Study on Osteogenic Ability of Dental Pulp Stem Cells at Different Concentrations
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摘要:
目的 探究不同浓度的牙髓干细胞（dental pulp stem cell，DPSC）在定量Bio-Oss骨粉中最佳的成骨比例。 方法 收集牙髓组织、组织块贴壁法分离培养原代细胞，流式细胞术鉴定DPSC表面标志物，诱导成骨及成脂鉴定DPSC多向分化潜能；GFP慢病毒转染DPSC，嘌呤霉素筛选GFP-DPSC；设置1×105、2×105、4×105、8×1054组细胞数接种于0.05 g骨粉并成骨培养，对照组不加骨粉，第3天和第7天进行碱性磷酸酶活性测定；培养第7天在扫描电镜下观察细胞在骨粉内的形态变化。 结果 原代分离培养成功的DPSC符合间充质干细胞来源，相关表面标记物高表达，可向成脂和成骨分化；GFP成功转染DPSC，第3天和第7天进行碱性磷酸酶活性检测，实验组均高于对照组，差异具有统计学意义（P < 0.05）；扫描电镜发现DPSC在骨粉表面爬行，部分细胞伸出伪足，4×10 5和8×105 2组细胞较为密集。 结论 4×105～8×105个DPSC与0.05 g Bio-Oss骨粉复合培养成骨效果较好，可以缩短成骨周期，细胞若接种过多，成骨效果反而抑制，造成干细胞的浪费。 Abstract:Objective To explore the optimal osteogenic ratio of Dental pulp stem cells （DPSC） with different concentrations in quantitative Bio-Oss bone powder. Methods The primary cells were isolated and cultured by adherent method. The surface markers of DPSC were identified by flow cytometry, and the multidirectional differentiation potential of DPSC was identified by osteogenesis and adipogenesis. DPSC was transfected with GFP lentivirus, and GFP-DPSC was screened with puromycin. The cells in groups 1×105, 2×105, 4×105 and 8×105 were inoculated with 0.05 g bone powder and cultured for osteogenesis, while the control group did not add bone powder. Alkaline phosphatase activity was measured on day 3 and day 7. On the 7th day of culture, the morphological changes of the cells in bone powder were observed under scanning electron microscope. Results The DPSC was derived from mesenchymal stem cells with high expression of related surface markers and could differentiate into adipogenic and osteogenic cells. GFP was successfully transfected into DPSC, and alkaline phosphatase activity was detected on the 3rd and 7th day, and the experimental group was higher than the control group, and the difference was statistically significant （P < 0.05）. Scanning electron microscopy showed that DPSC crawled on the surface of bone powder, and some cells extended pseudopodia, and the cells of 4×10 5 and 8×105 groups were more dense. Conclusions The combined culture of 4×105-8×105 DPSC and 0.05 g Bio-Oss bone powder has a good osteogenic effect, which can shorten the osteogenic cycle. If the cells are inoculated too much, the osteogenic effect is inhibited, resulting in the waste of stem cells. -
