Study on Osteogenic Ability of Dental Pulp Stem Cells at Different Concentrations
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摘要:
目的 探究不同浓度的牙髓干细胞（dental pulp stem cell，DPSC）在定量Bio-Oss骨粉中最佳的成骨比例。 方法 收集牙髓组织、组织块贴壁法分离培养原代细胞，流式细胞术鉴定DPSC表面标志物，诱导成骨及成脂鉴定DPSC多向分化潜能；GFP慢病毒转染DPSC，嘌呤霉素筛选GFP-DPSC；设置1×105、2×105、4×105、8×1054组细胞数接种于0.05 g骨粉并成骨培养，对照组不加骨粉，第3天和第7天进行碱性磷酸酶活性测定；培养第7天在扫描电镜下观察细胞在骨粉内的形态变化。 结果 原代分离培养成功的DPSC符合间充质干细胞来源，相关表面标记物高表达，可向成脂和成骨分化；GFP成功转染DPSC，第3天和第7天进行碱性磷酸酶活性检测，实验组均高于对照组，差异具有统计学意义（P < 0.05）；扫描电镜发现DPSC在骨粉表面爬行，部分细胞伸出伪足，4×10 5和8×105 2组细胞较为密集。 结论 4×105～8×105个DPSC与0.05 g Bio-Oss骨粉复合培养成骨效果较好，可以缩短成骨周期，细胞若接种过多，成骨效果反而抑制，造成干细胞的浪费。 Abstract:Objective To explore the optimal osteogenic ratio of Dental pulp stem cells （DPSC） with different concentrations in quantitative Bio-Oss bone powder. Methods The primary cells were isolated and cultured by adherent method. The surface markers of DPSC were identified by flow cytometry, and the multidirectional differentiation potential of DPSC was identified by osteogenesis and adipogenesis. DPSC was transfected with GFP lentivirus, and GFP-DPSC was screened with puromycin. The cells in groups 1×105, 2×105, 4×105 and 8×105 were inoculated with 0.05 g bone powder and cultured for osteogenesis, while the control group did not add bone powder. Alkaline phosphatase activity was measured on day 3 and day 7. On the 7th day of culture, the morphological changes of the cells in bone powder were observed under scanning electron microscope. Results The DPSC was derived from mesenchymal stem cells with high expression of related surface markers and could differentiate into adipogenic and osteogenic cells. GFP was successfully transfected into DPSC, and alkaline phosphatase activity was detected on the 3rd and 7th day, and the experimental group was higher than the control group, and the difference was statistically significant （P < 0.05）. Scanning electron microscopy showed that DPSC crawled on the surface of bone powder, and some cells extended pseudopodia, and the cells of 4×10 5 and 8×105 groups were more dense. Conclusions The combined culture of 4×105-8×105 DPSC and 0.05 g Bio-Oss bone powder has a good osteogenic effect, which can shorten the osteogenic cycle. If the cells are inoculated too much, the osteogenic effect is inhibited, resulting in the waste of stem cells. -
