Effect of Panax Noto-ginseng Saponins on the Proliferation of Human Stem Cells from Apical Papilla
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摘要:
目的 探究三七总皂苷（panax noto-ginseng saponins，PNS）对人根尖牙乳头干细胞（human stem cells from apical papilla, hSCAPs）增殖的影响。 方法 收集牙乳头组织、贴壁法分离培养原代细胞，流式细胞术鉴定hSCAPs表面标志物，诱导成骨及成脂鉴定hSCAPs多向分化潜能；配制25 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L的PNS培养基，CCK-8法检测不同浓度PNS下hSCAPs的增殖速率，流式细胞术检测最佳促进增殖组与对照组的细胞周期差异。 结果 原代分离培养成功的hSCAPs符合间充质干细胞来源，相关表面标记物高表达，可向成脂和成骨分化；与对照和其他实验组比较，25 mg/LPNS促进hSCAPs增殖效果最佳,差异具有统计学意义（P < 0.05）。 结论 25 mg/LPNS促进hSCAPs增殖能力的效果最佳，提示hSCAPs对PNS具有很强的敏感性。 Abstract:Objective To explore the effects of which Panax noto-ginseng saponins （PNS） influence the proliferation of human stem cells from apical papilla （hSCAPs）. Methods We collected apical papilla and separated primary cells with wall methods. Flow cytometry was used to identify the surface markers of hSCAPs, the multi-directional-differentiation potential of hSCAPs was identified by inducing bone and fat differentiation. PNS-culture-medium with 25 mg/L, 50 mg/L, 100 mg/L, and 200 mg /L was prepared, CCK-8 method was used to detect the proliferation rate of hSCAPs under different concentrations of PNS, and the changes of the cell cycle at the best proliferation concentration were observed. Results hSCAPs was cultivated successfully by primary separation and belong to the source of mesenchymal stem cells. The related surface markers were highly expressed and induced to fat differentiation and bone differentiation. Compared with the control and other experimental groups, PNS with 25 mg/L promoted highly hSCAPs proliferation. The difference was statistically significant （P < 0.05）. Conclusions PNS with 25 mg/L has the best effect for boosting hSCAPs proliferation abilities. It is prompted that hSCAPs has a strong sensitivity to PNS, that is, a low concentration can significantly promote the proliferation of hSCAPs. -
