Association of Single Nucleotide Polymorphisms of Calcium Sensitive Receptor Gene with Calcium Nephrolithiasis and Hypercalciuria in Chinese Dai Population
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摘要:
目的 研究云南德宏州傣族人群CaSR基因多态性与含钙肾结石和高钙尿的相关性。 方法 云南德宏州的傣族含钙肾结石患者为实验组，云南德宏州的体检健康傣族人群为对照组，抽静脉血进行CaSR基因3个SNP位点rs7652589、rs1801725、rs1042636测定，结石组研究对象行24 h尿钙值测定，进行基因相关对比分析。 结果 rs7652589位点纯合AA型基因者与AA+GG基因者在含钙肾结石的发生对比分析，差异具有统计学意义（P < 0.05）。rs1042636位点的GG型基因者的24 h尿钙值与AA和AG基因型者对比，差异具有统计学意义（P < 0.05）。rs7652589位点GG型基因者24 h尿钙与AA和AG型基因者对比，差异具有统计学意义（P < 0.05）。 结论 云南德宏州傣族人群中CaSR基因上的rs7652589位点多态性与含钙肾结石和高钙尿的发生有关，rs1042636位点的GG型基因与傣族高钙尿发生相关，rs7652589位点GG型基因可能是该民族发生高钙尿和含钙肾结石的候选基因。 Abstract:Objective To study the association of CaSR gene polymorphism with calcium nephrolithiasis and hypercalciuria in Chinese Dai population. Methods The Dai patients with calcium containing renal calculi in Dehong Prefecture, Yunnan Province, China were selected as the experimental group, and the healthy Dai people in Dehong Prefecture, Yunnan Province were taken as the control group. The venous blood was drawn for the determination of the three SNP loci rs7652589, rs1801725, and rs1042636 of the CaSR gene. The subjects in the stone group were tested for 24-hour urine calcium value, and the gene correlation was analyzed. Results There was a statistical difference between the homozygous AA gene and AA+GG gene at rs7652589 locus in the occurrence of calcium nephrolithiasis （P < 0.05）. The 24 h urine calcium value of the GG genotype with rs1042636 locus was significantly different from that of the AA based and AG genotype （P < 0.05）. There was a significant difference in 24 h urine calcium between those with GG genotype at rs7652589 locus and those with AA and AG genotype （P < 0.05） Conclusion The rs7652589 polymorphism on the CaSR gene in the Dai population in China is related to the occurrence of calcium nephrolithiasis and hypercalciuria. The GG gene at rs1042636 is related to the occurrence of hypercalciuria in the Dai population. The GG gene at rs7652589 may be a candidate gene for the occurrence of hypercalciuria leading to calcium nephrolithiasis in this ethnic group. -
肾石症是一种高发病率、高复发率的全球性疾病。我国肾结石的发病率为5.8%左右，复发率高达50%左右，造成了严重的社会和经济负担[1]。而肾结石中含钙结石占到80%，其中以草酸钙结石、磷酸钙最为常见[2]。含肾结石的发病机制复杂且被认为是一种全身性代谢性疾病[3]。世界卫生组织（WHO）估计，超过90%的人类疾病是由基因引起的[4]。近年来的研究发现肾结石发生和多种因素相关，如种族、地域、环境、饮食、基因遗传、疾病等多因素导致了结石的易感性[5]。目前研究认为高钙尿是形成含钙肾结石最常见和最重要的代谢因素之一， 与含钙肾结石的发生密切相关，尿中钙盐的过饱和是含钙结石形成的确定因素之一[6]，高钙尿可由肠吸收增强、骨吸收增加或肾小管运输改变引起[7]。近年来的研究已经发现包括钙敏感受体 （calcium sensing receptor，CaSR） 和维生素 D 受体 （vitamin D receptor，VDR） 、密蛋白家族（claudin，CLDN），骨桥蛋白 （osteopontin，OPN）、降钙素受体（calcitonin receptor，CTR）等相关基因中的单核苷酸多态性 （single nucleotide polymorphism，SNP） 与含钙肾结石形成相关。但这些研究在不同国家、地域和民族研究结果并不完全一致[8-10]。因此认为，不同地域、不同种族肾结石的基因相关性不一定相同。国际国内的研究已经证实钙敏受体在甲状旁腺和肾脏组织中高表达，其功能的表达明显影响钙的代谢[11]。本研究采取了生活于中国云南省西南部的特有少数民族傣族作为研究对象。在云南德宏的傣族结石发病率较高，部分地方可见“结石村”。 而傣族也是缅甸北部、泰国、老挝的主体民族。CaSR基因3个SNP位点rs7652589、rs1801725、rs1042636国际国内都有研究显示与肾结石或高钙尿有关[12-13]。因此本研究选择该中国云南德宏傣族这3个具有一定代表性的位点进行分析。通过对该区域性民族的CaSR基因多态性与肾结石和高钙尿的关联研究，初步揭示该区域内傣族含钙肾结石遗传学特征。
