Effect and Mechanism of Twist1 Regulating Bmi1 on Invasion and Migration of Gallbladder Carcinoma Cells
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摘要:
目的 探讨Twist1对胆囊癌细胞侵袭转移的影响，以及对Bmi1、E-Cadherine、N-Cadherine的调控作用。 方法 构建Twist1 shRNA慢病毒载体感染GBC-SD细胞做为实验组，空载慢病毒感染GBC-SD细胞为阴性对照组，不做任何处理的GBC-SD细胞为空白对照组。细胞划痕及Transwell侵袭小室实验检测细胞的迁移及侵袭能力，Western blot及RT-PCR检测Twist1、Bmi1、E-Cadherine及N-Cadherine的蛋白及mRNA的相对表达量。 结果 与阴性组、空白组相比，实验组细胞划痕愈合度低、侵袭数少（P < 0.0001），而阴性组及空白组间细胞迁移率、侵袭数比较差异均无统计学意义（P > 0.05）。阴性组及空白组的Twist1、Bmi1、N-Cadherine的蛋白及mRNA的相对表达量明显高于实验组（P < 0.001），而E-Cadherine蛋白及mRNA的相对表达量则明显低于实验组（P < 0.0001），阴性组及空白组组间各蛋白及mRNA的相对表达水平比较差异无统计学意义（P > 0.05）。 结论 靶向沉默Twist1可以抑制胆囊癌细胞的迁移侵袭，其机制可能与抑制Bmi1的表达及抑制上皮间质转化过程相关。 Abstract:Objective To investigate the effect of Twist1 on invasion and metastasis of gallbladder carcinoma cells and the regulation of Bmi1, E-Cadherine andN-Cadherine. Methods Twist1 shRNA lentivirus vector was constructed to infect GBC-SD cells as the experimental group. The empty lentivirus-infected GBC-SD cells were the negative group, and the untreated GBC -SD cells were the blank group. Cell migration and invasion ability were detected by cell scratch and Transwell chamber invasion assay. Western blot and RT-PCR were used to detect the relative expression levels of Twist1, Bmi1, E-Cadherine and N-Cadherine. Results Compared with the negative and blank groups, the experimental group had a lower cell scratch healing degree and fewer invasion numbers （P < 0.0001）. There was no significant difference in cell migration rate and invasion number between the two control groups （P > 0.05）. The relative expression levels of Twist1, Bmi1 and N-Cadherine in the negative group and blank group were obviously higher than those in the experimental group （P < 0.001）. The relative expression levels of E-Cadherine protein and mRNA were obviously lower than those of the experimental group （P < 0.0001）. There was no significant