肺癌作为最常见的恶性肿瘤之一，目前仍是导致癌症死亡的主要原因[1]，据统计每年有209万人死于肺癌，占癌症死亡的18 %（约为五分之一）。其发生多是由于长期吸烟或长期处于吸烟环境、暴露于氡气、环境污染等因素引起[2-3]。据报道肺癌患者在确诊后5 a的存活率仅为10%～20 %。因此有必要为肺腺癌患者确定新的治疗靶点和预后预测指标[1-4]。
Long non-coding RNAs（LncRNAs）是一种长度超过200个碱基对的非编码转录本，相比于蛋白质编码转录本，lncRNAs具有较少的外显子，低表达并且在进化上是保守的[5-6]。根据蛋白质编码基因位置的不同，lncRNAs可以分为lincRNAs（基因间lncRNAs）、内含子lncRNAs、重叠lncRNAs、反义lncRNAs 4种类型[7-8]。lncRNAs的异常表达和突变与肿瘤的发生、转移和肿瘤分期密切相关，可以充当癌基因或抑癌基因调节肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭、凋亡，以及血管生成等，并最终作为肿瘤潜在的诊断和预后生物标志物[9-10]。LINC00341是一种新的长基因间非蛋白编码RNA，Li等[11]发现在结直肠癌中，LINC00341可以通过抑制细胞迁移和凋亡防止结直肠恶化；LINC00341也可以与miR-141相互作用，抑制其与抗凋亡因子YAF2结合，从而防止细胞凋亡和促进软骨细胞存活，阻止骨关节炎的进展[12]。MAPK作为常见的调控肿瘤细胞增殖的通路，Pan等[13]发现沉默CARD9可以通过激活MAPK/p38信号通路增强非小细胞肺癌的增殖能力；Liao等[14]发现PSPH也可能通过MAPK信号通路抑制非小细胞肺癌的增殖能力。
上述研究表明LINC00341在肿瘤恶化进展中的重要调节作用。本论文研究LINC00341在肺腺癌中的表达以及对肺腺癌发生发展的影响和可能的作用机制，旨在为肺腺癌提供新的预后因子和治疗靶点。
1. 材料与方法
1.1 主要试剂及仪器
RPMI 1640培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素溶液购于美国Gibco公司；RNA亚细胞分离试剂盒购于上海艾跃生物科技有限公司；转染试剂脂质体RNAi Max购于美国Thermo Fisher Scientific公司；STAT3、p-STAT3、ERK1/2、p-ERK1/2、p38、p-p38、GAPDH单克隆抗体购自美国Abcam公司；反转录试剂盒、qRT-PCR检测试剂盒购自北京全式金生物科技有限公司；BCA蛋白分析试剂盒和RIPA裂解液购自北京索莱宝科技有限公司；ECL化学发光底物试剂盒购自中国Biosharp公司。
1.2 生信分析以及 UM数据的RNA-seq验证
Affymetrix微阵列数据集（包括226个原发性肺腺癌组织[15]）用于生存分析。采用RMA方法进行归一化处理[16]。从SEO[17]和TCGA[18]中获得RNA测序数据集，包括394个肺腺癌组织和150个正常肺组织；从来自美国密歇根大学癌症中心队列UM中获得RNA测序数据集，包括67个肺腺癌组织和6个正常肺组织，转录本的表达水平均以FPKM38表示[19]。
1.3 ROC曲线分析和生存分析
采用受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线分析评估LINC00341在肺腺癌与正常组织中的诊断潜力。ggpolt2包（版本3.3.3）用于可视化，pROC包（1.17.0.1）用于分析。通过AUC（曲线下面积）测量诊断的准确性。利用R软件的survival包（版本3.2-10）进行Kaplan-Meier生存分析，曲线比较采用log-rank检验。
1.4 GO分析
共表达基因的GO功能富集分析是借助WebGestalt开展的（ http://www.webgestalt.org/）。WebGestalt支持12个生物体、342个基因标识符和155175个功能分类[20]。NES≥1、p-value≤0.05、FDR q-value≤0.25均表示有统计学意义。借助Cytoscape软件（版本3.7.2）用于可视化分析，利用R软件的limma包构建了图表。