部分胸痛患者冠状动脉造影检查显示冠状动脉无明显狭窄或接近正常，但造影剂充盈缓慢、排空速度明显延迟，这种现象被称为冠状动脉慢血流现象（coronary slow flow phenomenon，CSFP）[1]。CSFP患者有发生心肌缺血的风险，甚至可能进展为急性冠脉综合征导致碎死。CSFP的发病机制尚不明确，目前主要包括：冠状动脉微循环障碍、炎症反应、血管内皮功能紊乱、血小板功能及形态异常以及基因变异等[2-3]。另外，Cin等[3]利用血管内超声（intravenous ultrasound，IVUS）观察CSFP患者的冠状动脉，发现其已经存在不同程度的弥漫性内膜增厚、管壁钙化现象，故认为CSFP是冠状动脉粥样硬化的早期表现。临床上常常采用心肌梗死溶栓试验（thrombolysis in myocardial infarction，TIMI）血流帧数评估冠状动脉血流速度[4]，具有较好的客观性和准确性。
瘦素（leptin，LEP）主要由脂肪细胞分泌，作用于中枢神经系统，从而控制食物摄入、引起能量消耗，对机体的能量代谢调节起着重要作用[5]。研究发现，瘦素可通过胰岛素抵抗、介导内皮功能障碍、参与炎症反应、促进血小板聚集等途径参与到冠心病的发生发展中[6-7]。瘦素由人类染色体7q31.3上的瘦素基因所表达，包含三个外显子，长度约20 kb。其中，LEP rs7799039 G/A位于瘦素基因启动子位置上，其基因位点的变异可能在转录水平上影响瘦素的表达。瘦素受体（leptin receptor，LEPR）由瘦素受体基因的所表达。瘦素受体基因位于人类染色体1p31上，包括20个外显子、19个内含子，长度 > 70 kb[8]。1997年，Mastuoka等[9]对LEPR基因20个外显子应用PCR技术进行测序分析，发现了存在7种核苷酸变异。其中，LEPR基因rs1137101、rs1137100与冠心病及其相关危险因素密切相关[10-11]。
目前关于LEP及LEPR基因多态性与CSFP的相关研究尚未报道。本课题通过比较CSFP组与正常冠状动脉血流（normal coronary flow，NCF）组的血清LEP及LEPR水平，检测LEP rs7799039、LEPR rs1137100、LEPR rs113710基因及基因型频率，一方面，探究LEP及LEPR基因多态性与CSFP之间的相关性，另一方面，探寻影响CSFP的相关危险因素，为其防治探寻新途径。
1. 资料与方法
1.1 研究对象
收集于2018年09月至2019年11月因胸痛入住昆明医科大学第二附属医院心内科患者100例，记录临床资料、冠脉造影结果，并计算校正的TIMI帧数（TFC）。将研究对象分为CSFP组54例，NCF组46例。CSFP组入组标准：（1）冠脉造影示冠状动脉正常[12]或狭窄程度 < 40%[13]；（2）在30帧/s图像采集速度下，记录冠状动脉TIMI帧数，以造影剂进入某支冠状动脉记作为第一帧，到达远端终点分支作为最后一帧。因左前降支（LAD）的解剖长度明显长于左回旋支（LCX）、右冠状动脉（RCA），所以将记录到的LAD的TIMI帧数除以1.7，得到校正的TIMI帧数。将LAD、LCX和RCA的TIMI帧数相加后除以3，记录平均冠脉TIMI帧数（Mean TFC）。当Mean TFC > 27时诊断为CSFP。NCF组入组标准：（1）冠脉造影示冠状动脉正常或狭窄程度 < 40%；（2）Mean TFC ≤ 27时诊断为NCF组[1]。排除标准：冠状动脉支架植入术后、冠状动脉狭窄程度 ≥ 40%、冠状动脉无复流现象、冠状动脉瘤样扩张、冠状动脉痉挛、快速或缓慢型心律失常导致冠状动脉血流改变、心肌病、心瓣膜病、慢性消耗性疾病等。
1.2 临床资料收集
记录入组患者性别、年龄、身高、体重、体重指数（BMI）、糖尿病病史、高血压病史、吸烟史等临床资料，测定空腹血糖（FBG）、空腹胰岛素水平（FINS）、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、血小板计数（PLT）、平均血小板体积（MPV）等指标。采用稳态模型抵抗指数（homeostasis model insulin resistance index，HOMA-IR）评估胰岛素抵抗情况，HOMA-IR = FINS*FBG/22.5[14]。
1.3 ELISA实验
入院后第2天抽取空腹静脉血4 mL于促凝管中，4℃条件下离心（3000 r/min，15 min），提取血清。按照说明书，采用ELISA检测LEP、LEPR的浓度。分别于96孔ELISA板中加入标准品与待测样品，样本中的LEP或LEPR与载体上固有的LEP或LEPR抗体结合，洗涤后加入LEP或LEPR二抗，再次洗涤后加入辣根过氧化物酶标记检测抗体，加入TMB底物显色反应，用酶标仪测定吸光度，绘制标准品线性回归曲线，计算得出LEP、LEPR的浓度。