根尖牙乳头干细胞（stem cells from apical papilla，SCAPs）源自于根尖孔尚未闭合的恒牙牙根末端软组织，被发现含有一群大量未分化的细胞并且证实属于间充质干细胞来源，因为hSCAPs同样能够自体更新、增殖以及多系分化。而且被视作是口腔再生医学疗法更具前景和优势的一类牙源性干细胞[1-4]。三七是一味传统中药，主要成分为三七总皂苷（Panax notoginseng saponins，PNS），临床上可治疗全身系统的多种疾病。多年来研究发现PNS具有抗癌、降脂、保护神经元与内皮细胞、促进骨损伤修复以及抗纤维化等作用，而且PNS对多种细胞的增殖都有积极的作用[5-7]。但关于PNS对hSCAPs增殖的影响尚未见报道。因此，设计本实验初步探究PNS对hSCAPs增殖的影响，进一步拓展PNS的药用价值，以期为hSCAPs治疗口腔硬组织缺损疾病等提供研究基础。
1. 材料与方法
1.1 主要试剂与仪器
0.25%胰蛋白酶（BI，德国）；磷酸盐缓冲液（PBS，索莱宝）；α-MEM培养基（Gibco，美国）；胎牛血清（BI，德国）；CCK-8 （Proteintech，美国）；Human MSC Analysis Kit （BD，美国）；Human MesenCult™ Osteogenic Differentiation Kit （Stemcell，加拿大）；Human MesenCult™ Adipogenic Differentiation Kit （Stemcell，加拿大）；三七总皂苷（索莱宝）；茜素红（索莱宝）；油红O（索莱宝）；细胞周期和细胞凋亡检测试剂盒（碧云天）；酶联免疫检测仪（Thermo，美国）；流氏细胞仪（BD，美国）。
1.2 hSCAPs的分离、培养及鉴定
经昆明医科大学附属延安医院伦理委员会审批通过，患者监护人签字同意，在口腔外科收集新鲜拔除、无牙体牙髓及牙周疾病且根尖未发育完全的第3磨牙。迅速用含2%双抗的α-MEM培养基保存放入冰盒中，随即在细胞工作间中处理标本。用含2%双抗PBS冲洗彻底清除血凝块并刮除根面软组织，切取根尖牙乳头放入培养皿中，眼科剪和镊子配合下将组织剪成微小的组织块，分散组织块倒置放入37 ℃细胞培养箱中温育15 min，加入含20%FBS的培养基，动作轻柔勿使组织块浮起，每3 d换液，待细胞大量爬出后消化细胞传代扩大培养。
流式细胞术鉴定：取第4代hSCAPs消化、离心，PBS重悬，制备成单细胞悬液计数备用。以每管5×105个细胞数加入流式管内，根据试剂操作说明，加入CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR、CD73、CD90、CD105抗体，避光孵育 30 min。加入鞘液清洗一遍，弃上清，然后加入 200～300 µL的鞘液上机，检测细胞表面抗原，进行免疫表型分析。
1.3 hSCAPs成骨、成脂向分化
取第4代hSCAPs，每孔5×105个细胞接种于6孔板内，待细胞融合在80%以上时更换成骨诱导液和成脂诱导液，对照组正常培养，连续培养3周后吸弃培养基并用PBS漂洗，加入70%乙醇固定细胞2 h，PBS洗3遍，加入茜素红和油红O 染色5 min，倒置显微镜下观察染色的面积大小以及颜色深浅。
1.4 CCK-8检测不同浓度PNS对hSCAPs增殖能力的影响
将10 mg PNS溶于10 mL完全培养基配制浓度为1 mg/mL的PNS母液，将培养基稀释为25 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L，未加PNS为空白对照组。取第3代细胞按每孔2000个细胞数接种于96孔板，每组设置6个复孔，α-MEM培养基培养5 h，待细胞基本贴壁后，实验组更换含不同浓度的PNS培养液，对照组正常培养，2 d换液。在第l、3、5、7天固定时间取出一板细胞，PBS漂洗两次，CCK-8液与培养基按照1∶9配制，每孔加入100 μL孵育液， 37 ℃避光孵育2 h，酶标仪450 nm波长下检测OD值，绘制hSCAPs的增殖曲线。
1.5 最适浓度下检测PNS对细胞周期的影响
