Effects of Puerarin on Th17/Treg Cell Immune Homeostasis and the Expression of Related Transcription Factors in Rats with Periodontitis
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摘要:
目的 探究葛根素对牙周炎大鼠辅助性 T 细胞 17（ T helper cell 17,Th17） /调节性 T 细胞 （Regulatory T cell, Treg） 免疫平衡及相关转录因子的影响。 方法 采用分离牙龈、丝线结扎配合龈下注射大肠杆菌内毒素（E-LPS）法建立大鼠牙周炎模型。将大鼠随机分为正常对照组（A组）、牙周炎模型组（B组）、200 mg/（kg·d）葛根素组（C组）。HE 染色观察牙周组织病理形态学变化。通过Micro-CT对骨生物学参数定量分析牙槽骨吸收情况。流式细胞术、免疫印迹法（western blot，WB） 分别检测牙周组织中 Th17、Treg 细胞比例、白介素-17（ IL-17） 、视黄酸相关孤儿受体（ RORγt） 、IL-10、叉头状转录因子-3（ Foxp3） 蛋白表达。 结果 HE染色中葛根素组大鼠牙根部可见明显新生骨细胞增生，牙周膜可见少量炎症细胞聚集，牙槽骨结构较整齐。Micro-CT显示治疗组大鼠牙槽骨较模型组骨量略有下降，骨质量及强度有所上升。流式细胞术检测全血细胞发现葛根素组的TH17、Treg细胞比例均下降，且TH17/Treg的细胞比例也下降。 IL-10、Foxp3在葛根素组蛋白表达量上调，而IL-17、RORγt在葛根素组蛋白表达量下调，差异有统计学意义（P < 0.05）。 结论 葛根素可缓解牙周炎大鼠牙周组织炎性反应、牙槽骨吸收，通过调节Th17 /Treg 细胞及相关转录因子的表达，使Th17 /Treg 细胞免疫平衡轴往有利于牙周组织愈合方向发展，其作用机制可能与葛根素有效调节Th17 /Treg细胞免疫平衡轴有关。 Abstract:Objective To study the effects of puerarin on the immune homeostasis of T helper 17 （Th17）/regulatory T （Treg） cells and the expression of related transcription factors in rats with periodontitis. Methods A rat periodontitis model was established using gingival isolation, silk ligature application and subgingival injection of Escherichia coli endotoxin （E-LPS）. The rats were randomly divided into a normal control group （group A）, a periodontitis model group （group B）, and a 200 mg/（kg-d） puerarin group （group C）. HE staining was used to observe the changes of periodontal tissue. Micro-ct correlated bone indexes were also analyzed to quantify the resorption of alveolar bone. The percentages of Th17 and Treg cells and the expression of interleukin （IL）-17, retinoic acid-related orphan receptor gamma t （RORγt）, IL-10 and forkhead transcription factor-3 （Foxp3）in periodontal tissues were monitored by flow Cytometry and Western blot （WB）, respectively. Results In the study, the roots of the teeth in the puerarin group were significantly proliferated with new osteoblasts. Flow cytometry showed that the proportion of TH17 and Treg cells