1. 资料与方法
1.1 病例资料
选取2021年8月至2022年5月在云南省德宏州人民医院和德宏州芒市人民医院住院手术治疗的肾结石者213例。
2组患者性别、年龄、BMI、尿pH等计量资料符合正态分布，应用独立样本t检验，差异无统计学意义（P > 0.05），见表1。
表 1 研究对象一般信息对比分析Table 1. Comparative analysis of general information of research subjects项目 结石组 对照组 χ2/t P 性别 男 87（54.4） 55（63.2） 1.803 0.179 女 73（45.6） 32（36.8） 年龄（岁） 50.63 ± 14.08 51.93 ± 17.58 0.597 0.552 BMI（kg/m2） 24.38 ± 3.33 24.26 ± 3.93 −0.271 0.787 尿pH 5.8 ± 0.6 5.7 ± 0.5 1.3242 0.1867 1.2 实验样本
通过泌尿系CT、腹部平片和手术取石手术记录等资料作为患者诊断肾结石的依据。手术中获得的结石通过红外光谱法对结石成分进行分析，其中尿结石成分为草酸钙、磷酸钙或2者的混合结石的患者160例，进入实验组。同时选取在德宏州人民医院和德宏州芒市人民医院体检的当地傣族健康人群作为对照组87例，泌尿系CT、尿路平片、腹部B超等检查排外结石。2组研究对象均收集静脉血，结石组收集24 h尿液，化验24 h尿钙，2组患者均排除泌尿道感染、肾小管酸中毒、甲旁亢、骨质疏松症、糖尿病等全身代谢性疾病、肾功能不全或肾衰竭、排外慢性腹泻等胃肠道疾病、独肾、高尿酸血症、低镁血症、肿瘤疾病、排外服用氢氯噻嗪类利尿剂、性激素和糖皮质激素等药物。
1.3 实验方法
1.3.1 结石成分分析
SUN-3G 型智能结石分析仪采用红外光谱分析法分析患者术后的结石成分，结石成分为草酸钙、磷酸钙或两者的混合结石，其余类型结石排除。
1.3.2 血、尿标本收集
收集符合实验对象血液，静脉血3～5 mL，使用EDTA采血管，立即-80 ℃冰箱保存，后续进行基因监测。清晨新鲜尿测pH值，收集符合实验对象尿液从受检前1 d清晨8点开始留取24 h尿液，尿液中加入浓盐酸10 mL防腐和防止钙盐沉积，收集至第2天清晨8点，以测量24 h尿钙和尿磷。
1.3.3 提取和扩增DNA
引物序列相关信息，见表2。
表 2 引物设计Table 2. Primer design引物编号 引物序列 碱基数（bp） Tm值（℃） 扩增产物片段大小（bp） rs7652589-F ATGTGGAAGAAGAAGAGA 18 56 593 rs7652589-R ACGAGAAGAGATAAGTCA 18 56 593 rs1801725-rs1042636-F* CAGCAACGTCTCCCGCAA 18 60 599 rs1801725-rs1042636-R* TGCATTCTCCCTAGCCCAGT 20 60 599 *2个基因位点位置临近，1个引物可以涵盖2个位点。 Sanger测序：PCR产物切胶纯化，将样品点入事先准备好的1%的纯化胶中，电泳仪电压设定160 V接上接头正负极恒压电泳40～60 min，开始电泳后要观察纯化胶槽正负极有气泡冒出后，定时。将胶块放入凝胶成像仪器中采集图像。在长波365 nm紫外透射仪下，用手术刀切下目的条带，切取的胶块质量应小于3 g，将其放入对应的板孔号中。
纯化板配平4000 r/min离心1 min，加入500 μL Buffer GL，盖上封口膜，65 ℃水浴12～15 min。将96孔板卡入磁力架中，磁吸30 s，将磁力架和样品正反轻微颠倒3次，再次静置磁吸1 min，反复纯化。洗脱后2 μL样品+6 μL 0.5X溴酚蓝混合后点入0.8%的鉴定胶中，300 V电泳12 min。 对照纯化前后胶图，根据PCR定量标准在PCR记录表上标注每孔模板浓度并稀释至指定浓度。BDT反应操作，查看是否是目标程序（96 ℃ 4 min→96 ℃ 10 s→50 ℃ 5 s→60 ℃ 3 min→4 ℃
$ \infty $ ），升温是否正常。反应纯化后上测序仪，从测序仪上拷贝出数据，通过 Sequencing Analysis 5.2分析峰图数据。1.4 统计学处理
所有数据采用SPSS软件包进行分析，基因型、等位基因频率等采用直接计数法计算。各组间基因型及等位基因频率、纯合基因和纯合及杂合型等比较分析采用四格表χ2检验，计量资料以（均数±标准差）表示，各组间数据的比较采用t检验或方差分析。以P < 0.05为差异具有统计学意义。
2. 结果
2.1 电泳检测结果
将扩增好的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳（2 μL样品 + 6 μL溴酚蓝），300 V电压下12 min，获取鉴定胶图，通过胶图确定目的条带大小。观察结果：主带明亮，无杂带，PCR产物达到较好纯度。见图1、图2。
图 1 CaSR基因rs7652589的16个标本电泳图Figure 1. CaSR gene locus rs7652589 sixteen specimens electrophoretogram
图 2 CaSR基因rs1042636和rs1801725位点16个标本电泳结果Figure 2. CaSR gene locus rs1042636 and rs1801725 sixteen specimens electrophoretogram2.2 测序结果
CaSR基因rs1042636位点结果，见图3；rs1801725位点结果，见图4；rs7652589位点结果，见图5。
图 3 CaSR基因rs1042636位点各基因型测序峰图Figure 3. CaSR gene locus rs1042636 genotype sequencing peak map
图 4 CaSR基因rs1801725位点各基因型测序峰图Figure 4. CaSR gene locus rs11801725 genotype sequencing peak map
图 5 CaSR基因rs7652589位点各基因型测序峰图Figure 5. CaSR gene locus rs7652589 genotype sequencing peak map2.3 分析结果
2个实验组人群CaSR的3个SNP位点中，rs1042636、rs1801725、rs7652589符合哈迪-温伯格平衡定律（P > 0.05）。说明这3个位点在该人群中基因遗传平衡，3个位点的数据来自同一蒙德尔群体，见表3。