1.5 细胞培养
人肺癌细胞系（PC-9）购自美国ATCC细胞培养中心，在含10 %胎牛血清的RPMI 1640中保存。细胞在37 ℃含5 % CO2恒温孵育箱中培养，每隔一日更换新鲜培养液。
1.6 细胞转染
实验分组为对照组（no-treatment control，NT）和LINC00341干扰组（siLINC00341），将细胞以1×106和（或）2×105密度分别接种于6孔板和（或）96孔板中培养过夜，待细胞长至30%～40 %时，用脂质体RNAi Max按照转染试剂说明手册步骤进行转染，48 h后收集细胞，并使用qRT-PCR验证转染效率。
1.7 WST-1实验、平板克隆实验检测PC-9细胞的增殖能力
细胞以适合密度接种于96孔板中，在培养24 h后用脂质体RNAi Max在Opti-MEM培养基中转染LINC00341 siRNA 和NT对照。每组设置5个复孔，每孔加入100 μL新鲜培养基，于37 ℃恒温培养箱中孵育48 h，随后去除原有培养基，并加入90 μL新鲜培养基以及10 μL WST-1试剂，培养2 h后，使用酶标仪检测在450 nm和630 nm波长处的光密度（optical density，OD）值，对结果进行统计学分析。
同时采用平板克隆实验检测siRNA沉默LINC00341后单个细胞增殖能力。将转染48 h后的肺腺癌细胞以每孔相同细胞密度（400～500个/孔）接种于6孔板中，培养2～3周后观察集落大小和数量。
1.8 RNA亚细胞定位
为了确定LINC00341的亚细胞定位，将细胞至于100 mm平板中，当达到80%～90 %融合度时按照RNA亚细胞分离试剂盒说明书提取细胞质和核RNA。细胞质RNA存在于上清液，核RNA存在于颗粒中。使用Power SYBR Green Master Mix和ABI StepOne实时聚合酶链式反应系统进行定量qRT-PCR。
1.9 Western blot
为了检测可能影响肺腺癌功能以及相关表型的通路，将细胞接种于6孔板中（1×106个/孔）。在LINC00341 siRNA处理48 h后加入蛋白裂解液提取细胞总蛋白，采用BCA法对细胞总蛋白进行定量分析。SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白后，转移到PVDF膜上，室温下用5 % 脱脂牛奶封闭2 h，将膜与稀释后的一抗（STAT3（1∶10000）、p-STAT3（1∶5000）、ERK1/2（1∶2000）、p-ERK1/2（1∶5000）、p38（1∶2000）、p-p38（1∶5000）、GAPDH（1∶8000）在摇床上4 ℃孵育过夜。二抗（1∶10000）在室温下孵育1 h后使用ECL试剂盒发光显影，并暴露在X射线胶片上，采用Image J软件对灰度值进行光密度分析。
1.10 统计学处理
数据采用GraphPad Prism 7.0和R软件进行分析。结果采用独立样本t检验对2组数据进行比较，以均数±标准差（
$\bar x \pm s $ ）表示，采用单因素方差分析对多组间进行比较。P < 0.05为差异具有统计学意义。2. 结果
2.1 LINC00341在肺腺癌中低表达并可作为诊断和预后标记物
结合前期研究队列（UM 67个LUADs和6个正常肺组织）和另外2个独立发表的LUAD队列SEO（85个LUADs和77个正常肺组织）和TCGA（309个LUADs和73个正常肺组织）的数据进行了ROC曲线分析。LINC00341在3个队列中与正常肺组织相比下调（P < 0.0001），见 图1A～图1C。AUC均大于0.7，表明LINC00341具有较好的诊断价值，见图1D～图1F。随后评估了2个独立的LUAD微阵列数据集中LINC00341与患者生存之间的关系，RMA（442 LUADs）和 Okayama （226 LUADs）。Kaplan-Meier生存曲线表明，LINC00341低表达组的生存率低于高表达组（P = 0.004），且与患者较差的预后相关，见图1G和图1H。
图 1 LINC00341 在肺腺癌细胞中的表达、ROC曲线以及生存分析A～C：UM，SEO和TCGA RNA测序数据集中，LUAD和正常肺组织样本中LINC00341表达水平散点图（3个数据集均P < 0.0001）；D～F：LINC00341在UM，SEO和TCGA 3个数据集中AUC值的ROC曲线；G～H：Kaplan-Meier曲线对LINC00341的生存分析。P < 0.05。Figure 1. Expression，ROC curve and survival of LINC00341 in lung adenocarcinoma cell2.2 GSEA