in the puerarin group decreased, and the proportion of TH17/Treg cells also decreased . The protein expressions of IL-10 and Foxp3 were up-regulated in puerarin, while the histone expressions of IL-17 and RORγt were down-regulated in puerarin （P < 0.05）. Conclusions Puerarin can alleviate the periodontal tissue inflammatory response and alveolar bone resorption in rats with periodontitis and favor periodontal tissue healing by regulating Th17/Treg cell immune homeostasis and the expression of related transcription factors. The mechanism of action may be related to effective regulation of Th17/Treg cell immune homeostasis by puerarin. -
Key words:
- Puerarin /
- Periodontitis /
- Rats /
- Helper T cells /
- Regulatory T cells
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人群中甲腺结节的检出率高达 67%，其中恶性结节占比约 5%～15%[1-2]。多个国家的指南均认为术前对甲状腺结节良恶性的初步判定会极大地影响手术方案的制定。超声引导下细针穿刺活检术（US-FNAB）便捷易行，准确性较高，是目前常被采用的术前“确诊”方式。但受取材人员的操作手法及经验影响，术前的细胞学结果参差不齐。外科医师很难将其作为一类证据采用，尤其对于临床初诊为高风险恶性，而FNA结果为良性的患者是否需行手术治疗。因此，本研究将指南推荐的不同穿刺进针角度、取材手法及基于笔者经验的操作细节改善进行两两组合，回顾性分析其优缺点，发掘细节，总结经验。
1. 对象与方法
1.1 对象
收集2018年1月至2020年1月间在昆明医科大学第一附属医院行甲状腺超声检查，评估为TI-RADS-4类及以上结节，同时进行了US-FNA术前评估及手术治疗的1903例患者资料。其中男性381例，女性1 522例，年龄 15～82岁，平均（50±13） 岁。
1.2 纳入标准
超声扫查规范及结节评价以最新版国际甲状腺结界ATA指南为标准[3]。笔者纳入至少包含TI-RADS-4类及以上的结节数据进行对比，其特征包含以下至少2种：（1）实性；（2）低回声/极低回声；（3） 边界模糊/微分叶；（4）微钙化；（5）纵横比 > 1。
1.3 分组方式
将上述患者资料根据穿刺时进针角度及取材手法两两组合后共分为6类：A1、A2、A3、B1、B2、B3。其中，以我国《超声引导下甲状腺结节细针穿刺细胞学检查实践指南（2019版） [7]穿刺入路分为A、B两类，A类：端侧式入路，穿刺针平面与探头长轴切面无夹角，即穿刺针的整个路径始终与探头长轴切面位于同一平面，超声图像始终能完全显示整个针的路径（平面内，图4a、4b）；B类：边侧式入路，穿刺针平面与探头长轴切面存在夹角，即穿刺针的路径仅能部分与探头长轴重合，超声图像仅能显示部分针体或针尖（平面外，图5a）。按2019年指南推荐的取材手法分为3类，1类：抽吸法，穿刺针连接注射器，在进入结节后，保持一定的负压以吸取更多细胞；2类：非抽吸法，穿刺针不连接注射器，以保持针腔内外气压一致；3类：闭压进出法：笔者在指南推荐的2类非注射器抽吸取材手法的基础上进行优化，同2类相似，不连接注射器，进针时用手指堵住针尾，保持针腔内有一定气压，至针尖进入取材区时松开，取材结束后再次堵住针尾并退针（图6c）。
图 4 A 系列端侧式进针入路（a）及声像示意图（b）Figure 4. A-series end-to-side needle entry path a and audio-visual diagram b
图 5 B 系列边侧式进针入路（a1、a2）及声像示意图（b）Figure 5. Schematic diagram of B-series side needle entry routes a1，a2 and audio-visual b1.4 方法