表 3 哈迪-温伯格平衡检验结果Table 3. Hardy-Weinberg testSNP位点 基因型 基因型频数 基因型频率 期望基因型频率 期望基因型频数 χ2 P rs1042636 AA 66 0.268 0.273 67.123 0.082 0.960 AG 125 0.508 0.499 122.754 GG 55 0.224 0.228 56.1123 rs1801725 GG 221 0.898 0.901 221.635 0.705 0.703 GT 25 0.102 0.096 23.730 TT 0 0.000 0.003 0.635 rs7652589 AA 109 0.441 0.444 109.556 0.025 0.987 AG 111 0.449 0.445 109.889 GG 27 0.109 0.112 27.556 2个实验组等位基因型、基因型和单倍型分析。等位基因型频数分析结果表明，3个CaSR位点2组间的分布差异均无统计学意义（P > 0.05）。CaSR基因上的rs7652589位点的基因型频数分布差异具有统计学意义（P < 0.05），见表4。
表 4 等位基因型频数分析Table 4. Allelic frequency analysis基因位点 等位碱基 结石组 对照组 χ2 P rs1042636 A 163 94 0.345 0.557 G 155 80 AA 39 27 1.531 0.465 AG 85 40 GG 35 20 rs1801725 G 302 165 0.005 0.946 T 16 9 GG 143 78 0.005 0.944 GT 16 9 TT 0 0 rs7652589 A 221 108 2.478 0.115 G 99 66 AA 79 30 6.004 0.0497* AG 63 48 GG 18 9 *P < 0.05。 Major allele纯合型与其他基因型频数比较分析结果表明，CaSR基因上的rs7652589的纯合基因型与其他基因型频数2组间的分布差异均具有统计学意义（P < 0.05）。Major allele纯合型及杂合型与其他基因型频数比较分析中可见患者TT基因型为零，见表5。
表 5 纯合型与其他基因型频数分析Table 5. Homozygous and other genotypes frequency analysis基因位点 基因型 结石组 对照组 χ2 P rs1042636 AA 39 27 1.761 0.415 AG+GG 120 60 AA+AG 124 67 0.013 0.861 GG 35 20 rs1801725 GG 143 78 0.551 0.759 GT+TT 16 9 GG+GT 159 87 N N TT 0 0 rs7652589 AA 79 30 5.069 0.024* AG+GG 81 57 AA+AG 142 78 0.047 0.828 GG 18 9 *P < 0.05。 2.4 连锁不平衡和单倍体分析
单体型分析对应基因位点及位置，见表6。
表 6 单体型分析对应基因位点及位置Table 6. Haploid analysis corresponding loci and positions对应基因 SNP位点 位点的位置（GRCh38，3：） CaSR rs1042636 122284922 rs1801725 122284910 rs7652589 122170241 连锁不平衡分析结果显示，rs1801725与rs7652589的D'=1 > 0.8 ，rs1801725、rs7652589、rs1042636的3个位点r2均 < 0.8，见表7、表8。3个位点4种单倍型分析，见表9。
表 7 SNP位点连锁不平衡分析结果（D'）Table 7. Analysis results of linkage disequilibrium at SNP loci （D'）SNP位点 rs7652589 rs1801725 rs1801725 0.082 - rs1042636 0.456 1 表 8 SNP位点连锁不平衡分析结果（r^2）Table 8. Analysis results of linkage disequilibrium at SNP loci （r^2）SNP位点 rs7652589 rs1801725 rs1801725 0.001 - rs1042636 0.096 0.049 表 9 2组CaSR基因SNP位点的单倍型分析结果[n（%）]Table 9. Haploid analysis results of two sets of CaSR gene SNP loci [n（%）]单体型 结石组（频率） 对照组（频率） χ2 P OR 95%CI AGA 114（35.8） 59（33.9） 0.075 0.785 0.776 0.126～4.775 AGG 39（12.2） 29（16.6） 0.013 0.908 1.115 0.175～7.112 GGA 98（30.8） 46（26.4） 0.142 0.706 0.704 0.114～4.359 GGG 51（16.0） 31（17.8） 0.010 0.922 0.912 0.144～5.764 2组实验者低高钙尿发病率的对比分析，差异有统计学意义（P < 0.05）。高钙尿的界定值为24 h尿钙排泄男性 > 300 mg/d，女性 > 250 mg/d，见表10。
表 10 2组实验对象高钙尿平均值、高钙尿发病率对比分析表[n（%）/$\bar x \pm s $ ]Table 10. Comparative analysis of average hypercalciuria and incidence rate of hypercalciuria between two groups [n（%）/$\bar x \pm s $ ]项目 结石组 对照组 χ2/t P 正常尿钙 97（39） 79（32） 25.061 < 0.001* 高钙尿 63（26） 8（3） 尿钙值（mg） 353 ± 52 196 ± 76 12.84 < 0.001* 草酸钙结石 131（82） - - - 磷酸钙结石 29（18） - - - *P < 0.05。 结石组的CaSR各基因型与24h尿钙含量的对比分析。160例结石患者中高钙尿患者为57例，占35.6%。rs1042636位点的GG型基因者的24 h尿钙值与AA、AG基因型者对比，差异有统计学意义（P < 0.05），rs7652589位点的GG型基因者的24 h尿钙值与AA型基因者对比，差异有统计学意义（P < 0.05），见表11。
