Comparison of Two Induction Methods of Temporo-mandibular Joint Osteoarthritis in Rat Models
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摘要:
目的 通过被动张口和咬合紊乱2种方法建立大鼠颞下颌关节骨关节炎的模型，观察软骨和软骨下骨的病理变化来比较2种建模方法并评价其实用性。 方法 21只8周龄雄性SD大鼠随机分为4组，对照组（Control组）3只大鼠常规饲养。剩余18只大鼠随机分成3组：被动张口组（OP组），每天保持张口度20 mm，持续1 min；咬合紊乱组（OD组），0.25 mm的结扎丝包绕第一磨牙，结扎在第一磨牙的面；咬合紊乱对照组（ODS组）采用同样的手术方法，结扎结在第一磨牙的近中。4周后处死所有大鼠，解剖下颌骨后，通过Micro-CT，番红-O-固绿染色，HE染色来评估颞下颌关节的变化。 结果 OD组和OP组均出现了颞下颌关节骨关节炎样组织学改变，Micro CT分析都表现出骨体积分数的下降，骨体积比和骨小梁厚度在OD组与OP组的差异无统计学意义（P > 0.05）。OD组和OP组的改良Mankin评分均增高，但差异无统计学意义（P > 0.05），且OP组中有2个样本未出现颞下颌关节骨关节炎样组织学改变。 结论 咬合紊乱为较为稳定的大鼠颞下颌关节骨关节炎的建模方法，被动张口能造成大鼠颞下颌关节骨关节炎的组织病理学表现，但不稳定且效率较低。 Abstract:Objective To establish TMJ-OA rat models by occlusal disorder and forced open mouth, compare two TMJ-OA induction methods and assess their applicability by pathological changes in the cartilage, subchondral bone. Methods Twenty-one 8-week-old Sprague-Dawley （SD） male rats were divided into four groups, namely control group, and three rats were conventional feeding. eighteen SD rats were randomly allocated to three groups using the randomization table; each group had the same number of SD rats. The Forced open mouth （OP） , steady mouth opening was imposed to 20 mm daily （1 minute/day for 16 days）. the occlusal disorder group （OD）, an orthodontic ligation silk （0.25 mm diameter） revolved around the first molar, and a ligation knot was created on the first molar of the maxillary. The control group of occlusal disorder （ODS） use the same method, a ligation knot in the mesial of the first molar. Rat models were employed and followed for 4 weeks after experimental procedures, and TMJ joints in each group were harvested. The TMJ changes were evaluated by micro-CT, HE staining, and Safranin-O/Fast green staining. Results We found apparent histological phenotypes of TMJ-OA in the OP and OD groups, and observed a pronounced drop in bone volume fraction , BV/TV and Tb.Th between OD and OP groups had no significant difference （P > 0.05）, and a substantial increase in the modified Mankin score was found, there was no significant difference in