原发性高血压（essential hypertension，EH）是一种以动脉血压升高为特征的慢性疾病^[1]，持续威胁着中老年人的生命健康。在全球范围内，EH都有着很高的发病率和死亡率，2018年我国高血压患者已达2.45亿人^[2]。髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）被认为是一个独立且意义重大的心血管疾病监测指标^[3]，近年来有较多研究表明其在血管损伤方面以及高血压的发展中起到重要作用，甚至有科学家在综合众多研究结果后，认为其可以预测心血管疾病的患病风险、死亡率。有研究表明，MPO-463G/A基因的多态性与高血压的发生具有较高相关性，但对于MPO基因-463G/A多态位点与彝族高血压的相关性，国内外未见报道。

本研究旨在通过PCR-RFLP技术检测云南彝族EH组和对照组的MPO基因-463G/A多态性，从而进行关联分析并探讨其与云南彝族原发性高血压是否相关，为能否将该位点作为判断云南彝族原发性高血压易感性的标记提供依据，进一步阐明彝族高血压的发病机制。

1.   资料与方法

1.1   研究对象

所有样本于2007年1月至2008年11月采自云南省昆明市晋宁县双河乡的186名彝族居民，根据是否患有EH分为彝族高血压组（EH组，n = 86）和正常对照组（对照组，n = 100）。

该研究高血压诊断标准：所有研究对象平静状态下，由不同医师连续3次测血压后取平均值，收缩压≥140 mmHg（1 mmHg = 0.133 kPa）和（或） 舒张压≥90 mmHg^[4]即诊断为高血压。EH组纳入标准：血压测量后诊断为高血压者或正在接受高血压治疗者；对照组纳入标准：收缩压 < 140 mmHg，舒张压 < 90 mmHg者。排除标准：EH组和对照组均已排除资料不全者及患有继发性高血压、心肌梗死等心血管疾病者，排除糖尿病、肝功能异常者^[5]。所有受试对象对本研究知情同意。

1.2   观测指标

收集患者一般资料如年龄、性别、血压值、合并症、相关体检结果等，按照前述排除和纳入标准分组后，用所提取的DNA进行基因型检测，比较2组基因型和基因频率差异，分析MPO-463G/A基因多态性与原发性高血压的相关性。

1.3   实验方法

目的片段PCR扩增：将研究对象的外周血2 mL通过EDTA抗凝，基因组DNA在用酚-氯仿有机抽提法提取^[6]后置于-80℃保存。特异性扩增包含MPO基因-463G/A位点的基因组DNA片段，PCR反应总体系为20 μL，模板DNA 1 μL，上、下游引物各1 μL（引物浓度10 P，序列：上游引物5′ ---CGGTATAGGCACACAATGGTGAG---3 ′ ；下游引物5′ ---GCAATGGTTCAAGCGATTCTTC----3 ′ ^[7]；北京擎科生物技术有限公司），1.1×T3 Super PCR MIX 17 μL。PCR扩增程序：98℃，2 min；98℃，10 s；58℃，15 s；72℃，30 s；35个循环，72℃终末延伸2 min，4℃下保存。PCR扩增结束后将扩增产物在以Gold-view染色的3%琼脂糖凝胶上电泳，DL 500 DNA marker 作对照，在凝胶成像仪下观测结果。

基因型鉴别：RFLP检验。酶切体系20 μL：PCR产物10 μL，限制性内切酶AciI 0.2 μL（New England Biolads公司），cut smart 2 μL，双蒸水7.8 μL。在37℃下水浴酶切15 min，酶切产物在用Gold-view染色的3%琼脂糖凝胶上电泳，DL 500 bp DNA marker 作对照，在凝胶成像仪（美国Bio-Rad Laboratories公司，型号Gel Doc XR+，配有Image Lab^TM软件）下观察并保存酶切结果，判读基因型。

1.4   统计学处理

Hardy-Weinberg遗传平衡定律用于检测研究样本的群体代表性。该研究采用SPSS27.0软件进行数据分析，各组基因型及等位基因频率之间的比较采用四格表χ²检验。计量资料以均数±标准差（$ \bar x \pm s $）表示，采用t检验比较2组间均数的差异。P < 0.05为差异具有统计学意义。

