Effects of Dose-response and Time-dependent of Endotoxin on Proliferation of Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells
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摘要:
目的 探讨内毒素（Endotoxin)，又称为脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）的量效和时效对人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSCs）增殖的影响。 方法 用含不同浓度LPS（0.098、0.195、0.39、0.78、1.56、3.12、6.25、12.5、25和50 EU/mL）的干细胞培养基培养hUC-MSCs，采用CCK-8增殖实验检测24h、48h和72 h的细胞增殖情况。确定促进hUC-MSCs增殖的低浓度（0.098 EU/mL）、中浓度（1.56 EU/mL）和高浓度（25 EU/mL）LPS，选择作用时间72 h，进一步用流式细胞术明确LPS对hUC-MSCs增殖的影响。 结果 CCK-8检测结果提示，作用24 h、48 h时，表现为抑制hUC-MSCs的增殖。作用72 h时，表现为促进细胞增殖，且低浓度区域促进作用最显著，浓度增加其促增殖作用相对减弱。流式细胞术结果提示低浓度LPS组G0/G1期的占比降低，S期和G2/M期占比增高。 结论 LPS的量效和时效对hUC-MSCs的增殖表现出不同的效应，适宜的LPS浓度及作用时间有利于hUC-MSCs的增殖。 Abstract:Objective To investigate the effects of dose-response and time-dependent of endotoxin on the proliferation of human umbilical cord mesenchymal stem cells（hUC-MSCs）. Methods The hUC-MSCs were cultured in stem cell culture medium containing different concentrations of endotoxin（0.098, 0.195, 0.390, 0.780, 1.5600, 3.12, 6.250, 12.500, 25.000 and 50.000 EU/mL）. CCK-8 proliferation assay was used to detect the cell proliferation at 24, 48 and 72 hours. The low concentration（0.098 EU/mL）, medium concentration（1.56 EU/mL）and high concentration（25 EU/mL） of LPS were determined to promote the proliferation of hUC-MSCs, and the action time was selected for 72 hours. The effect of LPS on the proliferation of hUC-MSCs was further determined by flow cytometry. Results After 24, 48 hours of the treatment, it was mainly manifested by inhibiting the proliferation of hUC-MSCs. After 72 hours of the treatment, it showed a trend of promoting cell proliferation, and the promotion effect was most significant in the low concentration area, and the promotion effect was relatively weakened when the concentration increased. Further flow cytometry results suggested that the proportion of G0/G1 phase decreased, S phase