the two groups （P > 0.05）, but two samples of OP group didn’t present apparent histological phenotypes of TMJ-OA. Conclusions Osteoarthritis-like pathological changes in the cartilage and subchondral bone can be observed in both of the two methods. The occlusal disorder is a stable TMJ-OA model, forced open mouth caused osteoarthritis-like changes, but it’s unstable and inefficient. -
Key words:
- Temporomandibular disorders /
- Osteoarthritis /
- Temporomandibular joint /
- Rat models /
- Occlusal disorder
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颞下颌关节骨关节炎（temporomandibular joint osteoarthritis，TMJ-OA）是颞下颌关节紊乱疾病中的一种，是一种退行性的疾病，临床上常伴有颞下颌关节的疼痛和功能障碍。其病因尚不明确，只有在颞下颌关节出现不可逆的损伤后，通过影像学检查诊断TMJ-OA。鉴于对于其发病机制的有限了解以及较低的愈合潜力，尚无有效的疗法可以恢复TMJ-OA的颞下颌关节形态。由于很难获得TMJ-OA的临床样本，因此建立覆盖整个疾病过程的动物模型具有重要意义。TMJ-OA动物模型是研究其病理，发病机制以及评估潜在治疗措施的关键方法[1]。TMJ-OA动物模型的建立方法主要包括关节腔内注射法，关节外诱导法，关节内手术法，基因敲除法。动物模型建立方法的选择取决于实验目的，关节腔内注射法可在短时间内诱发严重的终末期骨关节炎，却不符合TMJ-OA的临床发病过程[2]。关节内手术是评估创伤后TMJ-OA和早期软骨下骨变化的建模方法，但手术操作较复杂，创伤大[3]。基因敲除法发病自然，能够较好地模拟人类TMJ-OA的发病过程，但建模时间较长且形成的骨关节炎病变较轻[4]。关节外机械诱导有助于研究TMJ-OA结构和功能的变化[5]。本研究比较了2种关节外机械诱导建立的TMJ-OA动物模型，通过Micro CT以及组织学研究来评估关节软骨和软骨下骨的改变，比较2种建模方法的实用性。
1. 材料与方法
1.1 颞下颌关节骨关节炎动物模型的建立
SPF级八周龄SD雄鼠（200～210 mg）21只，从昆明医科大学动物实验中心购买，饲养于昆明医科大学动物实验中心，室内通风较好，室内温度保持在 20～22 ℃，光暗交替周期为12 h，进食符合标准实验大鼠饲料。每两天更换1次无菌纯水，每周更换3次垫料。随机分为4组，空白对照组共3只大鼠，常规饲养，剩余3组各6只大鼠，OP组每天保持张口度20 mm，持续1 min；OD组用持针器夹住0.25 mm的结扎丝穿过第一磨牙和第二磨牙之间，包绕第一磨牙，结扎在第一磨牙的面，造成颞下颌关节的异常受力；ODS组采用同样的手术方法，结扎结在第一磨牙的近中，不造成咬合紊乱（图1）。OD组与ODS均由同一人在麻醉状态下完成，结扎丝结扎的圈数保持一致，放置于第一磨牙颌面中央并每天检查是否有松动脱落等。本研究开始前已由昆明医科大学动物实验伦理审查委员会审查批准（kmmu20211473）。
1.2 样本制备
4周后过量3% 戊巴比妥处死所有实验动物，取下颌骨后，使用4%多聚甲醛固定，4 ℃过夜。流水冲洗2 h，浸泡于PBS中，样品尽量去除软组织，将样品用泡沫固定放入μCT 扫描管，用μCT扫描仪成像。将扫描后的样本粗略去除软组织，放置于10% EDTA离心管中进行脱钙，室温下放置在水平摇床上，每3天更换1次EDTA液，60 d后完成脱钙，放置于PBS液中清洗，梯度酒精脱水，脱水，浸蜡，石蜡包埋样本，包埋方向平行于颧弓，制作石蜡切片并进行组织学研究。
1.3 Micro CT扫描及数据分析
将样本置于圆柱形泡沫夹具中固定位置，放入uCT扫描管中扫描成像。 扫描电压为50 kVP，电流为200 μA，分辨率为5.0 μm/像素。扫描完成后，分别用NRecon1.6和CTAn1.8进行三维重建和分析。选取颞下颌关节髁下软骨下骨的矢状位图像进行三维组织形态分析。从髁突的中部和后部分别选取2个区域 （各0.5 cm×0.5 cm×0.5 mm）。在选定区域内，利用CTAn1.8软件自动计算出2个选取区域的骨体积分数（bone volume/tissue volume，BV/TV），骨小量厚度（trabecular thickness，Tb.Th） 等骨形态学参数，并与对照组进行比较。