2.   结果

2.1   基本情况

本次研究对象共186例，其中EH组86例，对照组100例，所有对象均是彝族且长期生活在双河乡。其中EH组年龄29～88岁，平均（55.92±13.58）岁，其中40～69岁人数最多（69.77%），男性31例，女性55例；对照组年龄29～81岁，平均（51.84±15.04）岁，其中30～59岁人数最多（62.00%），男性29例，女性71例。

2.2   一般临床指标比较

对照组与EH 组间年龄比较，差异无统计学意义（P > 0.05）；性别比较，差异无统计学意义（P > 0.05），见表1。

表  1  EH组和对照组一般临床资料比较（$\bar x \pm s$）

Table  1.  Comparison of the general clinical data between EH and control group （$\bar x \pm s$）

组别	n	年龄（岁）	男∶女（n）
EH组	86	55.92 ± 13.58	31∶55
对照组	100	51.84 ± 15.04	29∶71
t/χ2		−1.928	1.051
P		0.055	0.305

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2.3   Hardy－Weinberg平衡检测

检测MPO基因463-G/A多态性在对照组和EH组中的分布，均符合Hardy－Weinberg平衡（χ² = 3.047，P = 0.081；χ² = 2.635，P = 0.104），具有群体代表性。

2.4   MPO基因-463G/A位点多态性

检测PCR特异性扩增产物为350 bp片段，见图1，扩增产物用AciⅠ酶切。由于位于MPO基因启动子区域的-463位点存在G/A多态性，当-463位点从G变为A后，产生了新的AciⅠ的酶切位点-CCGC，经AciⅠ内切酶消化后，等位基因G被切开产生169 bp、120 bp和61 bp片段，等位基因A被切开产生289 bp片段和61 bp片段，所以酶切结果为：GG基因型为169 bp、120 bp和61 bp共3个片段，GA基因型为289 bp、169 bp、120 bp和61 bp 共4个片段，AA基因型为289 bp和61 bp 共2个片段，由于61 bp片段过小很难被琼脂糖凝胶电泳检测到，故胶图中不展示61 bp条带，见图2

图  1  基因组DNA PCR扩增结果

M表示Marker；1～7表示1～7号样本的PCR扩增产物。

Figure  1.  Results of PCR amplification of genomic DNA

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图  2  MPO基因−463G/A 多态酶切结果

PCR表示PCR扩增产物；AA、GA、GG表示各基因型；M表示Marker。

Figure  2.  Results of MPO gene−463G/A polymorphism digestion

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2.5   MPO基因-463G/A 基因多态性在云南彝族EH组与对照组中的分布比较

EH组与对照组间GG和GA+AA（由于GA和AA基因型样本例数较少，为使统计结果更为准确，所以对其进行合并处理）基因型频率及G、A基因频率分布差异均具有统计学意义（P < 0.05），见表2。同时在男性群体和女性群体中分别计算，女性的基因型频率与等位基因频率分布差异具有统计学意义（P < 0.05），见表3。

表  2  云南省彝族人群中MPO基因−463G/A 位点的基因型及等位基因频率比较[n（%）]

Table  2.  Comparison of genotype and allele frequency of MPO gene−463G/A locus in Yi people of Yunnan Province[n（%）]

组别	基因型				等位基因
	n	GG	GA+AA		n	G	A
EH组	86	57（66.28）	29（33.72）		172	137（79.65）	35（20.35）
对照组	100	52（52.00）	48（48.00）		200	139（69.50）	61（ 30.50）
总计	186	109（58.60）	77（ 41.40）		372	276（74.19）	96（25.81）
χ2		3.866				4.977
P		0.049*				0.026*
*P < 0.05。

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表  3  男、女性EH组与对照组基因型分布和等位基因比较[n（%）]

Table  3.  Comparison of genotype distribution and alleles between male and female EH groups and control group[n（%）]

