Clinical Correletions between Helper T Cells 17，Regulatory T Cells and Chronic Actinic Dermatitis
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摘要:
目的 探讨外周血中辅助性T淋巴细胞17（Th17 cells）和调节性T淋巴细胞（Treg cells）在慢性光化性皮炎 （chronic actinic dermatitis，CAD）发病机制中可能的作用。 方法 流式细胞术检测25例CAD患者及20名健康志愿者外周血CD4+T淋巴细胞中Th17细胞/Tregd 的比值，同时应用免疫组织化学法检测25例CAD患者和10例健康人皮肤组织皮损白介素-17（IL-17）、叉头转录因子p3 （Foxp3）的表达。 结果 CAD患者Th17明显高于志愿者；CAD患者Treg细胞明显少于志愿者（P < 0.05）；CAD患者的Th17/Treg显著高于健康志愿者（P < 0.05）。Th17细胞和EASI评分2者间存在正相关关系（P < 0.05）；Treg细胞和EASI评分间存在负相关关系；CAD组患者皮损中IL-17高表达，与健康对照组相比，差异有统计学意义（P < 0.05），Foxp3在皮肤中的表达与健康对照组相比差异无统计学意义（P > 0.05）。 结论 CAD患者存在Th17 /Treg的失衡，由此导致的免疫反应向促炎方向发展，可能是CAD重要的发病机制。 -
关键词:
- 慢性光化性皮炎 /
- 辅助性T淋巴细胞17 /
- 调节性T淋巴细胞
Abstract:Objective To investigate the the possible roles of helper T cells 17 （Thl7 cells） and regulatory T cells （Treg cells） of chronic actinic dermatitis. Methods The percentages of Th17 cells and Treg cells in CD4+ T cells in peripheral blood of 25 CAD patients and 20 healthy volunteers were detected by flow cytometry, and the expression of IL-17 and Foxp3 in skin lesions of 25 patients with chronic actinic dermatitis and 10 healthy people were detected by immunohistochemistry. Results Compared with the healthy volunteers, Th17 cells in CAD patients were significantly more than those in volunteers; Treg cells in CAD patients were significantly less than those in volunteers; Th17/Treg in CAD patients was significantly higher than that in volunteers and all the differences were statistically significant （P < 0.05）. The correlation coefficients of Th17 cells and EASI scores showed that there was a positive correlation between them （P < 0.05）; the correlation coefficients of Treg cells and EASI scores showed that there was a negative correlation between them. The expression of IL-17 in lesions of CAD group was higher than that of healthy control group and the difference was statistically significant （P < 0.05）. There was no significant difference in the expression of Foxp3 in the skin compared with the healthy control group （P > 0.05）. Conclusion The imbalance of Th17/Treg in patients with CAD leads to the development of immune response to pro-inflammatory, which may be an important pathogenesis of CAD. -
Key words:
- Chronic actinic dermatitis /
- T help cells 17 /