使用GE Logiq S8彩色多普勒超声诊断仪，二维评估选择线阵高频探头甲状腺模式（频率为12 MHz），FNA穿刺选择GE探头甲状腺穿刺模式（频率为12 MHz）。术前行血常规、凝血功能及空腹血糖检测，并排除存在利多卡因过敏史、严重心脑血管疾病史。穿刺时患者取仰卧位，肩下垫小枕充分暴露甲状腺区。避开大血管、神经规划好最佳穿刺路径，常规消毒铺巾，采用2％利多卡因局部麻醉。在超声引导下，使用23G×50～100 mm针进行穿刺取材。穿刺的速度、幅度及穿刺的针数笔者严格遵循2019指南操作规范。使用推片涂片法现场制作细胞学涂片并快速送至病理科行相关细胞学检测。
1.5 细胞学评估结果分类
综合ATA、NCCN、ESMO指南给出的分类及后续治疗意见，笔者将FNA细胞学结果归为3大类：（1）良性病变；（2）意义不明确的细胞非典型性病变或滤泡性病变；（3）恶性病变及可疑恶性病变。
1.6 统计学处理
采用SPSSAUv20.0软件对数据进行分析，计算6种分组的灵敏度、特异度、准确度、阳性预测率、阴性预测率、约登指数（以恶性及可疑恶性定义为阳性结果，良性定义为阴性结果进行二分类计算）。对介于良恶性之间的非典型病变则纳入配对卡方检验（Bowker检验）及Kappa一致性检验进行三分类计算。同时，考虑到回顾性分析中每组样本数量的不同，因此根据6组例数的比例差异对上述两种检验采取加权计算。最终评价不同方法的真实性。P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 6类分组的FNA细胞学结果与切除术后组织病理学结果
A1组：共307例，FNA细胞学良性130例，其中13例手术组织病理学诊断为恶性/可疑恶性；20例FNA细胞学为非典型病变，其中1例术后组织学病理为恶性/可疑恶性；157例FNA学细胞学为恶性/可疑恶性，与术后组织学病理全符合，见表1，表2。
表 1 6个组的FNA与病理学结果符合度及对应的kappa一致性检验和常规的评价指标数值（n）（1）Table 1. Consistency for FNA and pathology of six groups and values of corresponding Kappa Consistency Tests （Linear Weighted） and conventional evaluation indicators （n）（1）组别 FNA结果 病理结果（n） 总计 Kappa值 良性 非典型病变 恶性/可疑恶性 A1 良性 117 0 13 130 0.91
P = 0.000**非典型病变 0 19 1 20 恶性/可疑恶性 0 0 157 157 总计 117 19 171 307 A2 良性 128 1 15 144 0.904
P = 0.000**非典型病变 0 23 1 24 恶性/可疑恶性 0 0 173 173 总计 128 24 189 341 A3 良性 132 1 6 139 0.959
P = 0.000**非典型病变 0 17 0 17 恶性/可疑恶性 0 0 164 164 总计 132 18 170 320 B1 良性 98 1 22 121 0.845
P = 0.000**非典型病变 0 29 2 31 恶性/可疑恶性 0 0 169 169 总计 98 30 193 321 B2 良性 88 1 24 113 0.821
P = 0.000**非典型病变 0 21 2 23 恶性/可疑恶性 0 0 171 171 总计 88 22 197 307 B3 良性 87 1 20 108 0.852
P = 0.000**非典型病变 0 31 1 32 恶性/可疑恶性 0 0 167 167 总计 87 32 188 307 **P < 0.01。 表 1 6个组的FNA与病理学结果符合度及对应的kappa一致性检验和常规的评价指标数值（%）（2）Table 1. Consistency for FNA and pathology of six groups and values of corresponding Kappa Consistency Tests （Linear Weighted） and conventional evaluation indicators （%）（2）灵敏度 特异度 准确度 阳性预测值 阴性预测值 约登指数 92.35 100.00 95.47 100.00 90.00 92.35 92.02 100.00 94.95 100.00 89.51 92.02 96.47 100.00 97.69 100.00 95.65 96.47 88.48 100.00 92.07 100.00 81.67 88.48 87.69 100.00 91.20 100.00 78.57 87.69 89.30 100.00 92.36 100.00 81.31 89.30 A2组：共341例，FNA细胞学良性144例，其中15例手术组织病理学诊断为恶性/可疑恶性，1例为非典型病变；24例FNA细胞学为非典型病变，其中1例术后组织学病理为恶性/可疑恶性；173例FNA学细胞学为恶性/可疑恶性，与术后组织学病理全符合。