表 11 结石组各基因型与24 h尿钙值对比分析（$\bar x \pm s $ ）Table 11. Comparative analysis of different genotypes and 24-hour urinary calcium levels in the stone group （$ \bar x \pm s$ ）基因位点 基因型 基因
例数24 h尿钙值
（mg/24 h）t P rs1042636 AA 39 294 ± 44 3.7927 0.0003* AG 85 311 ± 57 2.18 0.0312 GG 35 335 ± 49 rs1801725 GG 143 317 ± 72 0.6355 0.526 GT 16 305 ± 68 TT 0 0 rs7652589 AA 79 207 ± 48 11.5477 < 0.0001* AG 63 342 ± 61 0.7587 0.4503 GG 18 354 ± 52 *P < 0.05。 3. 讨论
尿石症是泌尿系统最常见的疾病之一[14]。肾结石的发病率有逐年增加的趋势，女性和儿童的发病率有所增加[15]，因此，肾结石的发生与复发机制越来越受到关注。含钙肾结石在肾结石中占80%，它的发生常合并一些代谢紊乱[16]，因此对含钙肾结石与高钙尿的相关基因研究显得格外重要。高钙尿是含钙肾结石患者最常见的代谢异常，在含钙肾结石患者中占30%～60%。在亚洲发病率最高的地区是南亚、东南亚和西亚，草酸钙是结石的主要成分，发病率和复发率呈上升趋势[17]。笔者前期的一些研究已经证实了中国白族、彝族肾结石与低枸橼酸尿和高钙尿中的遗传相关性[18-19]。傣族为中国西南边境的少数民族，人口130万，且为缅甸、泰国、老挝的主体民族之一，在南亚和东南亚广泛分布，他们居住的地方多经济欠发达，肾结石的发病率较高。在我国还没有针对这一区域这一民族的肾结石相关研究，国际上也只有泰国有少量关于泰国整体人群的结石与维生素25（OH）D的研究[20-21]。国际上的一些关于双胞胎、家庭和儿童相关肾结石方面的遗传研究已经证实了含肾结石的遗传相关性和易感性[22-24]。因此本研究选取了中国西南部这一特有的区域民族进行含钙肾结石和高钙尿相关的基因研究，傣族的饮食习惯和居住环境较类似，对中国该民族聚居的边境区域甚至东南亚部分地区少数民族的肾结石病因学研究有重要意义。
钙敏感受体主要在甲状旁腺和肾小管中高表达[25]。CaSR通过表达细胞感知血钙水平的变化来调节甲状旁腺激素（PTH）分泌和尿钙排泄从而维持血钙的正常水平[26-27]。在肾脏中，CaSR在近曲小管的顶膜、粗升支的基底外侧膜和远曲小管基底外侧膜上表达[28]。CaSR的激活可能通过抑制钙敏感性钾通道活性，降低肾小管钙的重吸收，而导致高钙尿症[29]。CaSR能结合多种配体，与多种G蛋白相互作用发挥其影响[30]。
一些国际上的研究提示CaSR基因调控区rs7652589和rs1501899位点的次要等位基因与患者的肾结石发生和易感性相关[12]。关于CaSR基因第7外显子的rs1801725、rs1042636和rs1801726基因位点多态性和肾结石的研究，也发现一些相关性，但结果并不一致[10, 31-32]。这也提示了在不同地域不同种族群体不同的CaSR多态性和含钙肾结石风险相关性存在显著差异。本研究选取了在CASR的羧基末端尾部的2个常见基因多态性， rs1801725， rs1042636和位于人类3号染色体启动子1的TATA盒上游13 kbp处的rs7652589[33]共3个具有代表性的多态性位点作为研究对象。国外有研究估计在无单基因肾结石患者中，估计肾结石的遗传率 > 45%，高钙尿的遗传率 > 50%[21，34]。高钙尿通常被认为是含钙肾结石最常见的代谢危险因素，肾结石和骨质疏松是其主要的2个表现[35-36]。本研究采用的高钙尿定义为：24 h尿钙排泄男性 > 300 mg/d（ > 7.45 mmol/d），女性 > 250 mg/d（ > 6.24 mmol/d）[37]。
本研究中的3个SNP位点rs7652589、rs1801725、rs1042636的群体基因型符合Hardy-Weinberg平衡（P > 0.05），说明该研究群体来源于同一个孟德尔群体 ，这是进一步讨论位点间是否有统计学差异的遗传学基础。3个位点等位基因频率分布比较分析均无统计学意义（P > 0.05），且G为次要等位基因，这一结果与国外国内一些研究并不一致[11，33]。意大利的相关研究显示rs7652589 （G > A）次要等位基因与意大利患者的肾结石相关，并可能增加原发性甲状旁腺功能亢进（PHPT）患者产生肾结石的易感性[11]。波兰相关研究提示rs7652589的A等位基因是波兰血液透析患者发生肾结石的危险等位基因[12]。这可能因样本量不足所导致或该民族在这3个位点等位基因频数分布特点，有待进一步研究证实。而在基因型频数分析中rs7652589位点的分布差异具有统计学意义（P < 0.05），这说明CaSR在该位点与云南傣族人群肾结石的发生具有密切关系。其中，笔者发现云南德宏傣族人群中rs1801725位点并没有一个TT型基因，这有可能是样本量不足所致，但也不排除该位点确是该民族一个显著特点。TT或GG型基因都有可能是该民族的结石保护基因或易感基因，这需要后期进一步扩大样本量研究及与其他民族对比分析。Major allele纯合型与其他基因型频数比较分析结果表明，CaSR基因上的rs7652589的纯合基因型与其他基因型频数2组间的分布差异均具有统计显著性（P < 0.05），而纯合及杂合与其他基因型对比中rs7652589位点的结果（P = 0.828）。综合判断认为，CaSR的rs7652589基因位点的AA纯合型基因与云南傣族人群结石发生具有统计学意义。
在CaSR的3个SNP位点位于2个染色体上，将SNP位点进行连锁不平衡和单倍体分析，分析结果显示CaSR的rs7652589、rs1801725、rs1042636位点在云南德宏傣族人群中并没有连锁不平衡，因此笔者认为研究的3个钙敏位点各等位基因相互没有明显影响或干扰。
结石组的CaSR各基因型与24 h尿钙含量的对比分析。160例结石患者中高钙尿患者为57例，占35.6%。rs1042636位点的GG型基因者的24 h尿钙值与AA基和AG因型者对比，差异具有统计学意义（P < 0.05），这与国际国内的一些前期研究结果相符[30]。rs7652589位点的GG型基因者的24 h尿钙值与AA型基因者对比，差异具有统计学意义（P < 0.05）。因此rs1042636、rs7652589位点的基因多态性与患者的高钙尿发生密切相关，笔者推断rs7652589位点的GG型基因与患者高钙尿和含钙肾结石有相关性，在中国傣族人群中高钙尿与含钙肾结石的发生可能有相关性。