- Regulatory T cells
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有学者早在上个世纪末就提出了纤维桩（fiber post，FP）的概念[1]，把流动的环氧树脂基质注入到大量的纤维束中，形成一个纤维整体，缺损较大的残根残冠通常使用纤维桩来进行修复，纤维桩起到了余留牙体与复合树脂核（composite resin core，CRC）之间的桥梁作用，使得残根残冠发挥最大的利用价值。然而纤维桩也并不是那么完美，临床上存在一定数量的失败病例，统计常见的失败病例为纤维桩在牙体中松动或者脱落，原因为粘接失败所致[2-3]。目前对于临床上，经常使用于纤维桩表面处理的方法及其应用效果尚存在很多争议，也尚未形成统一标准，因此通过探讨各种纤维桩表面处理方法来增强纤维桩与树脂水门汀之间的粘结力问题具有重要的临床指导意义。
1. 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 离体牙的选择
选择近半年内因正畸需要拔除的完整下颌单根管前磨牙50颗。将所有离体牙浸泡在0.9%生理盐水中储存。纳入标准：牙体无楔缺，无龋坏，无隐裂纹，无牙内吸收，牙根长度差异在1 mm以内。
1.1.2 材料和仪器
（1）直径1.5 mm的玻璃纤维桩（康特威尔登特齿科有限公司，美国）；（2）DUO-LINK双固化复合树脂粘接材料（美国BISCO公司）；（3）硅烷偶联剂（义获嘉伟瓦登特公司，列支敦士登）；3%氢氟酸（美国BISCO公司）；3%过氧化氢溶液（昆明利健消毒制品有限公司，中国）；0.9%生理盐水（四川科伦药业股份有限公司）；（4）平行研磨仪（深圳瑞斯特仪器仪表有限公司，中国）石膏切割机（平阳瑞丰材料科技有限公司，中国）超声清洗仪（CP-104意大利）；万能试验机（长春试验仪器有限公司，中国）；扫描电子显微镜（蔡司，德国）；体视显微镜（蔡司，德国）；电热恒温水浴箱（邦西仪器科技有限公司，上海）。
1.2 方法
1.2.1 纤维桩的表面处理
将准备好的50根纤维桩分为5组，每组10根，使用超声清洁机对纤维桩进行清洗10 min，取出吹干，进行表面处理：A组（空白组）不做任何处理；B组（硅烷偶联剂处理组）硅烷偶联剂浸泡纤维桩下段4 mm 1 min，取出吹干后备用；C组（选择性酸蚀处理组）3%氢氟酸浸泡纤维桩下段4 mm 10 s，超声清洗用30 s，吹干；D组（过氧化氢溶液处理组）3%过氧化氢溶液浸泡纤维桩下段4 mm 10 min，超声清洗30 s，吹干；E组（喷砂处理组）笔式喷砂机在0.28 MPa压力下，以100目氧化铝砂粒垂直与纤维桩下段4 mm表面进行喷砂处理，喷砂头距离纤维桩30 mm，持续时间为15 s，处理后的纤维桩超声清洗30 s，吹干。
1.2.2 试件制作
将收集的离体牙用切割机垂直于牙体长轴，以颊舌侧釉牙骨质界最低点的连线为截断平面截去牙冠（图1），用水平研磨仪以平行截断平面下4 mm再次截断牙体组织（图2），保证截取的牙体组织上下两面保持平行，慢速手机1.5 mm的桩道成型钻以根管口为中心制备桩道，成型钻垂直于截断平面，桩道形成直径为1.5 mm、高4 mm的圆柱体（图3、4）。将处理好的纤维桩分别粘接于牙体组织内，完成带有纤维桩的牙体组织试件（图5）。试件浸泡于37℃恒温生理盐水中24 h。
1.2.3 力学测试
将试件取出，吹干试件表面的水分，夹具上部夹持纤维桩根外段，夹具下部固定牙体组织，试件固定在万能试验机上，选择符合的拉伸头，以0.5 mm/min的速度对试件进行拉伸（图6），并且保持拉力方向与纤维桩长轴平行，直到纤维桩从牙体组织中完全拉出停止施力。选取在应力与时间曲线图上急剧减弱的数值为最大破坏载荷F，粘结面积公式S = Πdh（图7），粘接强度P=最大应力值F/粘结面积S。
1.2.4 电子显微镜观察
20倍体式显微镜下观察拉出后的纤维桩表面，将粘接界面分为以下3种方式：I型为粘接剂与纤维桩分离，纤维桩表面无粘接剂覆盖；Ⅱ型为粘接剂与根管壁分离，纤维桩表面为粘接剂覆盖；Ⅲ型为混合型粘接破坏，纤维桩表面部分有粘接剂覆盖，部分无粘接剂覆盖。
1.3 统计学处理
统计学分析采用SPSS 22.0统计分析软件，本次试验所获得的数据组间的比较采用单因素方差分析（one-way anova），用
$\bar x \pm s $ 公式表示，以显著性（P值）作为判断标准，原假设为实验方法的变量之间不存在显著差异，当P > 0.05时，原假设成立，即变量之间不存在显著差异，当P < 0.05时，原假设不成立，即变量之间存在显著性差异，具有统计学意义，差异有统计学意义的组再进行LSD法两两比较，粘接界面的破坏频数用卡方法进行检验，以显著性（α值）作为判断标准。2. 结果
2.1 扫描电镜观察纤维桩结果
扫描电镜观察：不同的处理方法可导致纤维桩表面的相貌形态不同。图8～12，A组：纤维桩表面呈凹凸性，但表面几乎为树脂基质包绕，而纤维束暴露数量极少；B组：硅烷偶联剂处理后的纤维桩，表面粗糙度有所增加，暴露的纤维数目也增加，但与空白组比较，裸露的纤维束差别不明显；C组、D组、E组经过处理以后，可发现纤维桩表面形态发生了改变，表面的树脂基质发生了不同程度的溶解，纤维束的数目暴露明显增加，其中D组的纤维数目暴露最多，甚至在有些纤维之间形成了较深的间隙，E组暴露的纤维数目较C组略多。通过扫描电镜下观察，以上几种处理方法都没有使纤维束受到破坏。
