上颌磨牙MB2根管进行了大量研究，不同方法的结果差异较大。CBCT作为一种无损性三维检查方法，可以更准确地判断MB2，是根管形态体内研究的金标准[6]。
本研究人群上颌第1磨牙绝大部分为3个牙根（99.2%），有2颗牙齿仅有颊根和腭根2牙根，但每个牙根均包含2根管，另有3颗牙齿也是2牙根，但根管为3个（近中颊、远中颊和腭根管）。本研究人群上颌第1磨牙MB2平均发生率为86.51%，青年人发生率较低，随年龄增长MB2明显增加，与Zhang[2]和Tian等研究结果一致。可能的原因是继发性牙本质沿根管颊舌向不断沉积，导致1个宽大的扁根管分为2个根管。Zhang等[8]研究发现我国四川地区人群上颌第1磨牙MB2发生率为52%，低于本研究结果。Kewalramani R等[9]研究发现印度人群上颌第1磨牙MB2发生率为61.9%（低于本研究人群），20～40岁最高，> 40岁次之，< 20岁最低（分别为67.4%、57.5%、50.6%），与本研究结果相似。最近一项大型研究[10]综合分析全世界21个国家和地区人群总共5250颗上颌第1磨牙，发现MB2平均发生率为73.8%，男性高于女性（76.3% > 71.8%），与本研究结果一致。
本研究人群上颌第1磨牙近颊根管大部分为Vertucci Ⅳ型，即MB2有独立的根管口和根尖孔，其次为Ⅱ型和Ⅴ型，提示MB2与MB1间有融合或交通，Ⅲ型最少，MB2与MB1由融合到分开再发生融合，形态最为复杂。Faraj等[11]研究伊拉克人群上颌第1磨牙的根尖孔解剖，结果发现有MB2的牙齿66.28%为1根尖孔，33.72%为2根尖孔，与本研究结果一致。MB2根管口多为椭圆形，与MB1形态一致，但明显要细小，常有偏向近中腭侧的弯曲，然后再移向中心，最后到达根尖，治疗时应特别注意。
本研究人群上颌第2磨牙MB2平均发生率为52.05%，高于我国台湾地区人群（35.97%）[12]，随年龄增长上颌第2磨牙MB2发生率没有明显增加，其近颊根管类型构成比与上颌第1磨牙相似，也是Ⅳ型最常见，其次为Ⅴ型和Ⅱ型，Ⅲ型最少。
既往研究MB2定位时常沿MB1和P根管口画条参照线，MB2位于参照线近中侧，距离MB1根管口2～3 mm处[13]。本研究人群上颌第1磨牙MB2均位于参照线近中侧，与MB1距离为（1.70±0.72）mm，与垂线距离为（0.78±0.49）mm。
Zhang等[2]分析南京地区人群1008颗上颌第1磨牙CBCT资料，经受试者工作特征曲线分析后首次提出：MB1-P和DB-P比值可用于预测上颌第1磨牙MB2的存在，大于1.26提示有MB2可能性很大。本研究人群有MB2的上颌第1磨牙MB1-P/DB-P比值为1.28±0.08，表明该理论有一定诊断价值，但需要更多的临床数据证实。Su等[14]研究发现上颌磨牙有和无MB2的MP（比值比 = 1.891）和MD间距（比值比 = 1.448）存在显著性差异，提示有MB2的上颌磨牙根管治疗时应该改良髓腔入路设计以便MB2的定位，但未对MP/MD比值与MB2的相关性进行研究。
本研究利用CBCT技术研究昆明人群上颌第1和第2磨牙的根管系统特征，结果发现上颌第1和第2磨牙MB2发生率分别为86.51%和52.05%，其中IV型最为常见，上颌第1磨牙MB1-P/DB-P比值可辅助用于术前判断MB2的有无。术前充分了解牙齿根管形态，术中测量MB1-P和DB-P间距辅助诊断，根据MB2与其他根管口位置的关系，结合口腔手术显微镜和超声器械的使用，可更好定位MB2，提高上颌磨牙的根管治疗成功率。本研究纳入病例较少，不能完全反映昆明人群上颌磨牙的根管特征，需要在临床中进一步验证。
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图 1 LL-37显著降低SV-HUC-1细胞的增殖活力和跨膜电阻
A：跨膜电阻测量仪检测SV-HUC-1细胞跨膜电阻；B：CCK-8检测细胞增殖活力；C、D：流式细胞仪检测细胞周期。*P < 0.05。
Figure 1. LL-37 significantly reduced the proliferative activity and transmembrane resistance of SV-HUC-1 cells
图 2 LL-37调控SV-HUC-1细胞内钙离子浓度和GAGs关键成分硫酸乙酰肝素的表达
A、B：流式细胞术检测细胞中的钙离子；C：RT-qPCR检测GAGs关键成分硫酸乙酰肝素的表达；D：WB检测GAGs关键成分硫酸乙酰肝素的表达。*P < 0.05，**P < 0.01。
Figure 2. LL-37 Regulating the Intracellular Calcium Ion Concentration of SV-HUC-1 and the Expression of heparan sulfate，a key component of GAGs
表 1 引物序列
Table 1. Primer sequences
目的基因 引物序列（F：正向序列；R：反向序列；5′-3′） HS2ST1 F: CAGCGGCGTTGGTGATAGCG R: AGAGAGCGACAGCGAGAGAACC HS3ST1 F: CCAAGTGTTCTACAACCACATG R: CTTTAGGAACCTCTCGACCTTT HS3ST2 F: CTTACCTGTGTTACAGCTTCCT R: CTTCTGGAGAAGTTTCTGGCC HS3ST3A1 F: AACCTGAACTCGGGCGGAGAG R: GTGGCGAGCGACAGTGACTTC HS6ST1 F: GAAGACGTCGTTGCATATGTG R: GATGAAGGACAGGTTGTAGCAG 
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