标准条件下用6孔板培养对照组和25 mg/L组，第4天时用胰酶消化细胞并收集到离心管内，1000 g离心5 min后弃液，加入1 mL预冷的PBS混匀细胞后转移至1.5 mL离心管。第2次离心弃液，加入1 mL预冷的70%乙醇混匀细胞，4 ℃条件下充分固定12 h。第3次离心弃液，加入1 mL预冷的PBS重悬细胞。最后一次离心，弃上清。按照试剂盒操作流程配制碘化丙啶染色液，每管加入0.5 mL碘化丙啶染色液，缓慢吹打充分混匀转移至流式管中。37 ℃避光温浴30 min后上机检测，488 nm激发波长处检测红色荧光。流式图采用modfit软件分析。
1.6 统计学处理
所有数据应用SPSS24.0软件分析。计量资料用（
$\bar x \pm s $ ）表示，采用单因素方差分析，组间两两比较方差齐者用 LSD 检验，方差不齐者用 Tamhane T2 检验。P < 0.05为差异有统计学意义，Graphpad Prism6作图。2. 结果
2.1 hSCAPs的培养及多向分化能力鉴定
根尖牙乳头组织采用组织块法贴壁培养5 d后镜下可见类成纤维样的细胞沿着组织块边缘呈放射状爬出（图1A），传代后细胞生长速度加快（图1B）。细胞连续诱导成骨3周后茜素红染色后可见大量明显红色的颗粒（图1C），对照组则无红色的颗粒（图1D）。细胞向成脂诱导3周后油红O染色后可见有脂滴被染红（图1E），对照组则未见染红的脂滴（图1F）。表明hSCAPs具有多向分化潜能，属于间充质干细胞来源。
图 1 hSCAPs的培养及多向分化能力鉴定A：hSCAPs原代细胞；B：细胞传代培养；C：hSCAPs成骨诱导后茜素红染色；D：hSCAPs成骨对照组茜素红染色；E：hSCAPs成脂诱导后油红O染色；F：hSCAPs成脂对照组油红O染色。Figure 1. Culture of hSCAPs and identification of multi -directional differentiation ability2.2 hSCAPs表面标记物的检测
流式细胞术检测显示间充质干细胞表面标志物CD73占99.03%，CD90占99.94%、CD105占99.47%，均呈阳性高表达，而造血细胞标记物CD34、CD45以及免疫细胞表面标记物CD19、CD11b、HLA-DR则呈阴性（0.77%），证明属于间充质干细胞家族，排除造血来源的干细胞（图2）。
图 2 hSCAPs流式细胞鉴定结果注：CD73 、CD90 和CD105均为间充质干细胞表面标志物，流式结果显示均阳性高表达，CD34、CD45为造血细胞标记物，CD19、CD11b、HLA-DR是免疫细胞表面标记物均呈呈阴性。Figure 2. Identification of hSCAPs surface antigen by flow cytometry2.3 PNS对hSCAPs增殖的影响
CCK-8检测OD值（
$\bar x \pm s $ ）见表1和图3。在第1天时实验组hSCAPs的增殖均显示低于对照组，而从第3天开始25 mg/L和50 mg/L 2组OD值均比对照组高（P < 0.05）。其中25 mg/L 组从第3天到第9天的OD值都显著高于对照组（P < 0.05），50 mg/L组低于25 mg/L 组。但100 mg/L和200 mg/L 2组OD值则从第1天开始低于对照组（P < 0.05）。结果说明PNS浓度低时可以促进hSCAPs增殖，而PNS浓度高时则抑制了hSCAPs的增殖。表 1 不同浓度PNS下hSCAPs增殖的差异Table 1. Differences in HSCAPS proliferation under different concentrations of PNSOD 值， $ \stackrel{-}{X} $ ± S组别 第1天 第3天 第5天 第7天 第9天 对照组 0.199 ± 0.005 0.275 ± 0.005 0.731 ± 0.006 0.984 ± 0.023 1.975 ± 0.062 25 mg/L 0.126 ± 0.006* 0.442 ± 0.01* 1.385 ± 0.067* 1.549 ± 0.017* 2.784 ± 0.057* 50 mg/L 0.075 ± 0.005*# 0.407 ± 0.011*# 1.058 ± 0.007*# 1.146 ± 0.016*# 2.443 ± 0.015*# 100 mg/L 0.044 ± 0.003*#& 0.245 ± 0.009*#& 0.213 ± 0.009*#& 