A3组：共320例，FNA细胞学良性139例，其中6例手术组织病理学诊断为恶性/可疑恶性，1例为非典型病变；17例FNA细胞学为非典型病变，与术后组织学病理完全符合；164例FNA学细胞学为恶性/可疑恶性，与术后组织学病理全符合。
B1组：共321例，FNA细胞学良性121例，其中22例手术组织病理学诊断为恶性/可疑恶性，1例为非典型病变；31例FNA细胞学为非典型病变，其中2例术后组织学病理为恶性/可疑恶性；169例FNA学细胞学为恶性/可疑恶性，术后组织学病理全符合。
B2组：共307例，FNA细胞学良性113例，其中24例手术组织病理学诊断为恶性/可疑恶性，1例为非典型病变；23例FNA细胞学为非典型病变，其中2例术后组织学病理为恶性/可疑恶性；171例FNA学细胞学为恶性/可疑恶性，术后组织学病理全符合。
B3组：共307例，FNA细胞学良性108例，其中20例手术组织病理学诊断为恶性/可疑恶性，1例为非典型病变；32例FNA细胞学为非典型病变，其中1例术后组织学病理为恶性/可疑恶性；167例FNA学细胞学为恶性/可疑恶性，术后组织学病理全符合。
2.2 常规评价参数结果
灵敏度：A类分组，即端侧式入路组高于B类边侧式入路分组。A3组最高，为96.47%，最低为B2组87.69%，见图1。特异度：均为100%。准确度：A类分组高于B类分组，最高为A3组97.69%，最低为B2组 91.20%。阳性预测率：均为100%。阴性预测率：A类分组高于B类分组，最高为A3组95.65%，最低为B2组78.57%。约登指数：A类分组高于B类分组，最高为A3组96.47%，最低为B2组87.69%。
2.3 6类分组与术后组织学病理
配对卡方检验（Bowker加权检验）及Kappa一致性检验（线性加权）结果见表2、图2，图3。
表 2 6个组的FNA与病理学结果符合度及配对卡方检验（Bowker加权检验）结果（n）Table 2. Consistency for FNA and pathology of six groups and values of corresponding Chi-Square Test （Bowker Weighted Test）（n）组别 FNA结果 病理结果 总计 χ P 良性 非典型病变 恶性/可疑恶性 A1 良性 117 0 13 130 14 0.003** 非典型病变 0 19 1 20 恶性/可疑恶性 0 0 157 157 总计 117 19 171 307 A2 良性 128 1 15 144 17 0.001** 非典型病变 0 23 1 24 恶性/可疑恶性 0 0 173 173 总计 128 24 189 341 A3 良性 132 1 6 139 7 0.072** 非典型病变 0 17 0 17 恶性/可疑恶性 0 0 164 164 总计 132 18 170 320 B1 良性 98 1 22 121 25 0.000** 非典型病变 0 29 2 31 恶性/可疑恶性 0 0 169 169 总计 98 30 193 321 B2 良性 88 1 24 113 27 0.000** 非典型病变 0 21 2 23 恶性/可疑恶性 0 0 171 171 总计 88 22 197 307 B3 良性 87 1 20 108 22 0.000** 非典型病变 0 31 1 32 恶性/可疑恶性 0 0 167 167 总计 87 32 188 307 **P < 0.01。 
图 3 各组Kappa值比较Figure 3. Comparison of Kappa Consistency Tests （Linear Weighted） for six groups6类分组与术后组织病理学Bowker加权检验结果：P值由高至低排列为：A3 > A1 > A2 > B3 = B1 = B2；A1、A2、B1、B2、B3组P < 0.01，与术后组织病理学结果有显著统计学差异;A3组P值最高，为0.072，P > 0.05，与术后组织病理学结果无统计学差异。
6类分组与术后组织学病理Kappa一致性检验（线性加权）结果：A3 > A1 > A2 > B3 > B1 > B2；A3组最高，为0.959，最低为B2组为0.821。
3. 讨论