1.4 SNaPShot检测瘦素、瘦素受体基因类型及分布频率
抽取2 mL全血，使用全血基因组DNA提取试剂盒提取DNA。采用PCR法将DNA进行扩增，引物序列（由昆明擎科生物技术有限公司设计合成）如下：瘦素基因rs7799039（上游引物5′-AGCCAAGGCAAAATTGAGGA-3′，下游引物3′-AAGAGATTAAAGCAAAGACAGGCA-5′）；瘦素受体基因rs1137100（上游引物5′-TGCCTGCTGGACTCTCAAAG-3′，下游引物3′-AGCTAATGCTTACCTATTTGTTGAA-5′）；瘦素受体基因rs1137101（上游引物5′-GGTT CCCCAAAAAGGCAGTT-3′，下游引物3′-CCCCCAGTACTACATCTACCATC -5′）。扩增后采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。将PCR产物纯化后，采用单碱基延伸引物序列进行SNP单链正向延伸，引物序列如下：rs7799039（TTTTTTTTTTTTTTTTTGTTTTGCGACAGGGTTGC）；rs1137101（TTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTCATCTGGTGGAGTAATTTTCC）；rs1137100（TTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTGTGCAGACAACA TTGAAG GAA）。将扩增产物放入ABI 3730XL测序仪进行测序。随机选取一个样本的SNP-PCR扩增产物，进行Sanger法测序检验，证实与SNaPShot结果一致。所有位点用Genemapper 4.0软件对ABI 3730XL测序结果进行分析。
1.5 统计学处理
采用SPSS 22.0进行统计学分析。计量资料服从正态分布采用均数±标准差（
$\bar x \pm s $ ）表示，组间差异采用t检验；非正态分布资料采用M（P25, P75）描述，组间比较使用Mann-Whitney U秩和检验。计数资料使用百分率表示，组间比较使用χ2检验。对于基因检测，首先运用Hardy-Weinberg平衡检验分别验证两组研究对象的群体代表性，通过计算得出基因及基因型频率，并应用χ2检验比较组间差异。采用Logistic回归分析影响CSFP的危险因素。P < 0.05表示差异具有统计学意义。2. 结果
2.1 两组间临床指标的比较
比较CSFP组与NCF组的基本临床资料，两组在年龄、体重指数、HDL、LDL、TG、TC、高血压病史、糖尿病病史、吸烟史等方面差异均无统计学意义（P > 0.05）。但是与NCF组受试者相比，CSFP患者中男性比例较多，且有着较高的血清瘦素（LEP）水平、胰岛素抵抗指数（HOMA-IR），P < 0.05，见表1。
表 1 两组受试者临床指标比较 [$\bar x \pm s$ /n（%）/M（P25，P75）]Table 1. Comparison of clinical indexes between the two groups [$\bar x \pm s $ /n（%）/M（P25，P75）]组别 CSFP组（n = 54） NCF组（n = 46） t/χ2 P 男性 36（66.7） 21（45.7） 4.476 0.034* 年龄（岁） 59.93 ± 10.70 60.13 ± 9.64 −0.100 0.921 吸烟史 27（50.0） 16（34.8） 2.347 0.126 高血压病史 34（63.0） 33（71.7） 0.865 0.352 糖尿病史 10（18.5） 7（15.2） 0.192 0.661 BMI（kg/m2） 24.83 ± 3.40 24.24 ± 3.23 0.870 0.386 TC（mmol/L） 4.46 ± 0.82 4.33 ± 1.17 0.633 0.529 TG（mmol/L） 1.75（0.69～6.02） 1.59（0.51～5.43） −1.477 0.140 HDL-C（mmol/L） 1.19 ± 0.27 1.23 ± 0.24 −0.780 0.437 LDL-C（mmol/L） 2.75 ± 0.64 2.65 ± 0.93 0.639 0.525 PLT（×109/L） 212.37 ± 53.05 221.41 ± 50.48 −0.869 0.387 MPV（fL） 10.92 ± 1.13 11.03 ± 1.22 −0.457 0.649 FBG（mmol/L） 5.28（3.42～11.10） 5.10（4.12～10.69） −0.858 0.391 FINS（uIU/mL） 19.60（4.33～210.09） 15.90（2.67～57.26） −1.646 0.100 HOMA-IR 4.53（0.66～56.02） 2.98（0.88～15.63） −1.667 0.046* LEP（ng/mL） 2.59（0.54～12.21） 1.00（0.56～11.51） −3.614 < 0.001 LEPR（ng/mL） 3.05（1.29～27.29） 2.78（0.95～26.42） −1.069 0.285 注：*P < 0.05。 2.2 两组间TIMI帧数[M（P25,P75）]的比较