2.2 力学测试结果
实验结果见表1，各试件纤维桩拉出时的粘接强度数值；5组纤维桩的粘接强度平均值经统计学分析见表2，显示过氧化氢溶液组>喷砂组>选择性酸蚀处理组>硅烷偶联剂处理组>空白组；各组样本中最大值与最小值进行比较，见表3，D组、E组内的样本最大值及最小值均比A组大，且是五组实验样本中最大的。
表 1 各试件粘接强度数值（MPa）Table 1. Bonding strength of each group （MPa）组别 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 A组 10.52 8.9 12.3 10.75 9.74 11.37 10.77 13.16 9.31 8.96 B组 12.58 13.42 9.46 10.37 10.26 8.94 12.31 11.68 10.47 9.36 C组 15.48 16.37 12.98 17.68 18.31 14.64 16.26 15.39 14.96 13.96 D组 19.84 22.67 19.79 18.39 22.05 20.38 17.69 19.47 22.48 17.72 E组 17.36 14.39 18.46 16.79 19.38 21.05 20.43 19.68 15.95 18.52 表 2 各试件粘接强度平均值[MPa，（$\bar x \pm s $ ）]Table 2. Average bond strength of each group [MPa，（$\bar x \pm s $ ）]组别 样本 数值 A组 10 10.58 ± 1.41 B组 10 10.89 ± 1.52 C组 10 15.60 ± 1.62 D组 10 20.04 ± 1.86 E组 10 18.20 ± 2.08 表 3 各试件粘接强度最大值与最小值（MPa）Table 3. Maximum and minimum values of bonding strength of each group （MPa）组别 样本 最大值 最小值 A组 10 13.16 8.9 B组 10 13.42 8.94 C组 10 18.31 12.98 D组 10 22.67 17.69 E组 10 21.05 14.39 2.3 粘接界面破坏模式结果
各试件粘接界面破坏模式结果见表4、图13，结果显示：多为粘接剂界面与纤维桩界面粘接界面破坏，50个试件中占了33个，占66%。经卡方检验结果示见表5，卡方值为25.938，α = 0.001 < 0.05，结果表明，不同的处理方法在粘接破坏界面上有差异显著性，其中过氧化氢溶液组和喷砂组以Ⅲ型破坏占主导地位，分别占60%和50%，对照组、硅烷偶联剂组和选择性酸蚀处理组是Ⅰ型破坏占主导地位，分别占100%、100%、70%。
表 4 试件粘接界面破坏模式Table 4. Damage modes of bonding interface of specimens组别 A组 B组 C组 D组 E组 Ⅰ 10 10 7 2 3 Ⅱ 0 0 0 2 2 Ⅲ 0 0 3 6 5 表 5 试件粘接界面破坏模式卡方检验Table 5. Chi-square test of damage mode of bonding interface of specimens方法 值 自由度 渐进显著性 皮尔逊卡方 25.938a 8 0.001 似然比（L） 32.595 8 0 线性关联 17.904 1 0 
图 13 试件粘接界面破坏模式柱状图注：I型：粘接剂与纤维桩分离，纤维桩表面无粘接剂覆盖；Ⅱ型：粘接剂与根管壁分离，纤维桩表面为粘接剂覆盖；Ⅲ型：混合型粘接破坏，纤维桩表面部分有粘接剂覆盖，部分无粘接剂覆盖。Figure 13. Histogram of damage modes of adhesive interface of group3. 讨论
纤维桩是由无数的同一方向拉伸的纤维束而组成，这些纤维主要起到加强纤维桩的抗折性能，纤维周围由环氧树脂基质包绕，起到保护纤维束且赋予一定的弹性。环氧树脂基质是一种密度较高的惰性高分子化学材料，而临床中常用的粘接剂树脂水门汀中含有大量的甲基丙烯酸酯类成分，这两者之间不能形成有效的化学结合[4]。方法之一就是对纤维桩表面进行处理后，使得纤维桩与粘接剂的粘接界面得到有效的化学结合。目前研究中，常见的对纤维桩表面进行处理的方法有喷砂粗化处理，化学酸蚀处理，低温等离子系统处理，硅酸盐涂层系统，硅烷化处理[5-6]。本实验通过阅读大量文献，选择了4种比较容易可行且临床中易获取的纤维桩处理方法。在力学测试方法中，实验选择了微拉伸测试法。微拉伸粘接强度测试法（microtensile bond strength，MTBS）[7]具有较多的优点，可减少被粘体内聚破坏的发生概率。本实验研究重点是纤维桩粘接面与树脂水门汀粘接面的之间的关系，选用微拉伸粘接强度测试法可以降低粘接剂内聚破坏而发生的纤维桩脱落。通过实验结果之间的比较，得出原因分析如下：B组与A组之间无统计学差异，分析硅烷偶联剂是与纤维束内的氧化硅分子发生化学结合，以及与粘接剂中的氢氧根结合，来发挥其作用的，但纤维桩表面包绕的环氧树脂基质内不含硅酸盐分子，硅烷偶联剂与环氧树脂基质之间得不到有效的化学结合[8]，不作任何处理的纤维桩，只单纯涂布硅烷偶联剂来处理，纤维桩粘接强度得不到保障。