然而，本研究仍存在一些局限性，样本量较小降低了数据对比差异和说服力，本研究缺乏同一民族不同国家人群的对比分析，和同一地区不同民族的对比分析。本研究虽然选择了同一地区同一少数民族这一群体进行研究，尽量降低了环境和饮食等因素的干扰，但结石病因复杂，钙敏受体影响疾病较多，对肾结石的发生有影响的钙敏受体较多，希望后续的研究能够加大样本量、扩大钙敏受体位点和尿液其他生化指标对比分析，甚至可以进行全基因组测序研究。从而找出傣族人群特征性的结石风险因素和基因风险。
综上所述，笔者推断在中国云南德宏傣族人群中CaSR基因上的rs7652589位点多态性与含钙肾结石和高钙尿的发生有关，rs7652589位点GG型基因可能是该民族发生高钙尿后导致含钙肾结石的候选基因。rs1042636位点的GG型基因与傣族高钙尿发生相关。rs1801725位点的TT基因零表达，是否是该民族一个特有特点有待进一步研究。
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图 1 CaSR基因rs7652589的16个标本电泳图
Figure 1. CaSR gene locus rs7652589 sixteen specimens electrophoretogram
图 2 CaSR基因rs1042636和rs1801725位点16个标本电泳结果
Figure 2. CaSR gene locus rs1042636 and rs1801725 sixteen specimens electrophoretogram
图 3 CaSR基因rs1042636位点各基因型测序峰图
Figure 3. CaSR gene locus rs1042636 genotype sequencing peak map
图 4 CaSR基因rs1801725位点各基因型测序峰图
Figure 4. CaSR gene locus rs11801725 genotype sequencing peak map
图 5 CaSR基因rs7652589位点各基因型测序峰图
Figure 5. CaSR gene locus rs7652589 genotype sequencing peak map
表 1 研究对象一般信息对比分析
Table 1. Comparative analysis of general information of research subjects
项目 结石组 对照组 χ2/t P 性别 男 87（54.4） 55（63.2） 1.803 0.179 女 73（45.6） 32（36.8） 年龄（岁） 50.63 ± 14.08 51.93 ± 17.58 0.597 0.552 BMI（kg/m2） 24.38 ± 3.33 24.26 ± 3.93 −0.271 0.787 尿pH 5.8 ± 0.6 5.7 ± 0.5 1.3242 0.1867 
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表 2 引物设计
Table 2. Primer design
引物编号 引物序列 碱基数（bp） Tm值（℃） 扩增产物片段大小（bp） rs7652589-F ATGTGGAAGAAGAAGAGA 18 56 593 rs7652589-R ACGAGAAGAGATAAGTCA 18 56 593 rs1801725-rs1042636-F* CAGCAACGTCTCCCGCAA 18 60 599 rs1801725-rs1042636-R* TGCATTCTCCCTAGCCCAGT 20 60 599 *2个基因位点位置临近，1个引物可以涵盖2个位点。
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表 3 哈迪-温伯格平衡检验结果
Table 3. Hardy-Weinberg test
SNP位点 基因型 基因型频数 基因型频率 期望基因型频率 期望基因型频数 χ2 P rs1042636 AA 66 0.268 0.273 67.123 0.082 0.960 AG 125 0.508 0.499 122.754 GG 55 0.224 0.228 56.1123 rs1801725 GG 221 0.898 0.901 221.635 0.705 0.703 GT 25 0.102 0.096 23.730 TT 0 0.000 0.003 0.635 rs7652589 AA 109 0.441 0.444 109.556 0.025 0.987 AG 111 0.449 0.445 109.889 GG 27 0.109 0.112 27.556
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表 4 等位基因型频数分析
Table 4. Allelic frequency analysis
基因位点 等位碱基 结石组 对照组 χ2 P rs1042636 A 163 94 0.345 0.557 G 155 80 AA 39 27 1.531 0.465 AG 85 40 GG 35 20 rs1801725 G 302 165 0.005 0.946 T 16 9 GG 143 78 0.005 0.944 GT 16 9 TT 0 0 rs7652589 A 221 108 2.478 0.115 G 99 66 AA 79 30 6.004 0.0497* AG 63 48 GG 18 9 *P < 0.05。
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表 5 纯合型与其他基因型频数分析
Table 5. Homozygous and other genotypes frequency analysis
基因位点 基因型 结石组 对照组 χ2 P rs1042636 AA 39 27 1.761 0.415 AG+GG 120 60 AA+AG 124 67 0.013 0.861 GG 35 20 rs1801725 GG 143 78 0.551 0.759 GT+TT 16 9 GG+GT 159 87 N N TT 0 0 rs7652589 AA 79 30 5.069 0.024* AG+GG 81 57 AA+AG 142 78 0.047 0.828 GG 18 9 *P < 0.05。
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表 6 单体型分析对应基因位点及位置
Table 6. Haploid analysis corresponding loci and positions