甲状腺结节细针穿刺活检（fine-needle aspiration biopsy，FNA）是一种安全、便捷的术前细胞学 “确诊”方法。并被美国甲状腺协会（ATA）2015版[4]、欧洲肿瘤内科学会（ESMO）2019版[5]、 美国国家综合癌症网络（NCCN）2020版[6]及我国超声引导下甲状腺结节细针穿刺细胞学检查实践2019版[7]的指南公认为术前甲状腺结节良恶性鉴别最准确的方法并定义为在甲状腺手术策略制定中的首选及重要依据。回顾文献可发现：引导方式、操作手法、细胞学分析水平等多个因素会对其诊断准确性有较大影响[8-11]。因此，基于指南推荐的2种引导方式和2类操作手法，及笔者对操作细节的改进，共将其分为6组进行评估。在使用灵敏度，特异度等传统指标对比几种方式与金标准的符合情况评价时，笔者仅能采用真阳性、真阴性的例数进行计算，但病理结果中常存在第三种可能——非典型病变，即介于阳性与阴性之间，即使病理金标准也无法明确将其划定阴阳性的情况。为了方便计算，笔者将不确定的直接忽略或将其归为真阳性或真阴性组（仅能进行2×2计算，而不能进行3×3运算）。本次6种分组的特异度及阳性预测率均100%，其原因在于FNA结果为阳性患者均接受了进一步手术切除，术后病理结果也肯定为阳性，因此该两项传统指标毫无作用。综上所述，由于计算方式的缺陷，本次的灵敏度、准确度、阴性预测值、约登指数只能选择忽略非典型病变的数据，而表一、二中的非典型病变病例中明显是存在漏诊的。所以，传统指标在评估存在非典型病变情况的甲状腺相关研究中确实不严谨。当然，也可以使用约登指数来评价，但该指标也是通过灵敏度与特异度计算而来，同样不准确。
考虑到每个分组中的病例数比例的差异，笔者使用了配对卡方检验中的Bowker加权检验[12]和一致性检验中的Kappa线性加权检验[13]以更客观、更精准的指标分别评价各不同分组与术后病理金标准的差异性和一致性。可以看到，表1及图2中Bowker检验除A3组P值大于0.05，其余组P值均小于0.05。P值 > 0.05表明两组比较不存在差异，P值 < 0.05代表两组比较存在差异，即A1、A2、B1、B2、B3组FNA细胞学结果与术后组织病理结果存在差异，而A3组FNA细胞学结果与术后组织病理结果不存在差异，也就是说A3组的细胞学检测结果与术后组织病理结果符合度非常高，统计学上不存在差异。当然，从数值上我们可以看到P值 = 0.072，很接近0.05，但A3组明显优于其他组。
病理结果良性与恶性/可疑恶性之间的距离要远于良性与非典型病变之间的距离，加之每组病例比例的不同，笔者采取Kappa检验中的线性加权进行计算。结果中， A3组系数0.959为最高， B2组系数0.821为最低。Kappa系数值越大，一致性越高，系数介于0.6～0.8之间表明一致性较强，介于0.8～1.0之间表明一致性很强。本次分析中，A3组的一致性结果也是最佳的。
上述结果表明，A系列分组与术后组织病理结果的差异更小、一致性更高，尤其是A3组几乎与组织病理学不存在差异，符合度较高。换句话说，2019穿刺指南推荐的两种穿刺界面选择中，分组为A系列的端侧式入路是优于分组为B系列的边侧式入路的。经笔者总结经验、改进细节后使用的3系列闭压进出法优于指南提供的抽吸法和非抽吸法。
笔者合统计学结果来剖析这6种分组的优缺点：（1）、A系列能始终显示出整个穿刺针的实时位置情况，尤其是能确认针尖取材区与瘤体的关系（图4），即能保证取材区在瘤体内；（2）、B系列的两种探头放置方式尽管能显示出瘤体的范围，但由于穿刺针时短轴入路，即仅有针体或针头能在声像图中被分别捕捉到。此时很难保证声像图中的强回声点管始终为针尖，也许针尖取材区已超出瘤体范围（图5）。当然也有操作者在穿刺时采用从未见点管强回声至见到强回声时的深度差异来保证移动取材，此种方法虽然能保证取到瘤体内细胞，但同时也吸入了周围细胞，稀释了瘤体细胞，造成漏诊，这也与统计学结果分析相符。
在此，笔者通过示意图来展示分类中1、2、3类穿刺抽吸法的区别。3种穿刺抽吸法在进针过程中来自甲状腺组织及散落的细胞压力几乎是相同的，区别仅在于针体内的压力不同：1类为抽吸法，即注射器内产生的负压增加甲状腺组织及散落细胞进入针体的量；2类为非抽吸法，即来自组织及散落细胞的压力大于外界大气压，细胞在穿刺针的移动中自然流入针体；3类为闭压进出法，穿刺进针前用手指堵住针尾，保证针体内的一定气压，可以对抗进针过程中途经正常组织时进入针体的非瘤体区细胞的量，当针尖到达瘤体范围内时，松开针尾，使更多的瘤体细胞进入针体，必要时可连接注射器吸取更多细胞。退针时，再次用手指堵住针尾，保持针体内存在一定压强，避免退针时组织间隙的负压将针体内的瘤体细胞倒吸，同时也能在微观层面减少种植转移的风险（图6）。
图 6 抽吸法(a），非抽吸法(b），闭压进出法(c）取材后针体内细胞类型型示Figure 6. The cell types in the needle were by suction method （a），non suction method （b） and closed pressure （c）综上所述，端侧式入路闭压进出取材法是与术后组织病理结果最接近的FNA细胞学检查方式，不仅是基于日常大量的穿刺操作实践中总结的经验，更是统计学对其差异性和一致性的评价结果。
