Effects of Osteoking Combined with Antibiotic Cocktail on Insulin Resistance and Gut Flora in db/db Mice
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摘要:
目的 探究恒古骨伤愈合剂联合广谱抗生素暴露对db/db小鼠胰岛素抵抗和肠道菌群影响。 方法 以野生型小鼠作对照，db/db小鼠随机分为4组：模型组、抗生素组、恒古骨伤愈合剂组、复合干预组；给药11周后，检测体重、空腹血糖、血清胰岛素，计算胰岛素抵抗指数，16S rDNA分析动物肠内容物菌群。 结果 与对照组比较，db/db小鼠体重、空腹血糖、胰岛素抵抗指数升高（P < 0.05）。相对于db/db小鼠，抗生素（ABS）组、恒古骨伤愈合剂（OK）组和复合干预组（AO）血糖和岛素抵抗指数（HOMA-IR）降低（ P < 0.05）；ABS组肠道菌群的shannon、simpson和 pielou_e指数下降（ P < 0.05）；而OK组升高（ P < 0.05）；AO组仅shannon和 pielou_e升高（ P < 0.05）。在门水平上，OK组厚壁菌门（ P < 0.05）、ABX（ P < 0.01）和AO组（ P < 0.01）变形菌门的丰度升高，OK组（ P < 0.05）、AO组（ P < 0.01）和ABX（ P < 0.01）的拟杆菌门相对丰度降低；在科水平，OK组毛螺菌科（ P < 0.05）、ABX和AO组肠杆菌科、萨特菌科及AO组坦纳菌科的丰度均升高（ P < 0.01），而OK组Muribaculaceae丰度降低（ P < 0.05）。LEFse分析显示，ABX组的优势菌均为变形菌门。OK组毛螺菌科NK4A136组和乳杆菌属，脱硫杆菌科和普雷沃氏菌科富集。AO组古氏副拟杆菌，阿克曼菌属和 γ- 变形菌纲摩根菌科及 α- 变形菌纲富集。 结论 广谱抗生素、恒古骨伤愈合剂单独或联合使用均有降低db/db小鼠血糖和胰岛素抵抗的作用，恒古骨伤愈合剂可改善抗生素对db/db肠道微生态损害。 Abstract:Objective To investigate the effects of Osteoking combined with antibiotic cocktail on insulin resistance and gut microbiota in db/db mice. Methods The wild mice were used as the control group, while db/db mice were randomly divided into the model group, Osteoking group （OK）, antibiotic group （ABX）, and Osteoking combined with antibiotic cocktail group （OA）. After the intragastric administration for 11 weeks, the following indices were investigated: body weight, fasting blood-glucose （FBG）, serum insulin and the changes of intestinal microflora by 16S rDNA sequencing technology in mice. Results Compared with the model group, levels of FBG and HOMA- IR were significantly decreased in OK, ABX, AO groups （P < 0.05）. And the shannon、simpson and pielou_e index of gut microbiota were significantly decreased in ABX group （ P < 0.05）, while they were increased in OK group （ P < 0.05）. The shannon and pielou_e index were increased in AO group （ P < 0.05）. At the phylum level, the relative abundance （RA） of Firmicutes （ P < 0.05） in OK group, RA of Proteobacteria in ABX （ P < 0.01）and AO groups （ P < 0.01） were significantly increased; while RA of Bacteroidota was significantly decreased in OK （ P < 0.05）, ABX （ P < 0.01）, AO （ P < 0.01）groups. At the family level, RA of Lachnospiraceae （ P < 0.05） in OK group, Enterobacteriaceae, Sutterellaceae in ABX and AO groups （ P <0.01）and Tannerellaceae