对应基因 SNP位点 位点的位置（GRCh38，3：） CaSR rs1042636 122284922 rs1801725 122284910 rs7652589 122170241
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表 7 SNP位点连锁不平衡分析结果（D'）
Table 7. Analysis results of linkage disequilibrium at SNP loci （D'）
SNP位点 rs7652589 rs1801725 rs1801725 0.082 - rs1042636 0.456 1
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表 8 SNP位点连锁不平衡分析结果（r^2）
Table 8. Analysis results of linkage disequilibrium at SNP loci （r^2）
SNP位点 rs7652589 rs1801725 rs1801725 0.001 - rs1042636 0.096 0.049
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表 9 2组CaSR基因SNP位点的单倍型分析结果[n（%）]
Table 9. Haploid analysis results of two sets of CaSR gene SNP loci [n（%）]
单体型 结石组（频率） 对照组（频率） χ2 P OR 95%CI AGA 114（35.8） 59（33.9） 0.075 0.785 0.776 0.126～4.775 AGG 39（12.2） 29（16.6） 0.013 0.908 1.115 0.175～7.112 GGA 98（30.8） 46（26.4） 0.142 0.706 0.704 0.114～4.359 GGG 51（16.0） 31（17.8） 0.010 0.922 0.912 0.144～5.764
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表 10 2组实验对象高钙尿平均值、高钙尿发病率对比分析表[n（%）/
$\bar x \pm s $ ]Table 10. Comparative analysis of average hypercalciuria and incidence rate of hypercalciuria between two groups [n（%）/
$\bar x \pm s $ ]项目 结石组 对照组 χ2/t P 正常尿钙 97（39） 79（32） 25.061 < 0.001* 高钙尿 63（26） 8（3） 尿钙值（mg） 353 ± 52 196 ± 76 12.84 < 0.001* 草酸钙结石 131（82） - - - 磷酸钙结石 29（18） - - - *P < 0.05。
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表 11 结石组各基因型与24 h尿钙值对比分析（
$\bar x \pm s $ ）Table 11. Comparative analysis of different genotypes and 24-hour urinary calcium levels in the stone group （
$ \bar x \pm s$ ）基因位点 基因型 基因
例数24 h尿钙值
（mg/24 h）t P rs1042636 AA 39 294 ± 44 3.7927 0.0003* AG 85 311 ± 57 2.18 0.0312 GG 35 335 ± 49 rs1801725 GG 143 317 ± 72 0.6355 0.526 GT 16 305 ± 68 TT 0 0 rs7652589 AA 79 207 ± 48 11.5477 < 0.0001* AG 63 342 ± 61 0.7587 0.4503 GG 18 354 ± 52 *P < 0.05。
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[1] Sorokin I,Mamoulakis C,Miyazawa K,et al. Epidemiology of stone disease across the world[J]. World J Urol,2017,35(9):1301-1320. doi: 10.1007/s00345-017-2008-6 [2] Khan A. Prevalence,pathophysiological mechanisms and factors affecting urolithiasis[J]. Int Urol Nephrol,2018,50(5):799-806. doi: 10.1007/s11255-018-1849-2 [3] Bishop K,Momah T,Ricks J. Nephrolithiasis[J]. Prim Care,2020,47(4):661-671. doi: 10.1016/j.pop.2020.08.005 [4] Vladimirovna F T,Faridovich K C,Igorevich R V,et al. Genetic factors of polygenic urolithiasis[J]. Urologia,2020,87(2):57-64. doi: 10.1177/0391560319898375 [5] Youssef R F,Martin J W,Sl K,et al. Rising occurrence of hypocitraturia and hyperoxaluria associated with increasing prevalence of stone disease in calcium kidney stone formers[J]. Scand J Urol,2020,54(5):426-430. doi: 10.1080/21681805.2020.1794955 [6] Negri A L,Delvalle E E,et al. Role of claudins in idiopathic hypercalciuria and renal lithiasis[J]. Int Urol Nephrol,2022,54(9):2197-2204. doi: 10.1007/s11255-022-03119-2 [7] Shin S,Ibeh C L,Awuah B E,et al. Hypercalciuria