and G2/M phase increased in LPS group of low concentration. Conclusion The dose-response and time-dependent of endotoxin have different effects on the proliferation of hUC-MSCs , and the appropriate concentration and duration of action of endotoxin are beneficial to the proliferation of hUC-MSCs. -
风湿性关节炎属于是一种较为常见的急性或慢性结缔组织炎症，临床多表现为关节与肌肉游走性酸楚、红肿及疼痛等[1]。现阶段，类风湿关节炎的发病机理尚未在临床实践中阐明，普遍认为与A组乙型溶血性链球菌感染有关，随着病程延长，患者以关节滑膜、周围组织水肿为主，严重者将会引起疼痛、不规律性发热及皮肤黏膜症状等，影响患者正常生活与健康[2-4]。X线检查结合临床表现是类风湿性膝关节炎患者的常见诊断方法，由于X线检查具有一定的辐射性，膝关节炎患者的病变部位难以准确定位，从而使患者诊断依从性和耐受性差[5-6]。肌骨超声检查属于是一种新型的影像诊断技术，具有无创、价格低廉、操作灵活等优点，能够鉴别软组织、肌肉肿块、损伤。同时，肌骨超声能实时动态地观察膝关节肌腱、肌肉[7]。既往研究表明[8]：肌骨超声能较好地显示膝骨关节炎患者关节损伤，实现疾病的诊断与鉴别，但是该结论尚未证实。因此，本研究以风湿性膝关节炎患者为对象，探讨肌骨超声检查对风湿性膝关节炎患者中检出率及与膝关节功能的相关性，报道如下。
1. 资料与方法
1.1 临床资料
通过群抽样方法选择2019年5月1日至2020年3月1日风湿性膝关节炎患者（均为单膝患者）118例为对象，诊断标准：所有患者均符合2010年中国医学会风湿学分会制定的《类风湿关节炎诊断及治疗指南》相关标准[9]，均经影像学、血清学检查证实。纳入标准：（1）符合风湿性膝关节炎诊断标准，结合临床症状、X线检查确诊[10]；（2）所有患者均为单膝患病，临床多表现为关节屈伸不利、关节疼痛，具有确切的压痛点；（3）所有患者病历资料完整。排除标准：（1）合并精神异常、梅毒性神经病及急性创伤者；（2）代谢性骨病、哺乳期或妊娠期女性；（3）认知功能异常、银屑病或伴有强直性脊柱炎者。118例患者中，男69例，女49例，年龄（39～78）岁，平均（56.39±5.67）岁；病程（8～17）月，平均（11.59±2.13）月；体质量指数（BMI）（18-27）kg/m2，平均（23.23±3.26）kg/m2；患膝部位：左侧81例，右侧37例。
1.2 方法
1.2.1 X线及肌骨超声检查
（1）X线检查，所有患者均经临床表现结合X线检查确诊，检查时叮嘱患者保持站立位姿势，常规进行膝关节前后和侧面检查，并在患者屈膝90°、60°及30°状态下进行髌骨轴位X线检查；（2）肌骨超声检查，确诊前患者均拟行肌骨超声检查，具体方法如下：采用Philips-iu elite彩色多普勒超声诊断仪对患者进行检查，选择L12-5探头，频率为5～12 MHz。检查前向患者及家属讲解风湿性膝关节炎发病机制、临床表现及检查方法等，告知患者检查过程中需要配合以及注意事项，以提高患者检查依从性。患者取半卧位、坐位姿势，根据骨骼肌肉设置相应检查条件，充分暴露下肢，并保持患膝屈曲30° ～45°，肌骨超声探头纵横扫查膝关节外侧面、内侧面及前部。观察患者是否存在滑膜增生、髌上囊积液、韧带、肌腱、内侧半月板损伤等，并借助超声准确测量滑膜的厚度、髌上囊积液的深度，同时观察韧带、肌腱、内侧半月板损伤程度等。上述操作完毕后，指导患者调整屈曲角度45° ～60°或膝关节完全屈曲，观察关节内部回声及形态（包括：关节软骨、韧带、软骨下骨等）。最后，指导患者保持俯卧位姿势，完成患膝后区的横、纵向扫描，确定腘窝部位是是否存在囊肿，记录其超声征象。检查完毕后将肌骨超声检查结果与X线进行比较，分析肌骨超声在风湿性膝关节炎患者中的效能[11-12]。
1.2.2 膝关节功能评分及相关性
膝关节功能评估，采用Lysholm评分法对患者患肢与健侧肢膝关节功能进行评估，量表包括：膝关节跛行、承受能力、上下楼能力、下蹲起立、疼痛、关节肿痛及总分进行评估，分值越高，恢复效果越好[13]。
1.3 观察指标
（1）检出率，记录X线与肌骨超声在风湿性关节炎患者中的检出率，包括：滑膜增厚、髌上囊积液、关节软骨退变、关节间隙变窄、内侧半月板损伤退变、骨质疏松、韧带损伤、腘窝囊肿、软骨下骨破坏及骨质增生；（2）膝关节功能。记录风湿性膝关节炎患者健侧与患侧膝关节功能情况；（3）肌骨超声检查与膝关节总分情况。