1.4 组织学研究
为确保不同样本之间的可比性，首先要保持包埋方向一致，使用全自动半薄轮切片机（ＲM2265，徕卡） 切片时修正切片方向，每个样本连续切取6张切片，切片厚度4 μm，随后进行HE染色，番红-O-固绿染色，电子扫片机观察并进行图像采集（智跃医疗科技有限公司，中国江苏）。
1.5 标本评分
对采集的图像按照改良mankin评分标准[6-7]进行评分，见表1。
表 1 关节软骨改良Mankin评分标准Table 1. Modified mankin score of articular cartilage类别 分数 结构 正常 0 表层软骨破坏 1 血管翳及表层破坏 2 浅层裂隙形成达移行层 3 裂隙局限性深达骨质辐射层 4 深达骨质钙化层 5 全层软骨缺损 6 番红-O-固绿染色 正常 0 轻度失染 1 中度失染 2 重度失染 3 完全失染 4 细胞 正常 0 细胞过多，紊乱 1 细胞成簇 2 细胞少 3 潮线完整性 完整 0 血管通过不完整 1 总分 0～14分 评分结果是通过对每个部分进行2次以上评分的平均值来确定。 1.6 统计学处理
使用 Graphpad Prism9.0 统计软件对实验结果数据进行统计学分析。采用完全随机设计的方差分析（one-way ANOVA）检验，所有数据均为计量资料，且都符合正态分布用均数±均数的标准差（mean ± SD）表示，进一步两两比较采用LSD检验，P < 0.05 为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 颞下颌关节软骨下骨Micro-CT扫描
Control组和ODS组髁突软骨下骨骨小梁均匀，排列较为整齐有序，OP组与OD组的骨髓腔大而多，骨小量出现增宽现象，见图2。OP组与OD组骨体积比 （%，BV/TV） 以及骨小梁厚度 Tb.Th（mm）均降低。OP组与OD组的骨体积比与骨小梁厚度差异无统计学意义（P > 0.05），见图3。
图 3 骨体积比 （%，BV/TV） 以及骨小梁厚度 Tb.Th（mm）对比*P < 0.05；**P < 0.01；ns：P > 0.05。Figure 3. Comparison of BV/TV（%） and Tb.Th（mm）2.2 颞下颌关节骨关节炎的病理学改变
髁突HE染色显示：Control组和ODS组颞下颌关节软骨结构完整，表面光滑，软骨排列有序，层次明显，潮线完整，无血管通过。OP组和OD组软骨层变薄，层次结构排列紊乱，呈混乱排列，潮线扭曲不规则，并有血管通过，然而OP组结果不稳定，有2个样本未见明显颞下颌关节骨关节炎组织学改变，见图4。
番红-O-固绿染色显示：Control组和ODS组蛋白多糖分布均匀丰富，软骨基质红染，潮线完整清晰。OP组和OD组由于软骨降解，蛋白多糖大量丢失，软骨基质番红O最淡，红色染色面积减小，固绿染色明显，软骨表层破坏严重，潮线扭曲，见图5。
图 5 颞下颌关节番红-O-固绿染色（40×）A：control组；B：OP组；C：ODS组；D：OD组。Figure 5. TMJ Safranin-O/Fast green staining （40×）改良Mankin关节评分是根据番红-O-固绿染色评定的，根据番红-O-固绿染色的改良Mankin 评分显示，Control组是0分，ODS组是0分，而OP组计分为（4.833±4.021）分，OD组计分为（7.167±1.169）分，OP组与OD组的计分差异无统计学意义（P > 0.05），见图6。
图 6 改良Mankin评分比较ns：P > 0.05；*P < 0.05；****P < 0.001。Figure 6. Comparison of modified mankin score3. 讨论
近年来，学者们根据TMJ-OA的病因深入开发了TMJ-OA的动物模型以了解其发病机制，并寻求有效的治疗方法。现已开发了多种TMJ-OA动物模型，但都有其不足之处，还需要根据研究方向，为达到研究的预期目的，进一步研究模型制作的方法。TMJ-OA是以颞下颌关节软骨破坏与损耗为主要特征，伴发软骨，软骨下骨组织改建和滑膜相应病变，软骨下骨的改变不仅是TMJ-OA的主要病理变化的内容，而且其改变早于关节软骨的退变[8]。
有研究表明，雌激素对骨和软骨代谢有重要作用[9]。已有动物研究证实，雌激素缺乏导致髁突软骨变性，并在机械应力刺激下导致更严重的TMJ-OA样病变[10]。为了避免雌激素对实验结果的影响，本实验中的动物均选择雄鼠。
目前关节机械诱导主要包括强迫张嘴法和咬合异常法。越来越多的证据表明功能性咬合超负荷以及创伤会导致动物的颞下颌关节出现骨关节样改变，目前通过关节外诱导建立大鼠TMJ-OA动物模型的方法主要包括单侧前牙反，重复的最大开口度以及利用渐进性的咬合紊乱造成大鼠的咬合紊乱。因为大鼠以前伸运动为主，因此单侧前牙反合已经被证实是较为稳定的TMJ-OA动物模型建立方法[3, 11-12]。