difference in the relative expression levels of protein and mRNA between the negative group and the blank group （P > 0.05）. Conclusion Targeted silencing of Twist1 can inhibit the migration and invasion of gallbladder carcinoma cells, and the mechanism may be related to inhibiting the expression of Bmi1 and the process of epithelial-mesenchymal transformation. -
Key words:
- Gallbladder neoplasm /
- Twist1 /
- Bmi1 /
- Epithelial-mesenchymal transition /
- Invasion /
- Metastasis
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患者在行主动脉瓣置换后，有1%～3.5%的比率出现瓣周漏的状况，在大多数情况下，术后漏是轻微的，不会带来临床后果[1]。在瓣周漏的筛查方法中，二维经胸超声心动图（2D-TTE）是一类常规方法，方便快捷的同时也暴露出准确度不足的缺点[2]。而经食管三维超声（RT-3D-TEE）从后方观察主动脉瓣，对整体图像的显示更加清晰，具有准确度高的优点，但由于操作复杂，部分医师仍将2D-TTE作为瓣周漏的首选检查方式[3]。本文通过对50例疑似瓣周漏患者的2D-TTE和RT-3D-TEE的检查结果与术中实际观察进行比较，探讨二者对主动脉瓣置换术后瓣周漏评估的临床意义，现将结果报告如下。
1. 资料与方法
1.1 研究对象
本研究连续入选2015年1月至2018年12月北华大学附属医院收治的主动脉瓣置换术后患者70例。纳入标准：（1）年龄≥18岁且 < 70岁，男女不限；（2）成功进行了主动脉瓣置换术且有再次手术指征并同意再次手术；（3）签署知情同意书；（4）临床资料完整。排除标准：（1）合并严重高血压、糖尿病及重要器官功能不全等慢性疾病或其他手术禁忌症者；（2）合并神经精神类疾病者；（3）拒绝参加本研究或不能配合相关检查者。本研究经北华大学附属医院医学伦理委员会审批同意。
70例纳入患者中，男性42例，女性28例；年龄24～69岁，平均（47.3±6.8）岁，其他资料见表1。
表 1 患者一般资料Table 1. General information of patients项目 临床特征 n 构成比（%） 原发疾病 风湿性心脏病 45 64.29 先天性心脏病 8 11.43 瓣膜退行性变 7 10 感染性心内膜炎 10 14.28 人工主动脉瓣类型 机械瓣 52 74.29 生物瓣 18 25.71 首次换瓣至本次
入院时间间隔<1 a 21 30 1～5 a 15 21.43 >5 a 34 48.57 本次就诊症状 呼吸困难 44 62.86 活动后心悸 65 92.86 心绞痛 38 54.29 发热 15 21.43 贫血 10 14.29 手术方式 瓣周漏修补术 57 81.43 二次换瓣术 13 18.57 1.2 检查方法
使用RT-3D-TEE及2D-TTE对纳入患者进行术前检查，2个检查分别由2组经验丰富的影像科医师完成，在得出报告前对另一个超声检查结果不知情。仪器为Philips HD7彩色多普勒超声诊断系统（购自徐州淮博仪器设备有限公司），配S5-1探头（设定频率为1～5 MHz）和X7-2T经食管矩阵多平面实时三维探头（设定频率为2～7 MHz）。2D-TTE检查：纳入患者采用平卧位或左侧卧位，检查全程连接体表同步心电图。首先观察人工瓣膜的结构和启闭功能，初步判断瓣周漏部位、大小以及主动脉瓣反流程度。RT-3D-TEE检查：2D-TTE检查后仍采用食管探头由口腔插入，直至深度距门齿约30 cm，探头扫查0～180°范围。在二维和彩色多普勒扫描清晰显示人工瓣膜及瓣架，采用三维变焦模式和全体积广角采集模式调整取样框的位置和大小使其完整纳入人工瓣膜的瓣环及其周围组织，对三维灰阶增益进行适当调节，在以原始图像格式储存图像，通过传输进入计算机进行脱机分析，观察瓣周漏的位置、破口范围、反流情况及是否存在赘生物或瓣周脓肿等情况，与术中所见进行比较。