0.187 ± 0.003*#& 0.158 ± 0.007*#& 200 mg/L 0.024 ± 0.002*#&△ 0.192 ± 0.003*#&△ 0.168 ± 0.005*#&△ 0.126 ± 0.003*#&△ 0.079 ± 0.013*#&△ F 490.006 358.621 598.128 3 552.492 2 174.635 P 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 与对照组比较，*P < 0.05；实验组两两比较，与25 mg/L组比较，#P < 0.05；与50 mg/L组比较，&P < 0.05；与100 mg/L组比较，△P < 0.05。 
图 3 不同浓度PNS下hSCAPs的生长曲线Figure 3. The growth curve of hSCAPs under different concentrations of PNS2.4 PNS对hSCAPs周期的影响
25 mg/L组的细胞和空白对照组进行的细胞增殖指数（proliferation Index，PI）分析。PI = G2/M + S，对照组PI = 5.82% + 5.43% = 11.25%（图4），25 mg/L组PI = 12.17% + 3.46% = 15.63%（图5），且P < 0.05，差异有统计学意义，见图6。进一步证明25 mg/L的PNS显著促进hSCAPs的增殖。
3. 讨论
口腔门诊中存在着大量颌面骨组织缺损的患者，对患者的生理功能和美观功能影响极大，甚至危害全身生理健康和心理健康[8]。目前临床主流的诊疗手段难以完美恢复缺损组织的生理功能。组织工程以间充质干细胞为中心要素，其研究和发展正方兴未艾，是一种新兴的治疗手段。hSCAPs属较晚发现的牙源性干细胞，其增殖速度快、分化能力强且在不同的诱导分化条件下能够向成骨细胞、成牙本质细胞、神经细胞、脂肪细胞、软骨细胞和肝细胞等分化[1, 3]。课题组自行分离培养的原代细胞经过流式细胞检测以及多向分化能力鉴定，具有间充质干细胞的生物学特性，而且增殖和分化能力强，可作为种子细胞进行后续实验。有报道称hSCAPs的增殖速率、迁移能力和多向分化能力较同一牙齿来源的牙髓干细胞（dental pulp stem cells，DPSCs）和牙周膜干细胞明显更强，hSCAPs抵抗感染的能力更强，还能够保留一部分活性[9-10]。因此，hSCAPs可作为颌面骨缺损骨组织再生治疗具有巨大潜力的干细胞。
干细胞治疗领域的文献表明，单纯将干细胞移植到损伤组织中，由于移植细胞的存活能力差，再生活性降低，治疗效果较差。因此提高移植干细胞的细胞活力、分化和治疗效果是一个棘手的问题[11-12]。PNS被广泛应用于临床，在心脑血管疾病、骨关节疾病上具有良好的疗效，研究发现PNS可以对多种干细胞的增殖起到积极的作用。PNS在适宜浓度下能够促进大鼠BMSCs的增殖，同时VEGFmRNA的表达和分泌升高[13]。另外，PNS还可以上调VEGF、bFGF、VE-钙粘蛋白、WNT3a、β-连环蛋白和 TCF4 mRNA的表达，促进内皮祖细胞增殖和血管形成[14]。同时，PNS还可以上调抗凋亡基因Bcl-2和Bcl-xl的表达，降低 Bax/Bcl-2比值，从而抑制大鼠BMSCs的凋亡[15]。
本实验研究发现在第1天时三七总皂苷对于hSCAPs的增殖均显示具有一定的抑制作用，说明hSCAPs对外源性的物质需要一个适应的过程。而从第3天开始25 mg/L和50 mg/L 2组对于hSCAPs均有明显的促进作用，呈指数生长，第5天以后生长逐渐达到平台期，第7天以后又开始进入下个增殖周期。但25 mg/L组的促进增殖作用更加明显。而在100 mg/L组和200 mg/L组则发现在3 d内细胞数目有增多，而在3 d以后细胞的增殖被抑制，镜下观察发现细胞数目逐渐变少，时间越长则死亡的细胞越多，说明高浓度的PNS不仅抑制细胞增殖，更可以促进细胞的死亡。