有研究表明，大鼠开口度达25 mm，持续0.5 h，连续7 d后，会引起其咬肌及颞下颌关节显微结构的变化，因此建议手术过程中张口度应小于25 mm以避免混杂因素对实验结果造成影响[13]。孙莲等[14]选择6周的SD大鼠，在麻醉下被动开口至25 mm，每天3 h，持续5 d，大鼠的颞下颌关节出现了早期的关节炎样改变。Muto等[15]对8周的大鼠被动张口达20 mm，连续10次，这一程序持续10 d，观察到颞下颌关节出现了滑膜炎。目前的研究表明大张口对颞下颌关节造成的影响尚不明确，由于建模方法以及评估指标不同，通过大张口建立TMJ-OA动物模型的方法尚无统一标准。本研究对大张口建立大鼠TMJ-OA动物模型进行了改进，SD大鼠被动开口至20 mm，持续1 min，连续4周。这种建模方法的优点在于大张口持续的时间较短更能模拟临床，建模方法较为简单，可在大鼠清醒状态下进行，避免了麻醉对照组的建立。在笔者的研究中，20 mm大张口持续1 min会导致TMJOA早期组织学样改变，然而结果不稳定，提示笔者TMJ受环境和基因的影响。随着张口时间的增加是否会出现稳定的TMJ-OA动物模型有待进一步证实。
Sun等[16]提出了通过正畸力造成大鼠咬合紊乱的TMJ-OA动物模型，即在大鼠第一、第二和第二、第三磨牙之间填塞正畸用橡皮筋，推第一、第三磨牙移动约0.8 mm，建模结果类似于人类后牙脱落后继发的咬合变化，最终出现了软骨以及软骨下骨的退行性病变，然而建模时间较长，过程中存在多次手术的可能。本实验采用的结扎丝造成异常咬合力的动物模型模拟了异常的咬合力，建模后4周观察到了TMJ-OA的组织学改变，可以为早期病变机制研究提供模型。后期的实验可以设计时间轴观察咬合紊乱对于大鼠颞下颌关节的影响。动物实验的结果表明咬合紊乱会导致TMJ-OA的发生，但在动物模型中造成的咬合创伤是急性的，难以模拟临床的真实情况，因此关于咬合关系的改变与TMJ-OA之间的关系还需要进一步的实验研究来证实。
本研究采用了咬合异常法和强迫张口法建立TMJ-OA动物模型，通过大鼠髁突的Micro CT扫描、 HE 染色和番红-O-固绿染色观察得出，大鼠在强迫张口持续4周后，软骨下骨明显骨量减少，颞下颌关节软骨表层不平整，软骨层变薄，软骨细胞肥大，潮线不规则，出现颞下颌关节骨关节炎的软骨特征性改变。根据改良Mankin 关节评分，1～5 分定为颞下颌关节骨关节炎的早期，6～9 分定为颞下颌关节骨关节炎中期，10～14 分定为颞下颌关节骨关节炎晚期[6-7]。本实验通过被动张口的方法建立的大鼠动物模型改良Mankin评分为5分，符合初期的骨关节炎的评分，然而OP组有2个样本未出现骨关节炎样组织学改变，推测是因为强迫张口过程中大鼠的应激反应不同所造成的差异。通过咬合紊乱的方法建立的大鼠模型改良Mankin评分为7分，符合中期的骨关节炎的评分。ODS组改良Mankin评分为1分，推测是由于手术操作过程中不可避免的损伤所导致。
综上，本实验研究了咬合紊乱和被动张口2种方法对颞下颌关节造成的影响。2种方法均能使大鼠髁突发生骨关节炎改变。咬合紊乱是一种较为稳定成熟的建模方法，有利于研究颞下颌关节骨关节炎自然发生过程中的变化，大张口模型不稳定且效率较低，需要进一步的研究完善并统一建模方法。
致谢：本实验在云南省口腔重点实验室以及昆明医科大学动物实验中心完成，在此表示感谢.
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图 3 骨体积比 （%，BV/TV） 以及骨小梁厚度 Tb.Th（mm）对比
*P < 0.05；**P < 0.01；ns：P > 0.05。
Figure 3. Comparison of BV/TV（%） and Tb.Th（mm）
图 5 颞下颌关节番红-O-固绿染色（40×）
A：control组；B：OP组；C：ODS组；D：OD组。
Figure 5. TMJ Safranin-O/Fast green staining （40×）
图 6 改良Mankin评分比较
ns：P > 0.05；*P < 0.05；****P < 0.001。
Figure 6. Comparison of modified mankin score
表 1 关节软骨改良Mankin评分标准
Table 1. Modified mankin score of articular cartilage
类别 分数 结构 正常 0 表层软骨破坏 1 血管翳及表层破坏 2 浅层裂隙形成达移行层 3 裂隙局限性深达骨质辐射层 4 深达骨质钙化层 5 全层软骨缺损 6 番红-O-固绿染色 正常 0 轻度失染 1 中度失染 2 重度失染 3 完全失染 4 细胞 正常 0 细胞过多，紊乱 1 细胞成簇 2 细胞少 3 潮线完整性 完整 0 血管通过不完整 1 总分 0～14分 评分结果是通过对每个部分进行2次以上评分的平均值来确定。 
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