1.3 观察指标
（1）患者一般资料，包括：性别、年龄、原发疾病、人工主动脉瓣类型、首次换瓣至本次入院时间间隔、本次就诊症状及手术方式；（2）2D-TTE与RT-3D-TEE在瓣周漏诊断率方面的比较；（3）2D-TTE与RT-3D-TEE在瓣周漏位置及破口范围方面的比较；（4）2D-TTE与RT-3D-TEE在瓣周其他情况方面的比较。
1.4 统计学处理
采用SPSS26.0统计学软件进行数据处理分析，计量资料以（
$\bar x \pm s $ ）表示，采用独立样本t检验。计数资料以百分率（%）表示，采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。2. 结果
2.1 2D-TTE与RT-3D-TEE在瓣周漏诊断及程度方面的比较
以术中观察结果为“金标准”，70例疑似患者中，瓣周漏患者45例（含合并其他瓣膜疾病），非瓣周漏患者25例，其中，感染性心内膜炎3例，瓣膜狭窄5例，瓣膜挛缩3例，瓣膜钙化撕裂1例，主动脉瓣机械瓣卡瓣8例，倾碟瓣5例。2D-TTE诊断正确52例，其中，明确诊断瓣周漏30例，疑似诊断瓣周漏6例，正确诊断非瓣周漏16例；误诊9例（非瓣周漏诊断为瓣周漏）；漏诊9例，总诊断正确率74.29%。45例瓣周漏中，2D-TTE正确诊断出36例，诊断正确率80%，25例非瓣周漏中，2D-TTE正确诊断16例，诊断正确率64%。RT-3D-TEE诊断正确50例，其中，明确诊断瓣周漏42例，疑似诊断瓣周漏3例，正确诊断非瓣周漏25例。RT-3D-TEE的诊断准确率（100.0%）高于2D-TTE（74.29%），差异有统计学意义（χ2 = 20.656，P < 0.01）。
2.2 2D-TTE与RT-3D-TEE在瓣周漏位置及破口范围方面的比较
在2D-TTE诊断的36例瓣周漏中，5例破口处于左冠瓣区，8例处于右冠瓣区，11例为多个破口或破口面积超过单个瓣叶区域，其余12例分区不明确。在RT-3D-TEE诊断的45例瓣周漏中，9例破口处于左冠瓣区，15例处于右冠瓣区，18例为多个破口或破口面积超过单个瓣叶区域，其余3例分区不明确，经手术证实，RT-3D-TEE诊断的漏口位置与范围与术中观察基本一致。
对2种方式均正确诊断患者的破口进行测量，共24例（37个破口），其中1个破口13例，2个破口9例，3个破口患者2例，2D-TTE与RT-3D-TEE在测量瓣周漏破口的长度和宽度方面，差异无统计学意义（P > 0.05），见表2，图1，2。
表 2 2D-TTE与RT-3D-TEE测量瓣周漏破口大小比较[（$\bar x \pm s $ ），mm]Table 2. Comparison of perivalvular leak size measured by 2D-TTE and RT-3D-TEE [（$\bar x \pm s $ ），mm]检查方法 例数（破口数） 破口长度 破口宽度 2D-TTE 24（37） 5.8 ± 0.9 4.7 ± 0.6 RT-3D-TEE 24（37） 5.6 ± 0.7 4.5 ± 0.7 t 1.067 0.152 P 0.290 0.191 
图 1 2D-TTE示主动脉瓣位人工瓣瓣环右前方新月形瓣周裂隙Figure 1. 2D-TTE shows a crescent-shaped perivalvular fissure right front of the artificial valvular ring in aortic position
图 2 RT-3D-TEE示主动脉瓣位人工瓣瓣环前方大量瓣周漏Figure 2. RT-3D-TEE shows a large amount of perivalvular leakage in front of the artificial valvular ring at aortic position2.3 2D-TTE与RT-3D-TEE在瓣周其他情况方面的比较
术中发现，9例患者合并瓣环部分脱位，6例合并瓣周脓肿，3例合并二尖瓣机械瓣卡瓣，RT-3D-TEE全部诊断正确，2D-TTE正确诊断合并瓣环部分脱位6例，合并瓣周脓肿3例，漏诊合并二尖瓣机械瓣卡瓣3例。RT-3D-TEE对合并有瓣环脱位、瓣周脓肿、二尖瓣卡瓣的诊断准确度高于2D-TTE。
3. 讨论
3.1 行主动脉瓣置换后瓣周漏的临床特征