根据冠脉造影，采用TIMI帧数评价患者冠状动脉血流速度，包括左前降支（LAD），左回旋支（LCX），右冠状动脉（RCA）。比较CSFP组与NCF组的TIMI帧数，结果发现CSFP组的LAD（校正后）-TFC、LCX-TFC、RCA-TFC及平均TFC均高于NCF组（P < 0.05），说明CSFP组冠状动脉血流速度慢，见表2。
表 2 两组受试者TIMI帧数比较 [M（P25，P75）]Table 2. Comparison of TFC between the two groups [M（P25，P75）]项目 CSFP组（n = 54） NCF组（n = 46） Z P LAD（校正后）-TFC 38.31（37.47，40.78） 31.01（29.67，33.18） −2.323 0.020* LCX-TFC 26.67（24.83，28.39） 19.31（17.20，20.98） −2.309 0.021* RCA-TFC 26.11（23.89，27.66） 19.10（15.23，21.24） −2.337 0.019* Mean TFC 30.52（29.65，31.27） 22.95（21.53，24.67） −2.627 0.009# 注：*P < 0.05, #P < 0.01。 2.3 两组患者基因及基因型分布频率比较
LEPR rs1137100位点及LEPR rs1137101位点，G为野生型，A为突变型；LEP rs7799039位点，A为野生型，G为突变型。LEP rs7799039、LEPR rs1137100、LEPR rs1137101在CSFP组和NCF组之间的基因型分布频率均符合Hardy-Weinberg平衡，证明研究对象具有群体代表性（P > 0.05）。进一步对三个SNP位点基因及基因型分布频率进行分析、比较，结果显示，在CSFP组和NCF组患者中，LEP rs7799039、LEPR rs1137100、LEPR rs1137101基因及基因型分布频率无明显统计学差异（P > 0.05），见表3。
表 3 两组之间基因及基因型分布频率比较Table 3. Comparison of gene and genotype distribution frequency between the two groups基因型 CSFP组 NCF组 χ2 P Hardy-Weinberg检验（1） 频数 频率（%） 频数 频率（%） rs1137100 GG 37 68.5 32 69.6 0.721 0.739 0.89/0.82 GA 16 29.6 12 26.1 AA 1 1.9 2 4.3 G等位基因 90 83.3 76 82.6 0.018 0.892 A等位基因 18 16.7 16 17.4 rs1137101 GG 34 63.0 32 69.6 0.749 0.773 0.98/0.82 GA 18 33.3 12 26.1 AA 2 3.7 2 4.3 G等位基因 86 79.6 76 82.6 0.286 0.592 A等位基因 22 20.4 16 17.4 rs7799039 GG 2 3.7 2 4.3 2.173 0.343 0.68/0.99 GA 12 22.2 16 34.8 AA 40 74.1 28 60.9 G等位基因 16 14.8 20 21.7 1.614 0.204 A等位基因 92 85.2 72 78.3 注：（1）分别显示CSFP组/NCF组基因型Hardy-Weinberg平衡检测的P值。 2.4 冠状动脉慢血流的危险因素分析
将年龄、性别、吸烟史、高血压史、糖尿病史、LEP、LEPR、FBG、FINS、HOMA-IR、BMI、PLT、MPV、血脂等指标进行Logistic逐步回归分析，见表4，最终得到的模型为：LEP、HOMA-IR对应的OR值 > 1，提示LEP、HOMA-IR为影响冠状动脉慢血流的相关危险因素。
表 4 影响冠状动脉慢血流的二元Logistic回归分析Table 4. Binary logistic regression analysis of coronary slow flow变量 回归系数 标准误 Wald-χ2 P OR 95%CI HOMA-IR 0.092 0.048 3.595 0.038 1.096 1.005-1.205 LEP 0.241 0.110 4.800 0.028 1.273 1.026-1.579 3. 讨论
国内外研究者近来试图从分子生物学角度探寻CSFP的危险因素。X Cai等[15]发现GW26-e3963白细胞介素-10启动子多态性与CSFP的发生有关。瘦素及瘦素受体基因在心血管疾病的发生发展中起到一定作用，可作为心血管疾病发生的一个重要遗传学标志。本研究拟探索CSFP的危险因素并探讨瘦素及瘦素受体基因多态性与CSFP的相关性。