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图 1 各组Micro-CT扫描重建图
A、B：对照组1、2牙槽骨变化；C：模型组牙槽骨变化；D：葛根素组牙槽骨变化。
Figure 1. Micro-CT scan reconstruction for each group
图 2 HE 染色观察牙周组织形态学特征变化（×100）
A：对照组；B：模型组；C：葛根素组。
Figure 2. Observation of histomorphological changes in periodontal tissue by HE staining （×100）
图 3 全血细胞中TH17细胞比例
与对照组比较，**P < 0.01；与模型组比较，##P < 0.01。
Figure 3. Percentage of Th17 cells in whole blood
图 4 全血细胞中Treg细胞比例
与对照组比较，*P < 0.05；与模型组比较，#P < 0.05。
Figure 4. Percentage of Treg cells in whole blood
图 5 全血细胞中Th17/Treg细胞比例
与对照组比较，*P < 0.05；与模型组比较，#P < 0.05。
Figure 5. Th17/Treg cell ratio in whole blood
图 6 流式细胞术检测全血细胞中各组Th17细胞比例变化
A：对照组；B：模型组；C：葛根素组。
Figure 6. Change in the proportion of Th17 cells in whole blood detected by flow cytometry
图 7 流式细胞术检测全血细胞中各组Treg 细胞比例变化
A：对照组；B：模型组；C：葛根素组。
Figure 7. Change in the proportion of Treg cells in whole blood detected by flow cytometry
图 8 WB 检测 IL-17、ＲOＲγt、IL-10、Foxp3 蛋白表达
Figure 8. Western blot detection of IL-17，RORγt，IL-10，and Foxp3 protein expression
图 9 各组牙周组织中IL-10蛋白表达分析图
与对照组比较，#P < 0.05；与模型组比较，*P < 0.05。
Figure 9. Analysis of IL-10 protein expression in periodontal tissues
图 10 各组牙周组织中IL-17蛋白表达分析图
与对照组比较，##P < 0.01；与模型组比较，**P < 0.01。
Figure 10. Analysis of IL-17 protein expression in periodontal tissues
图 11 各组牙周组织中Foxp3蛋白表达分析图
与对照组比较，##P < 0.01；与模型组比较，**P < 0.01。
Figure 11. Analysis of Foxp3 protein expression in periodontal tissues
图 12 各组牙周组织中RORγt蛋白表达分析图
与对照组比较，##P < 0.01；与模型组比较，*P < 0.05。
Figure 12. Analysis of RORγt protein expression in periodontal tissues
表 1 各组Micro-CT扫描分析后骨体积分数、骨矿物质密度值（n = 12，
$ \bar x \pm s $ ）Table 1. BV/TV and BMD values of each group obtained by micro-CT scan analysis （n = 12，
$ \bar x \pm s $ ）组别 BV/TV（%） BMD（g/cm3） 对照组 0.720 ± 0.049 1004.269 ± 54.644△ 模型组 0.387 ± 0.0376* 894.119 ± 53.789* 葛根素治疗组 0.337 ± 0.036△ 1046.297 ± 54.565△ 与对照组比较，*P < 0.05；与模型组比较，△P < 0.05。 
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