患者在行心脏瓣膜置换后，瓣周漏是最严重的并发症之一，也是二次手术的常见原因之一，其发病率约为2%～5%[4]。二尖瓣与主动脉瓣是心脏瓣膜置换术中最常见的两个部位，与二尖瓣置换术后瓣周漏相比，主动脉瓣置换术后瓣周漏发病率较低，约为1%～3.5%，然而主动脉瓣所处部位流速快、量大、分流压差大，更易导致心内膜炎、心脏扩大、心功能不全等严重后果，因此主动脉瓣术后瓣周漏的预后较差，需要及时诊断并采取干预措施[5-7]。
3.2 超声诊断瓣周漏的临床价值
2D-TTE是诊断瓣周漏的传统检查方法，操作简便，整体诊断准确率较好，但限于观察角度，加之人工瓣膜声影对主动脉瓣两侧壁及后方的显像造成影响，最终导致在无冠瓣区和左冠瓣区的瓣周漏诊断上尚存在不足[8-9]。此外，由于无法获得主动脉瓣瓣周漏的立体图像，对漏口实际面积的测量较为困难[10]。而RT-3D-TEE的探头位于心脏后方，可在180°范围内多方位多角度对主动脉瓣进行观察，很好地弥补了2D-TTE的不足之处[11]。从本次研究的结果来看，70例患者中，术中确诊瓣周漏患者45例，非瓣周漏患者25例，RT-3D-TEE全部诊断正确，而2D-TTE在45例瓣周漏患者中诊断出36例，在25例非瓣周漏患者中误诊9例，总诊断准确率为74.29%，RT-3D-TEE的诊断准确率显著高于2D-TTE（P < 0.01），与赵星等[12]研究的结果一致，充分证明了RT-3D-TEE在诊断主动脉瓣置换术后瓣周漏上具有低误诊率和漏诊率的优势。但Kliger等[13]的研究结果认为2种方法在诊断准确率方面无显著差异，我们认为原因在于各医院间RT-3D-TEE检查的开展情况不同，相应医师间的经验同样存在差异。在瓣周漏破口位置的辨别上，RT-3D-TEE诊断出瓣周漏45例，正确辨别破口位置42例，2D-TTE诊断出瓣周漏36例，正确辨别破口位置24例；在瓣周其他情况的辨别上，RT-3D-TEE全部正确诊断，而2D-TTE漏诊合并瓣环部分脱位3例、合并瓣周脓肿3例、合并二尖瓣机械瓣卡瓣3例，共漏诊9例，这得益于RT-3D-TEE的探头可通过旋转模仿手术视野，在检查过程中向医师清晰展示漏口与周围组织的关系，可直观地体现瓣环的活动度[9, 14]。
本文限于病例数量，未能从敏感度、特异度等指标方面对两种超声手段进行比较，对结论的支持存在一定不足。此外，RT-3D-TEE的诊断结果与医生的临床经验、影像学经验等客观因素密切相关，靠单一研究得出的结论尚难以在临床上推广。因此，在今后的研究中需要扩大样本量，采取多中心对照试验的方式对2D-TTE及RT-3D-TEE的诊断价值行进一步比较。以往研究发现，心脏瓣膜置换术后发生瓣周漏与以下因素有关：（1）瓣膜本身的病变程度严重，出现钙化、周围组织水肿等情况均可造成瓣周漏；（2）外科操作技术不足，如打结过松、针距过宽等；（3）术后感染的发生同样增加了瓣周漏的风险[15-17]。因此，日后可以将瓣周漏的危险因素一并纳入，对术后疑似瓣周漏的患者进行危险分级，分析其对提高瓣周漏的诊断准确度是否有价值。
综上所述，RT-3D-TEE因其观察位置的特殊性表现出对人工瓣膜整体观图像上的优势，是对2D-TTE诊断主动脉瓣置换术后瓣周漏的良好补充，但操作难度较大，对医生的临床经验提出了较高的要求。因此，临床上应结合患者一般情况及医生的工作经验选择合适的检查方式。
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图 1 成功感染慢病毒并经过筛选后的细胞生长情况（10×）
A：Twist1组；B：NEG组。
Figure 1. Growth of cells successfully infected with lentivirus and screened （10×）
图 2 细胞划痕实验检测GBC-SD细胞的迁移能力（4×）
A：Twist1组0 h；B：NEG组0 h；C：GBC-SD组0 h；D：Twist1组48 h；E：NEG组48 h；F：GBC-SD组48 h；G：3组48 h细胞迁移率。ns为P > 0.05，****为P < 0.0001。
Figure 2. 2 Migration ability of BGC-SD cells detected by cell scratch assay （4×）
图 3 侵袭实验检测GBC-SD细胞的侵袭能力（10×）
A：Twist1组；B：NEG组；C：GBC-SD组；D：3组细胞穿膜细胞数，ns为P > 0.05，****为P < 0.0001。
Figure 3. Invasion assay to detect the invasion ability of BGC-SD cells （10×）