1.4 统计学处理
采用SPSS23.0软件处理，计数资料行χ2检验，X线与肌骨超声征象等数据采用n（%）表示，所有数据均符合正态分布，膝关节功能评分、年龄等计量资料行配对t检验，用（
$ \bar x \pm s$ ）表示，采用Pearson相关性分析软件对肌骨超声检查结果与膝关节功能进行相关性分析，P < 0.05差异有统计学意义。2. 结果
2.1 X线与肌骨超声在风湿性关节炎患者中的检出率比较
肌骨超声检查滑膜增厚、关节软骨退变、髌上囊积液、内侧半月板损伤退变、腘窝囊肿、韧带损伤、软骨下骨破坏检出率高于X线（P < 0.05）；关节间隙变窄、骨质增生、骨质疏松检出率低于X线（P < 0.05），见表1。
表 1 X线与肌骨超声在风湿性关节炎患者中病变类型检出率比较[n（%）]Table 1. Comparison of X-ray and musculoskeletal ultrasound in the detection rate of disease types in patients with rheumatic arthritis [n （%）]病变类型 肌骨超声检查（n = 118） X线检查（n = 118） t P 滑膜增厚 92（77.97） 0（0.00） 6.291 0.021* 关节软骨退变 94（79.66） 0（0.00） 5.534 0.035* 髌上囊积液 104（91.53） 0（0.00） 7.883 0.021* 关节间隙变窄 76（64.41） 95（80.51） 6.092 0.019* 内侧半月板损伤退变 45（38.14） 0（0.00） 6.734 0.018* 骨质疏松 0（0.00） 64（54.24） 7.143 0.016* 腘窝囊肿 51（45.76） 0（0.00） 5.892 0.021* 韧带损伤 16（13.56） 0（0.00） 6.546 0.016* 软骨下骨破坏 63（53.39） 18（15.25） 7.214 0.011* 骨质增生 59（50.00） 92（77.97） 5.993 0.023* *P < 0.05。 2.2 风湿性膝关节炎患者健侧与患侧膝关节功能比较
风湿性膝关节炎患者患侧膝关节跛行、承受能力、上下楼能力、下蹲起立、疼痛、关节肿痛及总分均低于健侧（P < 0.05），见表2。
表 2 风湿性膝关节炎患者健侧与患侧膝关节功能比较[（$\bar x \pm s $ ）分]Table 2. Comparison of knee joint function between affected and unaffected side in patients with rheumatic arthritis [（$\bar x \pm s $ ）points]膝关节功能 患侧 健侧 t P 膝关节跛行 3.72 ± 0.32 4.23 ± 0.61 5.492 0.032* 承受能力 3.43 ± 0.26 3.76 ± 0.58 7.883 0.014* 上下楼能力 7.21 ± 0.84 7.71 ± 0.83 7.147 0.016* 下蹲起立 3.84 ± 0.47 4.87 ± 0.52 6.327 0.020* 疼痛 18.67 ± 3.23 21.67 ± 2.56 8.035 0.011* 关节肿痛 7.49 ± 1.42 7.99 ± 0.53 7.163 0.012* 总分 44.36 ± 5.93 50.23 ± 6.15 6.925 0.026* *P < 0.05。 2.3 肌骨超声检查与膝关节总分相关性
Pearson相关性分析结果表明：风湿性膝关节炎患者膝关节功能与骨质疏松检出率无相关性（P > 0.05）；与滑膜增厚、关节软骨退变、髌上囊积液、内侧半月板损伤退变、腘窝囊肿、韧带损伤、软骨下骨破坏及骨质增生、关节间隙变窄呈负相关性（P < 0.05），见表3。
表 3 肌骨超声检查与膝关节总分相关性（r，P）Table 3. Correlation between musculoskeletal ultrasonography and total score of knee joint （r，P）病变类型 r P 滑膜增厚 −0.784 0.021* 关节软骨退变 −0.851 0.015* 髌上囊积液 −0.745 0.018* 关节间隙变窄 −0.803 0.023* 内侧半月板损伤退变 −0.637 0.001* 骨质疏松 0.000 1.000 腘窝囊肿 −0.781 0.021* 韧带损伤 −0.833 0.025* 软骨下骨破坏 −0.675 0.021* 骨质增生 −0.782 0.018* *P < 0.05。 3. 讨论