switches Ca(2+) signaling in proximal tubular cells,induces oxidative damage to promote calcium nephrolithiasis[J]. Genes Dis,2022,9(2):531-548. doi: 10.1016/j.gendis.2021.04.006 [8] Mohammadi A,Shabestari A N,Baghdadabad L Z,et al. Genetic polymorphisms and kidney stones around the globe: A systematic review and meta-analysis[J]. Front Genet,2022,13(4):908-913. [9] Halbritter J. Genetics of kidney stone disease-polygenic meets monogenic[J]. Nephrol Ther,2021,17S(2):S88-S94. [10] Litvinova M M,Khafizov K,Korchagin V I,et al. Association of CASR,CALCR,and ORAI1 genes polymorphisms with the calcium urolithiasis development in Russian population[J]. Front Genet,2021,12(10):621-629. [11] Vezzoli G,Macrina L,Magni G,et al. Calcium-sensing receptor: Evidence and hypothesis for its role in nephrolithiasis[J]. Urolithiasis,2019,47(1):23-33. doi: 10.1007/s00240-018-1096-0 [12] Li H,Zhang J,Long J,et al. Calcium-sensing receptor gene polymorphism (rs7652589) is associated with calcium nephrolithiasis in the population of Yi nationality in Southwestern China[J]. Ann Hum Genet,2018,82(5):265-271. doi: 10.1111/ahg.12249 [13] Ding Q,Fan B,Shi Y,et al. Calcium-sensing receptor genetic polymorphisms and risk of developing nephrolithiasis in a Chinese population[J]. Urol Int,2017,99(3):331-337. doi: 10.1159/000451006 [14] Veser J,Jahrreiss V,Seitz C. Innovations in urolithiasis management[J]. Curr Opin Urol,2021,31(2):130-134. doi: 10.1097/MOU.0000000000000850 [15] Mayans L. Nephrolithiasis[J]. Prim Care,2019,46(2):203-212. doi: 10.1016/j.pop.2019.02.001 [16] Alexander R T,Fuster D G,Dimke H,et al. Mechanisms underlying calcium nephrolithiasis[J]. Annual Review of Physiology,2022,84(1):559-583. doi: 10.1146/annurev-physiol-052521-121822 [17] Liu Y,Chen Y,Liao B,et al. Epidemiology of urolithiasis in Asia[J]. Asian J Urol,2018,5(4):205-214. doi: 10.1016/j.ajur.2018.08.007 [18] 李康健, 莫茵, 申吉泓, 等. 维生素D受体基因SNP位点rs7975232和rs731236与云南彝族人群特发性低枸橼酸尿症的关系[J] , 广东医学, 2016, 37（17）: 2580-2584. [19] Li K,Luo Y,Mo Y,et al. Association between vitamin D receptor gene polymorphisms and idiopathic hypocitraturia in a Chinese Bai population[J]. Urolithiasis,2019,47(3):235-242. doi: 10.1007/s00240-018-1069-3 [20] Sangkaew B,Nuinoon M,Jeenduang N. Association of vitamin D receptor gene polymorphisms with serum 25(OH)D levels and metabolic syndrome in Thai population[J]. Gene,2018,659(3):59-66. [21] Howles S A,Thakker R V. Genetics of kidney stone disease[J]. Nat Rev Urol,2020,17(7):407-421. doi: 10.1038/s41585-020-0332-x [22] Mandal A,Khandelwal P,Geetha T S,et al. Metabolic and genetic evaluation in children with nephrolithiasis[J]. Indian J Pediatr,2022,98(22):34-42. [23] Hemminki K,Hemminki O,Forsti A,et al. Familial risks between urolithiasis and cancer[J]. Sci Rep,2018,8(1):3083. doi: 10.1038/s41598-018-21410-0 [24] Goldfarb D S,Avery A R,Beara-lasic L,et al. A twin study of genetic influences on nephrolithiasis