组别	基因型				等位基因
	n	GG	GA+AA		n	G	A
男性
EH组	31	16（51.60）	15（48.40）		62	43（69.40）	19（30.60）
对照组	29	17（58.60）	12（41.40）		58	41（70.70）	17（29.30）
总计	60	33（55.00）	27（45.00）		120	84（70.00）	36（30.00）
χ2		0.297				0.025
P		0.586				0.873
女性
EH组	55	41（74.50）	14（25.50）		110	94（85.50）	16（14.50）
对照组	71	35（49.30）	36（50.70）		142	98（69.00）	44（31.00）
总计	126	76（60.32）	50（39.68）		252	192（76.19）	60（23.81）
χ2		8.255				9.235
P		0.004*				0.002*
*P < 0.05。

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3.   讨论

MPO是由中性粒细胞、单核细胞和某些组织的巨噬细胞分泌的含血红素辅基的血红素蛋白酶，是血红素过氧化物酶超家族成员之一^[8]。近年来诸多研究显示MPO与冠状动脉疾病、脑卒中、心力衰竭、肾脏损伤疾病等多种炎症性疾病有关^[9-12]，其发病机制大多涉及氧化应激、炎症反应、血管内皮损害^[13]。同时也有研究显示，高血压与免疫、炎症反应和内皮损伤相关^[14-16]。因为MPO与各类炎症性疾病的发生发展具有一定的相关性，因此其在原发性高血压形成和发展中的机制也成为近年来的研究热点。

关于MPO基因，目前大多数研究者把研究重点放在MPO-463G/A多态性。现有研究表明MPO-463G/A基因的多态性与高血压的发生可能有较高相关性，例如：Kisic等^[17]在研究年龄相关性白内障疾病的发生因素时发现，在高血压患者血浆中检测到的MPO活性明显高于非高血压患者。周白丽等^[18]在对青海省人民医院、玉树州人民医院的高血压患者及健康人进行不同海拔地区高血压患者MPO含量变化研究时，发现中、高海拔地区高血压患者血清MPO含量均高于同海拔正常对照组。方金瑞等^[19]在对甘肃省人民医院高血压患者与正常人进行MPO基因多态与EH遗传易感性研究时，发现MPO基因多态性与原发性高血压遗传易感性相关，并且发现正常人组中A等位基因频率明显高于高血压组。该研究通过检测云南省86例彝族原发性高血压患者和100例彝族健康人的 MPO基因-463G/A多态性，得到MPO-463G/A基因的多态性与云南彝族女性原发性高血压的发生有相关性的结果，这一结果与前面报道的结果一致。

近年来虽有众多研究人员的研究结果为MPO基因多态性与高血压相关，但在不同性别层面却结论不一。例如马慧元等^[20]对甘肃省人民医院门诊及住院患者的研究表明，相较于女性来说，该位点463A基因在男性的高血压形成中表现出更加明显的保护作用。Bushueva 等^[21]在俄罗斯人群中开展调查时发现MPO-643GA基因型可降低高血压发病风险，但仅在女性中作用明显。考虑到性别差异的影响，该研究也对彝族男性和女性分别进行了比较，结果显示，彝族女性高血压患者和彝族正常女性的基因型分布和基因频率有显著性差异（P < 0.05），且463A等位基因频率在对照组高于EH组，该位点A基因的表达在EH的发生过程中对女性起保护作用；而男性高血压组与对照组的基因型分布和基因频率差异无统计学意义（P > 0.05）.

总之，本研究认为MPO基因-463G/A 多态与云南彝族女性原发性高血压具有相关性，是彝族女性高血压的易感基因。该位点 A 基因的表达在女性 EH的发生过程中起保护性作用。但EH是一个由许多因素引起且不断发展的心血管疾病，其发病机制较为复杂，且本研究样本量较小，也有可能导致结果偏差。为了推进和完善云南彝族原发性高血压的防控工作，今后需进一步探讨该基因多态性在高血压的发生机制中的作用，并尽可能加大样本量，以便得出更准确的结果。