风湿性膝关节炎是一种常见的急性或慢性结缔组织炎症。通常所说的风湿性关节炎是风湿热的主要表现之一，临床上以关节，肌肉疼痛，红肿及疼痛为特征。既往研究表明：风湿性关节炎的发生与A组乙型溶血性链球菌感染有关，且寒冷、潮湿等因素均能诱发疾病的发生、发展，患者发病后常伴有肢体功能障碍，影响患者正常生活及健康。因此，需要加强风湿性关节炎患者早期诊断和治疗对改善患者预后具有重要的意义。目前，临床上对于风湿性膝关节炎诊断方法较多，X线可以反映膝关节骨性结构的病理变化，并可以清晰显示关节的骨骼系统、髓质、骨皮质，能确定病灶组织的部位、大小，可为临床诊疗提供参考依据[14]。但是，X线不易显示膝关节软组织，再加上部分患者临床表现不明显，导致诊断存在一定局限性。近年来，肌骨超声已用于风湿性膝关节炎患者中，效果理想[15]。本研究中，肌骨超声检查滑膜增厚、关节软骨退变、髌上囊积液、内侧半月板损伤退变、腘窝囊肿、韧带损伤、软骨下骨破坏检出率高于X线（P < 0.05）；关节间隙变窄、骨质疏松、骨质增生检出率低于X线（P < 0.05），提示肌骨超声用于风湿性膝关节炎患者中能获得较高检出率，可为临床诊疗提供相应的参考依据。国内学者以风湿性关节炎患者作为对象，所有患者均经X线检查最终确诊，确诊前对患者分别行肌骨超声检查，结果表明：不同检查方法检出率比较无统计意义，但是后者检查对患者创伤更小，可重复性较强，能动态反映患者的疾病严重程度，可指导临床治疗，利于患者恢复。
肌骨超声属于一种新型的影像学诊断技术，具有良好的软组织鉴别能力，该项检查方法操作简便、无放射性、检查价格低，并可多次进行检查对比，易被患者及家属接受。对运动系统尤其是浅表组织的检查具有较高的分辨率，能实时显像，动态观察健侧与患侧情况[16]。同时，借助肌骨超声能观察病灶部位血流分布、变化情况，确定是否存在炎症表现及评估炎症反应的程度等。本研究中，风湿性膝关节炎患者患侧膝关节跛行、承受能力、上下楼能力、下蹲起立、疼痛、关节肿痛及总分均低于健侧（P < 0.05），说明风湿性膝关节炎患者常伴有关节功能异常。既往研究表明[17]：膝关节功能在一定程度上能反映患者的病情，而借助肌骨超声能及时发现膝关节的功能及结构的异常，便于医生了解患者疾病的真实情况。为了进一步分析肌骨超声检查结果与膝关节的关系，本研究中对二者进行了相关性分析，分析结果表明：风湿性膝关节炎患者膝关节功能与滑膜增厚、关节软骨退变、髌上囊积液、内侧半月板损伤退变、腘窝囊肿、韧带损伤、软骨下骨破坏及骨质增生、关节间隙变窄呈负相关性（P < 0.05）。因此，对于疑似风湿性膝关节炎患者，应在临床实践中加强其肌骨超声检查，以评估患者膝关节功能，并根据检查结果制定有针对性的个性化治疗计划以促进患者恢复。
综上所述，肌骨超声检查对风湿性膝关节炎患者的诊检出率较高，其检出结果在一定程度上与膝关节功能相关，可为临床诊断和治疗提供一定参考。
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图 1 不同浓度及不同作用时间的内毒素对hUC-MSCs增殖的影响
A：LPS不同浓度及不同作用时间hUC-MSCs增殖情况；B：不同浓度LPS作用24 h hUC-MSCs增殖情况；C：不同浓度LPS作用48 h hUC-MSCs增殖情况；D：不同浓度LPS作用72 h hUC-MSCs增殖情况。与对照组比较，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，****P < 0.0001。
Figure 1. Effects of endotoxin with different concentrations and different time on the proliferation of hUC-MSCs
图 2 LPS刺激后流式细胞技术检测hUC-MSCs细胞周期代表图例
A：不含LPS的对照组；B：LPS终浓度为0.098 EU/mL；C：LPS终浓度为1.56 EU/mL；D：LPS终浓度为25 EU/mL。
Figure 2. Cell cycle of hUC-MSCs tested by flow cytometry after LPS stimulation
图 3 不同浓度LPS作用72 h时hUC-MSCs细胞周期比例