in women and men[J]. Kidney Int Rep,2019,4(4):535-540. doi: 10.1016/j.ekir.2018.11.017 [25] Tsuji T,Hiroyuki A,Uraki S,et al. Autosomal dominant hypocalcemia with atypical urine findings accompanied by novel CaSR gene mutation and VitD deficiency[J]. J Endocr Soc,2021,5(3):190-195. doi: 10.1210/jendso/bvaa190 [26] Hannan F M,Kallay E,Chang W,et al. The calcium-sensing receptor in physiology and in calcitropic and noncalcitropic diseases[J]. Nat Rev Endocrinol,2018,15(1):33-51. [27] Chavez-abiega S,Mos I,Centeno P P,et al. Sensing extracellular calcium - An insight into the structure and function of the calcium-sensing receptor (CaSR)[J]. Adv Exp Med Biol,2020,11(31):1031-1063. [28] Ewers M,Canaff L,Weh A E,et al. The three common polymorphisms p. A986S,p. R990G and p. Q1011E in the calcium sensing receptor (CASR) are not associated with chronic pancreatitis[J]. Pancreatology,2021,21(7):1299-1304. doi: 10.1016/j.pan.2021.08.008 [29] Guo S,Chi A W,Wang H,et al. Vitamin D receptor (VDR) contributes to the development of hypercalciuria by sensitizing VDR target genes to vitamin D in a genetic hypercalciuric stone-forming (GHS) rat model[J]. Genes Dis,2022,9(3):797-806. doi: 10.1016/j.gendis.2020.09.001 [30] Vahe C,Benomar K,Espiard S,et al. Diseases associated with calcium-sensing receptor[J]. Orphanet J Rare Dis,2017,12(1):19. doi: 10.1186/s13023-017-0570-z [31] Guha M,Bankura B,Ghosh S,et al. Polymorphisms in CaSR and CLDN14 genes associated with increased risk of kidney stone disease in patients from the eastern part of India[J]. PLoS One,2015,10(6):130-139. [32] Ali F T,El-azeem E M A,Hekal H F A,et al. Association of TRPV5,CASR,and CALCR genetic variants with kidney stone disease susceptibility in Egyptians through main effects and gene-gene interactions[J]. Urolithiasis,2022,50(6):701-710. doi: 10.1007/s00240-022-01360-z [33] Grzegorzewska A E,Paciorkowski M,Mostowska A,et al. Associations of the calcium-sensing receptor gene CASR rs7652589 SNP with nephrolithiasis and secondary hyperparathyroidism in haemodialysis patients[J]. Sci Rep,2016,6:351-388. [34] Taguchi K,Yasui T,Milliner D S,et al. Genetic risk factors for idiopathic urolithiasis: A systematic review of the literature and causal network analysis[J]. Eur Urol Focus,2017,3(1):72-81. doi: 10.1016/j.euf.2017.04.010 [35] Zhou H,Huang H,You Z,et al. Genetic polymorphism (rs6776158) in CaSR gene is associated with risk of nephrolithiasis in Chinese population[J]. Medicine (Baltimore),2018,97(45):130-137. [36] Gillion V,Devuyst O. Genetic variation in claudin-2,hypercalciuria,and kidney stones[J]. Kidney Int,2020,98(5):1076-1078. doi: 10.1016/j.kint.2020.05.055 [37] Ferre N,Parada E,Balaguer A,et al. Pharmacological interventions for preventing complications in patients with idiopathic hypercalciuria: A systematic review[J]. Nefrologia (Engl Ed),2021,92(5):1007-1016. -
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