首先，笔者探索影响CSFP发生的危险因素。通过测定CSFP组与NCF组的血清瘦素、瘦素受体、胰岛素抵抗指数以及比较两组间相关临床资料，结果显示，CSFP组瘦素浓度、胰岛素抵抗指数显著高于NCF组，logistic回归分析证实瘦素、胰岛素抵抗是CSFP的危险因素。既往研究发现，血清瘦素水平的升高能够导致血管内皮收缩因子内皮素-1（endothelin-1,ET-1）与血管内皮舒张因子一氧化氮（nitric oxide,NO）失衡，从而降低冠状动脉舒张功能，增加微血管阻力[2]。同时，血清瘦素水平的升高可以诱导CRP、TNF-α、IL-6等炎症因子的表达，增加氧化应激，刺激血管平滑肌细胞增殖、迁移，促进动脉粥样硬化的发展[16]。另外，瘦素与胰岛素抵抗之间也存在一定联系，在对肥胖个体的研究中发现，大脑对瘦素敏感性的削弱会造成甘油三酯过多堆积，引起胰岛素敏感性降低，进而又可以促进胰岛素抵抗的发生[7]。在瘦素抵抗、胰岛素抵抗的情况下，心肌细胞发生糖类、脂肪等物质代谢紊乱，产生活性氧自由基、炎症介质，从而加剧了血管内皮的损伤[6]。既往研究表明[2]，由于雌激素对心血管内皮细胞具有一定保护作用和抗动脉粥样硬化作用，故男性患者在CSFP发生中居多。另外，吸烟会导致血管舒缩功能障碍，诱发微血管痉挛，导致冠状动脉血流速度减慢，也被认为是CSFP的另一危险因素。国内研究发现[17]，高血压是影响CSFP患者发展为主要心血管不良事件的独立危险因素。本研究显示CSFP组以男性比例较多，但logistic回归未证实性别为CSFP的危险因素，此外，吸烟、高血压与CSFP无相关性，与既往研究不一致，可能是因为样本量过小导致。
其次，笔者探讨瘦素及瘦素受体基因多态性与CSFP之间的相关性。本研究采用了SNaPShot技术对3个SNP位点进行检测，与一代测序技术和限制性内切酶法相比，具有精准度高、检测速度快、通量高的特点。通过研究显示，LEP rs7799039、LEPR rs1137100、LEPR rs1137101位点GG、GA、AA基因型以及G、A等位基因在CSFP组与NCF组之间分布频率相似，logistic回归分析显示，CSFP在3个SNP位点各基因型之间发病风险相似，说明瘦素及瘦素受体基因多态性与CSFP无相关性。其原因可能为：CSFP作为一种冠脉微循环障碍疾病，其病理机制复杂，虽然目前已经发现eNOS、白细胞介素、血管紧张素转化酶等多个基因异常表达与CSFP存在相关性[18]，但对基因多态性的研究结论有所不同，原因可能为基因多态性在不同种族、地域中表现形式不同。同时，研究样本量的差异也会导致结论具有争议。因此，仍需对CSFP基因多态性的大样本研究，必要时进一步作全基因组联合研究，以寻找CSFP的生物遗传学标志。
综述所述，本研究发现瘦素、胰岛素抵抗是CSFP的危险因素。此外，LEP rs7799039、LEPR rs1137100、LEPR rs1137101多态性与CSFP无相关性，有待于更大样本量或meta分析进一步来阐明瘦素及瘦素受体基因与CSFP的相关性，为CSFP的预防、诊疗提供新思路。
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图 1 DPSC的培养及多向分化能力鉴定
A：DPSC原代细胞（×50）；B：扩大培养第三代细胞（×50）；C：DPSC成骨对照组组染色所见（×100）；D：DPSC成骨诱导组染色所见（×100）；E：DPSC成脂对照组染色所见（×200）；F：DPSC成脂诱导组染色所见（×200）。
Figure 1. Culture of DPSC and appraisal of multi -directional differentiation ability
图 3 GFP转染DPSC不同时间荧光表达（×100）
A：36 h GFP转染DPSC的荧光表达；B：72 h GFP转染DPSC的荧光表达；C：96 h GFP转染DPSC的荧光表达。
Figure 3. Fluorescence expression of GFP transfected DPSC at different time
图 4 GFP-DPSC在Bio-Oss骨粉中的生长（×100）
A：第3天时GFP-DPSC在Bio-Oss骨粉中的状态；B：第14天时GFP-DPSC在Bio-Oss骨粉中的状态。
Figure 4. Growth of GFP-DPSC in Bio-Oss bone powder
图 7 1×105组同一视野下SEM图像
A：100 μm ；B：50 μm。
Figure 7. SEM images of 1×105 groups in the same field of view
图 8 2×105组同一视野下SEM图像
A：100 μm ；B：50 μm。
Figure 8. SEM images of 2×105 groups in the same field of view
图 9 4×105组同一视野下SEM图像
A：100 μm ；B：50 μm。
Figure 9. SEM images of 4×105 groups in the same field of view
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