图 4 Western Blot检测各组细胞Twist1、Bmi1、E-Cadherine及N-Cadherine蛋白表达水平柱状图
Figure 4. Histogram of protein expression levels of Twist1，Bmi1，E-Cadherine and N-Cadherine in each group detected by Western Blot
图 5 Western Blot检测各组细胞Twist1、Bmi1、E-Cadherine及N-Cadherine蛋白表达水平
ns为P > 0.05，***P < 0.001，****P < 0.0001。
Figure 5. The expression levels of Twist1，Bmi1，E-Cadherine andN-Cadherine in each group were detected by Western Blot
图 6 qPCR检测各组细胞Twist1、Bmi1、E-Cadherine及N-Cadherine mRNA表达水平柱状图
ns为P > 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，****P < 0.0001。
Figure 6. mRNA expression columns of Twist1，Bmi1，E-Cadherine and N-Cadherine in each group were detected by qPCR
表 1 相关引物序列
Table 1. Sequence of relevant primers
基因 序列 碱基数 Twist1-F AGCTGAGCAAGATTCAGACC 20 Twist1-R CAGCTTGCCATCTTGGAGTC 20 Bmi1-F GACTCTGGGAGTGACAAGGC 20 Bmi1-R ACTGGAGTACTGGGGCTAGG 20 E-Cadherine-F GGCTGGACCGAGAGAGTTT 19 E-Cadherine-R GCTGTGGAGGTGGTGAGAG 19 N-cadherin-F GACTGGGTCATCCCTCCAATCAACT 25 N-cadherin-R GGGGCTTTGTCACCGACAGC 20 Gapdh-F CGCTGAGTACGTCGTGGAGTC 21 Gapdh-R GCTGATGATCTTGAGGCTGTTGTC 24 
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表 2 各组细胞Twist1表达情况（
$n\;=\;3$ ，$\bar x \pm s $ ）Table 2. Expression of Twist1 in each group （
$n\;=\;3$ ，$\bar x \pm s $ ）组别 Twist1 mRNA 蛋白 Twist1组 0.35 ± 0.02ab 0.35 ± 0.20ab NEG组 1.26 ± 0.23 0.95 ± 0.21 GBC-SD组 1.00 ± 0.48 1.01 ± 0.18 F 34.11 31.03 P 0.0005* < 0.0001* *P < 0.05；与NEG组比较，a P < 0.0001；与GBC-SD组比较，b P < 0.0001。
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表 3 各组细胞划痕愈合度及侵袭细胞数（
$n\;=\;20$ ，$\bar x \pm s $ ）Table 3. Scratch healing degree and number of cells invaded in each group （
$n\;=\;20$ ，$\bar x \pm s $ ）组别 细胞划痕愈合度（%） 穿膜细胞数（个） Twist1组 26.75 ± 19.89ab 34.95 ± 6.61ab NEG组 66.54 ± 7.37 327.00 ± 34.85 GBC-SD 63.37 ± 9.91 314.50 ± 32.08 F/χ² 147.6 40.39 P < 0.0001* < 0.0001* *P < 0.05；与NEG组比较，a P < 0.0001，与GBC-SD组比较，b P < 0.0001。
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