Study on Osteogenic Ability of Dental Pulp Stem Cells at Different Concentrations
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摘要:
目的 探究不同浓度的牙髓干细胞（dental pulp stem cell，DPSC）在定量Bio-Oss骨粉中最佳的成骨比例。 方法 收集牙髓组织、组织块贴壁法分离培养原代细胞，流式细胞术鉴定DPSC表面标志物，诱导成骨及成脂鉴定DPSC多向分化潜能；GFP慢病毒转染DPSC，嘌呤霉素筛选GFP-DPSC；设置1×105、2×105、4×105、8×1054组细胞数接种于0.05 g骨粉并成骨培养，对照组不加骨粉，第3天和第7天进行碱性磷酸酶活性测定；培养第7天在扫描电镜下观察细胞在骨粉内的形态变化。 结果 原代分离培养成功的DPSC符合间充质干细胞来源，相关表面标记物高表达，可向成脂和成骨分化；GFP成功转染DPSC，第3天和第7天进行碱性磷酸酶活性检测，实验组均高于对照组，差异具有统计学意义（P < 0.05）；扫描电镜发现DPSC在骨粉表面爬行，部分细胞伸出伪足，4×10 5和8×105 2组细胞较为密集。 结论 4×105～8×105个DPSC与0.05 g Bio-Oss骨粉复合培养成骨效果较好，可以缩短成骨周期，细胞若接种过多，成骨效果反而抑制，造成干细胞的浪费。 Abstract:Objective To explore the optimal osteogenic ratio of Dental pulp stem cells （DPSC） with different concentrations in quantitative Bio-Oss bone powder. Methods The primary cells were isolated and cultured by adherent method. The surface markers of DPSC were identified by flow cytometry, and the multidirectional differentiation potential of DPSC was identified by osteogenesis and adipogenesis. DPSC was transfected with GFP lentivirus, and GFP-DPSC was screened with puromycin. The cells in groups 1×105, 2×105, 4×105 and 8×105 were inoculated with 0.05 g bone powder and cultured for osteogenesis, while the control group did not add bone powder. Alkaline phosphatase activity was measured on day 3 and day 7. On the 7th day of culture, the morphological changes of the cells in bone powder were observed under scanning electron microscope. Results The DPSC was derived from mesenchymal stem cells with high expression of related surface markers and could differentiate into adipogenic and osteogenic cells. GFP was successfully transfected into DPSC, and alkaline phosphatase activity was detected on the 3rd and 7th day, and the experimental group was higher than the control group, and the difference was statistically significant （P < 0.05）. Scanning electron microscopy showed that