细胞周期是一次细胞分裂的完整历程，包括细胞间期（G0期、G1期、S期、G2期）和细胞分裂期（M期）[16]。由于G0和G1期时DNA含量均保持二倍体状态，所以G0与G1期难以区分。S期是整个细胞周期中功能最为活跃的阶段， DNA开始合成含量增加，处于G1期和G2期的过渡阶段，还有合成DNA所需要的各种蛋白和酶参与到此阶段。G2期是DNA合成后期，介于S期和M期的之间，G2期与M期DNA均是四倍体状态，因此无法在DNA含量上直接区分。G1到S和G2到M是最为重要的两个阶段，因其DNA含量变化，所以S期和G2/M期也被视作细胞增殖的标志[17]。因为此时分子水平变化非常活跃且复杂，外界环境条件的改变非常容易影响细胞的增殖状态，若能够给与适当的干预措施，则对于调控细胞的生长与增殖周期具有非常积极的生理意义[18-19]。经流式细胞分析后显示，25 mg/L组处于S期和G2/M期的细胞数占比明显高于对照组，进一步说明PNS浓度为25 mg/L时可以显著促进细胞增殖的生长，三七作为常见且经济的药物，其药理作用对于组织工程具有积极的意义。
综上所述，hSCAPs作为一类生长能力强的干细胞，状态可能更为接近原始干细胞，相对脆弱，对于PNS具有很高的敏感性，即25 mg/L的浓度即可以显著促进hSCAPs的增殖和分化。三七作为一种已经成熟使用的药物，安全性得以保证，hSCAPs作为良好的种子细胞显示出很大的临床应用前景。但是本实验仅是初步探明了PNS对hSCAPs具有显著的促进增殖作用，对于其具体的机制以及对细胞凋亡的影响需要进一步探究。
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图 1 hSCAPs的培养及多向分化能力鉴定
A：hSCAPs原代细胞；B：细胞传代培养；C：hSCAPs成骨诱导后茜素红染色；D：hSCAPs成骨对照组茜素红染色；E：hSCAPs成脂诱导后油红O染色；F：hSCAPs成脂对照组油红O染色。
Figure 1. Culture of hSCAPs and identification of multi -directional differentiation ability
图 2 hSCAPs流式细胞鉴定结果
注：CD73 、CD90 和CD105均为间充质干细胞表面标志物，流式结果显示均阳性高表达，CD34、CD45为造血细胞标记物，CD19、CD11b、HLA-DR是免疫细胞表面标记物均呈呈阴性。
Figure 2. Identification of hSCAPs surface antigen by flow cytometry
图 3 不同浓度PNS下hSCAPs的生长曲线
Figure 3. The growth curve of hSCAPs under different concentrations of PNS
表 1 不同浓度PNS下hSCAPs增殖的差异
Table 1. Differences in HSCAPS proliferation under different concentrations of PNS
OD 值， $ \stackrel{-}{X} $ ± S组别 第1天 第3天 第5天 第7天 第9天 对照组 0.199 ± 0.005 0.275 ± 0.005 0.731 ± 0.006 0.984 ± 0.023 1.975 ± 0.062 25 mg/L 0.126 ± 0.006* 0.442 ± 0.01* 1.385 ± 0.067* 1.549 ± 0.017* 2.784 ± 0.057* 50 mg/L 0.075 ± 0.005*# 0.407 ± 0.011*# 1.058 ± 0.007*# 1.146 ± 0.016*# 2.443 ± 0.015*# 100 mg/L 0.044 ± 0.003*#& 0.245 ± 0.009*#& 0.213 ± 0.009*#& 0.187 ± 0.003*#& 0.158 ± 0.007*#& 200 mg/L 0.024 ± 0.002*#&△ 0.192 ± 0.003*#&△ 0.168 ± 0.005*#&△ 0.126 ± 0.003*#&△ 0.079 ± 0.013*#&△ F 490.006 358.621 598.128 3 552.492 2 174.635 P 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 与对照组比较，*P < 0.05；实验组两两比较，与25 mg/L组比较，#P < 0.05；与50 mg/L组比较，&P < 0.05；与100 mg/L组比较，△P < 0.05。 
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