C组比A组的粘结强度高，但不是很显著的提高，虽然电镜中观察纤维没有发生破碎或变细的现象。这与Camillo等[7-8]结果有些不同，Camillo等学者的实验内容为3%、10%、30%的氢氟酸处理纤维桩表面10 s，但是电镜下观察发现纤维束出现断裂现象。本实验结果分析C组粘接强度未得到明显提高，分析使用氢氟酸的浓度低所造成的原因。D组获得最高的粘接强度，且扫描电镜观察，过氧化氢溶液处理没有对纤维造成破坏。过氧化氢溶液处理后的纤维桩表面出现孔隙，粘接剂通过渗入到孔隙中，增加了粘接面积和微机械固位力，同时，树脂水门汀渗入间隙后相互嵌合，增加了树脂牙本质交互渗透区（resin dentin interdiffusion zone，RDIZ），产生了很大的摩擦力，加之涂布硅烷偶联剂后，使得玻璃纤维中的二氧化硅成分与复合树脂材料中的甲基丙烯酸树脂产生化学结合作用，因而纤维桩的粘接力得到了显著提高。E组喷砂组实验中，也出现2个试件纤维桩拉断的现象。Balbosh等做了以下研究，实验组为喷砂后的纤维桩进行粘接，对照组为空白对照，在力学测试下显示，实验组的粘接强度明显高于对照组。
A组、B组和C组之间大部分为粘接剂界面与纤维桩界面破坏，E组和D组以混合破坏占主导地位。结果表明，E组、D组破坏模式从纤维桩-粘结剂界面转移到了粘接剂-牙本质界面或二者混合。证明了经过过氧化氢溶液处理和喷砂处理的纤维桩，粘接强度确实得到了显著的提高，值得临床推广。
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图 1 CAD患者Treg细胞和Th17细胞的流式细胞仪检测结果
Figure 1. Results by flow cytometry detection of Treg cells and Th17 cells in CAD
图 2 健康对照组Treg细胞和Th17细胞的流式细胞仪检测结果
Figure 2. Results by flow cytometry detection of Treg cells and Th17 cells in healthy control group
图 3 Th17细胞、Treg细胞和Th17/Treg的比值与EASI 评分相关性分析
a：CAD患者Th17细胞与EASI 评分的散点图；b：CAD患者Treg细胞与EASI 评分的散点图；c：CAD患者Th17/Treg比值与EASI 评分的散点图。
Figure 3. Analysis of EASI score between the ratio of Th17 cells，Treg cells，and Th17/Treg
图 4 健康对照组皮肤组织的免疫组织化学
a：健康对照组 IL-17阴性表达（×100）；b：健康对照组IL-17阴性表达（×200）；c：健康对照组Foxp3阴性表达（×100） ；d：健康对照组Foxp3阴性表达（×200）。
Figure 4. Immunohistochemistry of skin tissue in healthy control group
图 5 CAD皮肤组织的免疫组织化学
e：CAD组 IL-17阳性表达（ ×200 ）；f：CAD组 IL-17阳性表达（ ×400 ）；g：CAD组 Foxp3阴性表达（ ×200 ）；h：CAD组 Foxp3阴性表达（ ×400 ）。
Figure 5. Immunohistochemistry of skin tissue in CAD
表 1 各组Th17细胞，Treg细胞比例及Th17/Treg比值（
$\bar x \pm s $ ）Table 1. Th17 cells，Treg cell ratio and Th17/Treg ratio in each group
分组 n Th17（%） Treg（%） Th17/Treg CAD患者 25 16.64 ± 6.12* 3.05 ± 1.29** 5.72 ± 1.68** 健康志愿者 20 11.49 ± 4.44 6.04 ± 1.41 2.01 ± 0.88 t 3.15 7.41 8.93 P 0.001 P < 0.01 P < 0.01 与健康对照组比较，*P < 0.05，**P < 0.01。 
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表 2 Foxp3在CAD病例组与健康对照组皮肤中表达差异（n）
Table 2. The difference of Foxp3 expression in skin （n）
分组 n 阳性 阴性 阳性率（%） χ2 P CAD病例组 25 3 22 12 0.373 > 0.05 健康对照组 10 2 8 20
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表 3 IL-17在CAD病例组与健康对照组皮肤中表达差异（n）
Table 3. The difference of IL-17 expression in skin （n）
分组 n 阳性 阴性 阳性率（%） χ2 P CAD病例组 25 22 3 88* 19.288 < 0.05 健康对照组 10 1 9 10 与健康对照组比较，*P < 0.05。
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