DPSC crawled on the surface of bone powder, and some cells extended pseudopodia, and the cells of 4×10 5 and 8×105 groups were more dense. Conclusions The combined culture of 4×105-8×105 DPSC and 0.05 g Bio-Oss bone powder has a good osteogenic effect, which can shorten the osteogenic cycle. If the cells are inoculated too much, the osteogenic effect is inhibited, resulting in the waste of stem cells. -
临床中因为牙体牙髓、牙周等疾病导致的牙槽骨缺损已经屡见不鲜，这为后续的修复造成了严重的不便，进而影响患者的生理和心理健康[1]。尽管自体骨的移植疗效可能是更好的，但其对供区造成一定的创伤，一些骨替代材料开始运用于临床。其中Bio-Oss无机小牛骨颗粒被普遍用于临床，得到国际的广泛认可[2]。Bio-Oss骨粉具有超级多孔结构，有助于间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）爬行附着于骨粉表面分化形成新骨。牙髓干细胞（dental pulp stem cell，DPSC）是一类具有高度的分化能力的牙源性干细胞，如神经细胞、脂肪细胞、成骨和软骨细胞、血管细胞和牙本质细胞等[3，4]。多项研究证明Bio-Oss骨粉与DPSC具有良好的相容性、可行性和安全性，能够有效促进骨修复和愈合，显示出良好的应用前景[5-7]。但是鲜有文献提及Bio-Oss骨粉与DPSC的合适配比，若配比不合适，则会影响成骨的速度和效率。因此，本课题拟初步探究Bio-Oss骨粉与DPSC的大致配比，以期为临床应用提供有价值的信息。
1. 材料与方法
1.1 主要仪器和试剂
0.25%胰蛋白酶（BI，以色列）；磷酸盐缓冲液（PBS，索莱宝）；α-MEM培养基（Gibco，美国）；胎牛血清（BI，德国）；Human MSC Analysis Kit （BD，美国）；Human MesenCult™ Osteogenic Differentiation Kit （Stemcell，加拿大）；Human MesenCult™ Adipogenic Differentiation Kit （Stemcell，加拿大）；茜素红（索莱宝）；油红O（索莱宝）；酶联免疫检测仪（Thermo，美国）；流氏细胞仪（BD，美国）；碱性磷酸酶活性检测试剂盒（碧云天）；GFP慢病毒（吉凯，中国）。
1.2 方法
1.2.1 DPSC的分离、培养及鉴定
经昆明医科大学附属延安医院伦理委员会审批通过，患者监护人签字同意，在口腔外科收集新鲜拔除、无牙体牙髓及牙周疾病且根尖未发育完全的第三磨牙。迅速用含2%双抗的α-MEM培养基保存放入冰盒中，随即在细胞工作间中处理标本。用含2%双抗PBS冲洗彻底清除血凝块并刮除根面软组织，使用咬骨钳将牙齿劈开，获取无损伤的牙髓组织，使用1 mL注射器反复捣碎牙髓组织，转移至培养皿中倒置放入37 ℃细胞培养箱中温育15 min，加入含20% FBS的培养基，动作轻柔勿使组织块浮起，每3 d换液，待细胞大量爬出后消化细胞传代扩大培养。
流式细胞术鉴定：取第4代DPSC消化、离心，PBS重悬，制备成单细胞悬液计数备用。以每管5×105个细胞数加入流式管内，根据试剂操作说明，加入CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR、CD73、CD90、CD105抗体，避光孵育30 min。加入鞘液清洗1遍，弃上清，然后加入 200～300 µL的鞘液上机，检测细胞表面抗原，进行免疫表型分析。
1.2.2 DPSC成骨、成脂向分化
取第4代DPSC，每孔5×105个细胞接种于6孔板内，待细胞融合在80%以上时更换Human MesenCult™ Osteogenic Differentiation Kit和Human MesenCult™ Adipogenic Differentiation Kit，对照组正常培养，连续培养3周后吸弃培养基并用PBS漂洗，加入70%乙醇固定细胞2 h，PBS洗3遍，加入茜素红和油红O 染色5 min，倒置显微镜下观察染色的面积大小以及颜色深浅。