GO富集分析结果显示，生物学过程（biological process，BP）方面，LINC00341表达相关基因主要富集在RNA聚合酶II启动子转录调控、细胞凋亡、基因表达见图2A；分子功能（molecular functions，MF）方面主要富集在蛋白质的结合，见图2B。
图 2 LINC00341的GO富集分析A：靶基因生物学过程（BP）功能气泡图；B：靶基因分子功能（MF）功能气泡图。Figure 2. GO enrichment analysis of LINC003412.3 沉默LINC00341促进肺腺癌细胞增殖
转染LINC00341 siRNA后，与阴性对照组（NT）相比，LINC00341的mRNA表达量下降（P < 0.0001），表明成功转染，见 图3A。通过WST-1检测细胞的增殖能力，与阴性对照组相比，LINC00341沉默组细胞增殖能力增强（增殖能力提升大约23 %），差异具有统计学意义（P < 0.01），见图3B。利用平板克隆实验检测肺腺癌细胞系中单个细胞的增殖能力，差异具有统计学意义（ P < 0.01），见 图3C和图3D，说明LINC00341对肺腺癌细胞的生长有抑制作用。
图 3 沉默LINC00341对PC-9细胞增殖能力的影响A：qRT-PCR检测转染效率；B：WST-1方法检测LINC00341沉默后细胞增殖能力；C～D：平板克隆实验检测LINC00341后细胞克隆形成能力。**P < 0.01，**** P < 0.0001。Figure 3. Effect of silencing LINC00341 on proliferation ability of PC-9 cell2.4 LINC00341主要定位于细胞核
为了检测LINC00341在细胞中的具体定位，通过RNA亚细胞定位以及qRT-PCR发现LINC00341主要定位于细胞核。提示LINC00341可能参与染色质相互作用、转录调控和RNA加工过程，见图4A。
图 4 沉默LINC00341对通路蛋白的影响以及LINC00341的亚细胞定位A：qRT-PCR显示LINC00341在肺腺癌细胞中的核和细胞质部分；B：Western blot检测LINC00341沉默后STAT3（信号传导及转录激酶蛋白），ERK1/2（细胞外调节蛋白激酶）和P38（丝裂原活化蛋白激酶）蛋白表达情况；C：各个目的蛋白相对表达水平。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。Figure 4. Effect of silencing LINC00341 on proteins and subcellular localization of LINC003412.5 沉默LINC00341激活MAPK信号通路蛋白STAT3和ERK
用Western blot法检测沉默LINC00341后MAPK相关通路蛋白的表达水平。结果表明，与阴性对照组比，LINC00341干扰组肺腺癌细胞ERK1/2磷酸化水平，STAT3/p-STAT3蛋白表达水平升高，t-p38/p-p38表达水平降低，差异均具有统计学意义（P < 0.05），见 图4B和图4C。
3. 讨论
lncRNAs参与调控肿瘤的发生，单个lncRNA的上调或下调都有可能在病理或生理层面产生深远的影响[21]。目前已经有研究报道发现在人肺癌中发挥作用的众多lncRNAs，例如，Zhang等[22]发现lncRNA TUC338在肺癌组织中上调，沉默lncRNA TUC338会使细胞的侵袭能力降低，过表达lncRNA TUC338可以促进细胞增殖与侵袭能力；而且，发现LINC01123在非小细胞肺癌中上调，可作为分子海绵与miR-199a-5p结合增加c-Myc基因的表达，从而促进细胞增殖和有氧糖酵解[23]。虽然目前已经有很多lncRNAs被揭露在人类肿瘤中充当重要的调控因子，但LINC00341在肺腺癌患者诊断和预后中的的意义尚不清楚。LINC00341是一种新发现的lincRNAs，其编码序列位于SYNE3基因3’端非编码区和calmin基因5’端非编码区[24]。其编码序列位于SYNE3基因3′端非编码区和calmin基因5′端非编码区（CLMN）[24]。 Alvoro等[24]通过对骨折患者表达差异分析发现lncRNAs占主导，其中发现LINC00341的过表达诱导了典型成骨细胞基因的上调，导致分化。本课题从众多差异表达的lncRNAs[25]中发现LINC00341在肺腺癌中低表达且LINC00341与肺腺癌患者较好的预后相关。通过转染沉默LINC00341基因的靶向siRNA后发现，LINC00341沉默组中肺腺癌细胞的增殖能力得到增强。这提示LINC00341可能在肺腺癌的增殖中发挥关键作用。
丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPKs）是一类细胞内丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，MAPKs信号通路的信号传导主要有3大分支，包括细胞外信号调节激酶（ERKs），c-Jun氨基末端激酶（stress-activated protein kinase，SAPK）和p38激酶通路[26]。RAS作为MAPK信号通路的上游因子可激活该通路，该通路一旦被激活就会引起RAF的募集和激活，RAF激活后磷酸化并激活MEK1/2，MEK的激活可直接导致ERK1/2的磷酸化[27]。已有研究发现[28-29]，ERK作为MAPK家族的经典通路，主要负责将细胞外信号传递到细胞核，发挥调节细胞增殖、分化和转移的作用[29]。Ye等[30]发现沉默PRSS1可以抑制PAP-2的活性进而抑制ERK信号通路，从而抑制胃癌细胞的增殖与生长。本研究通过RNA亚细胞定位发现LINC00341定位于细胞核，同时Western blot结果显示p-ERK1/2的表达明显升高。这提示LINC00341改变肺腺癌细胞增殖能力可能与ERK信号通路的磷酸化有关。参与应激激活的p38丝裂原活化的蛋白激酶（MAPK）是通过磷酸化级联反应实现的，调节着细胞侵袭、细胞凋亡、细胞分裂和炎症反应等多个细胞过程[22-31]。已知p38/MAPK信号通路可以调节基因表达，已经有研究报道通过抑制p38可以增加p-STAT3的表达，这提示STAT3位于ERK和p38信号通路的下游[32]，STAT3/p-STAT3蛋白水平升高证明该通路活化。Jiang等[33]发现Kin17可以激活p38/MAPK信号通路进而促进甲状腺细胞的增殖。本研究结果显示，在PC-9肺腺癌细胞中，沉默LINC00341后t-STAT3、p-STAT3蛋白表达水平升高，p38总蛋白和p-p38蛋白表达水平降低。因此推测LINN00341干扰后，可通过激活ERK/p38-MAPK信号通路影响肺腺癌细胞的增殖能力。
综上所述，笔者的研究发现LINC00341在人类肺腺癌组织和细胞中表达下调，并与肺腺癌患者较好的预后有关。沉默LINC00341可通过激活ERK/p38-MAPK信号通路促进肺腺癌细胞增殖能力，成为肺腺癌新的诊断和预后标志物。但本研究仍存在不足，缺少体内成瘤实验支撑和MAPK通路回补实验，因此，LINC00341对表型的调控网络研究以及调控其靶蛋白的具体机制研究还有待进一步探究，有望为肺癌的诊断和治疗提供强有力的医学理论基础。
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图 1 DPSC的培养及多向分化能力鉴定
A：DPSC原代细胞（×50）；B：扩大培养第三代细胞（×50）；C：DPSC成骨对照组组染色所见（×100）；D：DPSC成骨诱导组染色所见（×100）；E：DPSC成脂对照组染色所见（×200）；F：DPSC成脂诱导组染色所见（×200）。
Figure 1. Culture of DPSC and appraisal of multi -directional differentiation ability
图 3 GFP转染DPSC不同时间荧光表达（×100）
A：36 h GFP转染DPSC的荧光表达；B：72 h GFP转染DPSC的荧光表达；C：96 h GFP转染DPSC的荧光表达。
Figure 3. Fluorescence expression of GFP transfected DPSC at different time
图 4 GFP-DPSC在Bio-Oss骨粉中的生长（×100）
A：第3天时GFP-DPSC在Bio-Oss骨粉中的状态；B：第14天时GFP-DPSC在Bio-Oss骨粉中的状态。
Figure 4. Growth of GFP-DPSC in Bio-Oss bone powder
图 7 1×105组同一视野下SEM图像
A：100 μm ；B：50 μm。
Figure 7. SEM images of 1×105 groups in the same field of view
图 8 2×105组同一视野下SEM图像
A：100 μm ；B：50 μm。
Figure 8. SEM images of 2×105 groups in the same field of view
图 9 4×105组同一视野下SEM图像
A：100 μm ；B：50 μm。
Figure 9. SEM images of 4×105 groups in the same field of view
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