与对照组比较，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，****P < 0.0001。
Figure 3. Proportion of hUC-MSCs cell cycle after 72 h of LPS with different concentrations
表 1 LPS不同浓度及不同作用时间hUC-MSCs吸光度（A）值（
$ \bar x \pm s $ ）Table 1. Absorbance （A） of hUC-MSCs at different dose-response and time-dependent of LPS （
$ \bar x \pm s $ ）组别 hUC-MSCs增殖 24 h 48 h 72 h 实验组1 0.571 ± 0.015* 0.811 ± 0.001* 1.321 ± 0.013* 实验组2 0.540 ± 0.025* 0.897 ± 0.030 1.346 ± 0.009* 实验组3 0.535 ± 0.002* 0.858 ± 0.011* 1.263 ± 0.026* 实验组4 0.433 ± 0.030* 0.871 ± 0.008 1.129 ± 0.003* 实验组5 0.552 ± 0.003* 0.865 ± 0.010* 1.037 ± 0.018* 实验组6 0.554 ± 0.003* 0.861 ± 0.020* 1.145 ± 0.038* 实验组7 0.547 ± 0.008* 0.865 ± 0.028* 1.018 ± 0.038* 实验组8 0.593 ± 0.005* 0.870 ± 0.012 1.049 ± 0.011* 实验组9 0.630 ± 0.003 0.853 ± 0.041* 1.063 ± 0.034* 实验组10 0.639 ± 0.007 0.933 ± 0.012 0.927 ± 0.027 对照组 0.660 ± 0.004 0.940 ± 0.020 0.906 ± 0.012 注：实验组1至10LPS终浓度依次为：0.098、0.195 、0.39 、0.78 、1.56 、3.12 、6.25 、12.5、25、50 EU/mL，表示分别在24 h、48 h、72 h时，与对照组相比，*P < 0.05。 
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表 2 LPS不同浓度及不同作用时间hUC-MSCs增殖率（%）
Table 2. Proliferation rates of hUC-MSCs at different dose-response and time-dependent of LPS （%）
时间 组1 组2 组3 组4 组5 组6 组7 组8 组9 组10 对照组 24 h 86.46 81.82 81.11 65.61 83.69 83.99 82.88 89.8 95.45 96.82 100.05 48 h 86.24 95.43 91.31 92.7 91.99 91.56 92.06 92.55 90.74 99.26 100 72 h 145.81 148.53 139.37 124.61 114.5 126.34 112.36 115.75 117.29 102.32 100 注：实验组1至10LPS终浓度依次为：0.098、0.195 、0.39 、0.78 、1.56 、3.12 、6.25 、12.5、25、50 EU/mL。
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表 3 LPS对hUC-MSCs细胞周期的影响（%）
Table 3. Effect of LPS on huc-Mscs cell cycle （%）
分期 实验组1 实验组2 实验组3 对照组 G0/G1期 94.240 ± 0.450* 96.210 ± 0.323* 96.330 ± 0.254* 97.550 ± 0.300 S期 2.880 ± 0.144* 3.310 ± 0.144* 3.060 ± 0.121* 1.900 ± 0.110 G2/M期 2.880 ± 0.248* 0.480 ± 0.064 0.610 ± 0.075 0.550 ± 0.075 注：实验组1、2、3的LPS终浓度分别为0.098 EU/mL、1.56 EU/mL、25 EU/mL，对照组不含LPS；与对照组相比，*P < 0.05。
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