1.2.3 GFP病毒转染DPSC
根据吉凯病毒转染手册，预实验摸得GFP病毒转染DPSC的MOI = 10。取24孔板，每孔接种4×104个细胞，细胞融合至90%左右加入嘌呤霉素，设置0.25 μg/L、0.5 μg/L、1 μg/L、1.5 μg/L、2 μg/L浓度，摸得48 h杀死全部细胞的最低浓度为0.5 μg/L。取第3代DPSC和6孔板，每孔接种5×105 个细胞，计算并加入相应的慢病毒体积，转染96 h后换液，加入0.5 μg/L嘌呤霉素培养基，杀死野生型细胞。
1.2.4 碱性磷酸酶
（Alkaline phosphatase，ALP）活性检测 取24孔板，每孔加0.05 g骨粉铺满孔板底，成骨培养基浸润骨粉后，分别加入1×105、2×105、4×105、8×105个细胞，对照组不加骨粉，其余条件一致培养。分别在培养第3天和第7天时用1%×-Trition裂解细胞，4 ℃下，14000 g离心3 min后取上清，按照碧云天碱性磷酸酶试剂盒操作说明测定ALP活性。
1.2.5 SEM扫描DPSC在骨粉表面黏附的情况
按照同上条件，Bio-Oss和DPSC复合培养7 d后，小心吸弃培养液，每孔加入1 mL赛维尔扫描电镜固定液，4 ℃ 固定细胞4 h 后送至赛维尔生物公司进行扫描电镜。
1.3 统计学处理
所有数据应用SPSS24.0软件分析。计量资料用 $\bar x \pm s $表示，采用单因素方差分析，组间两两比较方差齐者用 LSD 检验，方差不齐者用Tamhane T2检验。P < 0.05为差异有统计学意义，Graphpad Prism6作图。
2. 结果
2.1 DPSC的培养及多向分化能力鉴定
牙髓组织采用组织块法贴壁培养5 d后镜下可见类成纤维样的细胞沿着组织块边缘呈放射状爬出（图1A），传代后细胞生长速度加快（图1B）。对照组则无红色的颗粒（图1C）。细胞连续诱导成骨3周后茜素红染色后可见大量明显红色的颗粒（图1D），对照组则未见染红的脂滴（图1E），细胞向成脂诱导3周后油红O染色后可见有脂滴被染红（图1F）。表明DPSC具有多向分化潜能，属于间充质干细胞来源。
图 1 DPSC的培养及多向分化能力鉴定A：DPSC原代细胞（×50）；B：扩大培养第三代细胞（×50）；C：DPSC成骨对照组组染色所见（×100）；D：DPSC成骨诱导组染色所见（×100）；E：DPSC成脂对照组染色所见（×200）；F：DPSC成脂诱导组染色所见（×200）。Figure 1. Culture of DPSC and appraisal of multi -directional differentiation ability2.2 DPSC表面标记物的检测
流式细胞术检测显示间充质干细胞表面标志物CD73占99.90%，CD90占99.96%、CD105占99.08%，均呈阳性高表达，而造血细胞标记物CD34、CD45以及免疫细胞表面标记物CD19、CD11b、HLA-DR则呈阴性（占0.12%），证明属于间充质干细胞家族，排除造血来源的干细胞（图2）。
2.3 GFP病毒转染DPSC以及DPSC在骨粉中的生长形态
在转染GFP后，48 h后荧光显微镜下可见散在少量的荧光表达，在96 h达到高峰（图3A～3C）。GFP-DPSC在Bio-Oss骨粉中可以很好的生长和增殖，随着培养时间的延长，细胞逐渐爬行至骨粉的深部孔隙之中（图4A～4B）。
图 3 GFP转染DPSC不同时间荧光表达（×100）A：36 h GFP转染DPSC的荧光表达；B：72 h GFP转染DPSC的荧光表达；C：96 h GFP转染DPSC的荧光表达。Figure 3. Fluorescence expression of GFP transfected DPSC at different time
图 4 GFP-DPSC在Bio-Oss骨粉中的生长（×100）A：第3天时GFP-DPSC在Bio-Oss骨粉中的状态；B：第14天时GFP-DPSC在Bio-Oss骨粉中的状态。Figure 4. Growth of GFP-DPSC in Bio-Oss bone powder2.4 不同浓度DPSC成骨分化ALP活性比较
第3天和第7天与对照组相比，DPSC复合骨粉培养后ALP活性比对照组高，P < 0.05，差异具有统计学意义，说明不同数目的DPSC复合同样质量的Bio-Oss骨粉的成骨能力是不一致的。第3天时，各组ALP活性呈指数型曲线，但到第7天时，4×10 5和8×105组的ALP活性并没有与第3天时的保持一致，细胞数目翻倍，但8×105组的ALP活性并没有翻倍，出现了下降的趋势（图5和图6）。
2.5 SEM扫描结果
SEM扫描图片发现1×105（图7）和2×105（图8）组黏附爬行在骨粉表面的细胞数目较少， 4×105（图9）组细胞数目稍多，8×105（图10）组爬满整个骨粉表面，部分细胞呈复层生长。细胞在骨粉表面爬行黏附后会伸出伪足与骨粉表面进行连接（图7～10）。
图 7 1×105组同一视野下SEM图像A：100 μm ；B：50 μm。Figure 7. SEM images of 1×105 groups in the same field of view
图 8 2×105组同一视野下SEM图像A：100 μm ；B：50 μm。Figure 8. SEM images of 2×105 groups in the same field of view
图 9 4×105组同一视野下SEM图像A：100 μm ；B：50 μm。Figure 9. SEM images of 4×105 groups in the same field of view
图 10 8×105组同一视野下SEM图像A：100 μm ；B：50 μm。Figure 10. SEM images of 8×105 groups in the same field of view3. 讨论
众所周知，支架和干细胞是再生工程的两个关键要素，Bio-Oss骨粉已经被广泛用于口腔牙槽骨缺损的患者，其临床疗效已经得到认可，能够有效形成新骨，修复骨缺损[7-9]。Bio-Oss骨粉作为一种替代的生物材料，具有高柔韧性和可塑性以及最少的感染和免疫反应风险[10，11]。Bio-Oss骨粉可以为多种MSC的存活提供良好的环境，MSC能够附着在Bio-Oss支架上增殖和分化[12]。在动物研究中，植入Bio-Oss骨粉的MSC增加了支架与宿主骨的整合，并将其形态改变为成骨样细胞[13]。在体外循环压缩压力下，在循环压缩压力下，骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cell，BMSC）向成骨细胞的分化显著增加[14]。在上颌窦底提升过程中，植入BMSC和Bio-Oss的加压复合物可促进新骨的形成[15]。在脂肪来源的干细胞（adipose-derived stem cell，ADSC）和Bio-Oss的复合物局部注射信号素3A （Sema3A）促进了2型糖尿病的大鼠颅骨骨再生[16]
尽管Bio-Oss骨粉与MSC能够更好地促进成骨，但是很多实验并未明确指出MSC的接种数目和合适的Bio-Oss质量。而且，笔者认为固定质量的Bio-Oss骨粉所能容纳的干细胞数目是有限的，如果干细胞数目过少，则无法充满骨粉的孔隙，成骨的效率减弱；若干细胞数目过多，则会造成竞争，造成干细胞资源的浪费。另一方面，干细胞的种类也同样影响接种数目，因为不同的干细胞其大小、增殖能力和分化能力是不一致的[17，18]。ADSC、BMSC和DPSC都具有形成矿化组织的能力。然而，对于其矿化组织工程能力的比较研究较少，未得到充分的探索。研究发现，DPSC的成骨潜能明显大于BMSC和ADSC，DPSC具有产生相对高量矿化基质的最大潜力[19]。将BMSC和DPSC联合Bio-Oss移植在颅面区域促进骨再生，发现2组具有相似的骨密度、新骨形成和成骨相关蛋白表达，在体内的骨再生效果相匹配[20]。一项meta分析评价显示，与对照组相比，在4周时，DPSC与支架复合物的新骨形成显著增加[21]。但是在阅读文献时发现没有明确的细胞和骨粉用量，作者是否认为这不是一个重要的信息所以没有描述。如Wang等[22]仅描述以2 × 106细胞/mL的密度将BMSCs悬液加入Bio-Oss颗粒中，未说明骨粉具体质量，但是DPSC与BMSC的细胞形态大小以及分化能力是不一致的，所以BMSC接种的数目对DPSC而言并没有太多的指导价值。
Bio-Oss骨粉作为固体颗粒具有遮光性，普通光镜下无法看到细胞的状态，因此本课题预先将GFP慢病毒成功转染DPSC并筛选扩大培养以便于在荧光显微镜下观察。笔者发现大约0.05g的骨粉可以均匀散在的铺在24孔板的底部，将细胞数目定为1×105、2×105、4×105、8×105四组。ALP是成骨分化过程中细胞分泌的的一种酶，它的表达活性是成骨细胞分化、成熟一个非常明显的特征[23]。在第3天时，ALP活性测定的数值发现8×105组几乎是4×105的两倍，与细胞数目增长的趋势大致相同。但是在第7天时， 4×105但8×105组却没有出现预期的结果，与第3天的结果保持一致，反而稍稍出现了一个降低的趋势，说明随着培养时间的延长，细胞数目增殖过多，抑制了成骨分化的效率。隔天在荧光显微镜下监测GFP-DPSC在Bio-Oss骨粉中的生长状态，发现着培养时间的延长，细胞形态发生了变化，部分逐渐变成了不规则的形状，不再是长梭形的类成纤维细胞样形态。Bio-Oss骨粉之间的孔隙并非完全规则的，并且骨粉作为一种刚性物质，干细胞需要做出改变以适应这样的结构，而且Bio-Oss骨粉没有细胞毒性，并不会影响干细胞的增殖[24]。通过扫描电镜发现，1×105、2×105两组细胞较为散在的附着在骨粉表面，4×105组细胞比较密集的附着在骨粉表面，而8×105组则看见细胞堆叠生长。通过放大电镜下观察倍数发现，细胞表面可伸出部分伪足附着于骨粉之上，形成更为紧密的连接。
干细胞成骨分化是一个周期较长的过程，细胞逐渐爬行到骨粉更深的内部结构之中，骨粉作为一个立体的物质，荧光显微镜下可以在不同层面观察到细胞，但是这也为笔者无法全面观察细胞带了一定的影响。在实验过程中笔者发现GFP-DPSC和Bio-Oss骨粉复合物培养时间到成骨中后期，GFP的荧光强度逐渐减弱，这是由于干细胞分化过程中已经不再是干细胞，而是逐渐变为成骨细胞[25]。另一方面，细胞在诱导分化过程中仍在增殖，因此笔者尝试连续在成骨培养基中诱导21 d后用DAPI染色，在蓝色荧光下根据细胞核显色的数目大致估计培养21 d后的细胞数目。由于Bio-Oss骨粉均能被蓝色荧光和绿色荧光激发成像，而且在不同层面均能观察到细胞，这对实验结果造成了干扰。尽管结果不理想，但仍旧可以作为一个参考，4×105、8×105两组的细胞可以在镜下看到密集的蓝色的细胞核。
通过以上实验结果，笔者认为0.05 g Bio-Oss骨粉接种4×105～8×105个细胞是一个合适的密度范围，细胞在骨粉中爬行生长需要一定的时间，而且干细胞具有强大的增殖能力，若开始时细胞接种数目过多，则会对细胞的生长和增殖造成抑制，反而影响成骨效率。根据现有的实验结果，未来还需进行免疫组化和Micro-CT精细扫描获得更精确的结果完善实验完整性。
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图 1 DPSC的培养及多向分化能力鉴定
A：DPSC原代细胞（×50）；B：扩大培养第三代细胞（×50）；C：DPSC成骨对照组组染色所见（×100）；D：DPSC成骨诱导组染色所见（×100）；E：DPSC成脂对照组染色所见（×200）；F：DPSC成脂诱导组染色所见（×200）。
Figure 1. Culture of DPSC and appraisal of multi -directional differentiation ability
图 3 GFP转染DPSC不同时间荧光表达（×100）
A：36 h GFP转染DPSC的荧光表达；B：72 h GFP转染DPSC的荧光表达；C：96 h GFP转染DPSC的荧光表达。
Figure 3. Fluorescence expression of GFP transfected DPSC at different time
图 4 GFP-DPSC在Bio-Oss骨粉中的生长（×100）
A：第3天时GFP-DPSC在Bio-Oss骨粉中的状态；B：第14天时GFP-DPSC在Bio-Oss骨粉中的状态。
Figure 4. Growth of GFP-DPSC in Bio-Oss bone powder
图 7 1×105组同一视野下SEM图像
A：100 μm ；B：50 μm。
Figure 7. SEM images of 1×105 groups in the same field of view
图 8 2×105组同一视野下SEM图像
A：100 μm ；B：50 μm。
Figure 8. SEM images of 2×105 groups in the same field of view
图 9 4×105组同一视野下SEM图像
A：100 μm ；B：50 μm。
Figure 9. SEM images of 4×105 groups in the same field of view
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