in AO groups （ P < 0.01） were significantly increased; while RA of Muribaculaceae in OK group was significantly decreased （ P < 0.05）. The following gut microbiota were riched: Proteobacteria in ABX group, Lachnospiraceae NK4A136 group, Lactobacillus, Desulfobacteraceae and Prevotellaceae in OK group, Parabacteroides gordonii, Akkermansia, Morganellaceae and Alphaproteobacteria in AO group. Conclusion Osteoking, antibiotic cocktail alone or in combination have the effects of improving the insulin resistance in db/db mice. And Osteoking can improve the intestinal microflora imbalance induced by antibiotic cocktail. -
Key words:
- Antibiotic cocktail /
- Osteoking /
- Insulin resist /
- db/db mice /
- Gut microbiota
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慢性心力衰竭（chronicheart failure，CHF）和房颤（atrial fibrillation，Af）是两种常见的心血管疾病，两者存在共同的危险因素，两者同时存在时会导致患者的死亡风险大大增加[1]。Af也是最常见的心律失常，会大大增加患者的死亡风险[2]。氮末端脑钠肽前体（N-terminal probrain natriuretic peptide，NT-proBNP）是临床上CHF最常用的预后评估指标[3-5]。肾功能损害也会影响CHF患者的预后；肾功能损害是CHF全因死亡的一个预测因子[6]。血清肌酐对于肾功能的评估有时不太准确，经常会低估一些患者的实际肾功能[7]。因此，临床上也常根据肾脏病膳食改良预测方程得到的估测肾小球滤过率（evaluate glomerular filtration rate，eGFR）来反映患者的肾功能情况[8]。对于eGFR和NT-proBNP在CHF预后预测方面已有较多的循证医学研究证据[9-11]。但对于使用eGFR和NT-proBNP来评估CHF合并Af患者预后方面的国内外研究并不多。本研究通过对CHF合并Af患者的随访，分析eGFR和NT-proBNP在评估CHF合并Af患者的近期预后是否有预测价值。
1. 资料与方法
1.1 研究对象
连续选择2018年1月至2019年12月在池州市人民医院心内科住院的CHF合并Af患者139例，其中男性57例，女性82例，年龄43～90岁，平均（73.68±9.21）岁。心功能根据纽约心脏病学会（New York Heart Association，NYHA）分级标准[12]进行划分。患者是否合并Af主要依据其病史、临床体征、心电图及动态心电图的结果。纳入标准：（1）CHF诊断符合《中国心力衰竭诊断和治疗指南2014》诊断标准[13]；（2）心功能分级为NYHA II级-IV级的患者；（3）Af诊断符合2016年欧洲《房颤管理指南》诊断标准[14]；（4）持续性或永久性Af。 排除标准：（1）患者住院期间死亡的；（2）患者失访、临床资料不全的；（3）患者中途退出研究的。入选患者的知情同意书均已签署，本研究获得该院伦理委员会批准。
1.2 血清肌酐、NT-proBNP的测定及估测肾小球滤过率（eGFR）的计算
分别采用全自动生化仪和电发光法检测血清肌酐和血清NT-proBNP水平。根据肾脏病膳食改良预测方程算出eGFR [8]：eGFR（mL/（min·1.73 m2）） = 血清肌酐（mg/dL）-1.234×年龄-0.179×175×（若为男性×1.0，若为女性×0.79）。血清肌酐单位换算为 1 mg/dL = 88.4 μmol/L。
1.3 资料的收集
收集患者的基线资料，如性别、年龄、心功能分级及基础心脏病情况。同时记录患者的血清肌酐、血清NT-proBNP及左室射血分数值，并计算eGFR值。
1.4 患者分组
根据ROC曲线确定的eGFR切点值，将CHF合并Af患者分为eGFR高水平组（eGFR≥85 mL/（min·1.73 m2））和eGFR低水平组（eGFR < 85 mL/（min·1.73 m2））。再根据ROC曲线确定的NT-proBNP切点值，将CHF合并Af患者分为NT-proBNP高水平组（NT-proBNP≥3 500 pg/mL）和NT-proBNP低水平组（NT-proBNP < 3 500 pg/mL）。
1.5 预后随访
对住院期间及出院后的患者均实施规范化治疗。随访患者出院后是否发生全因死亡。本研究随访时间至少12个月，随访期间全因死亡的则停止随访。随访方式采用住院、门急诊资料查阅和电话随访相结合。
1.6 统计学处理
统计学分析使用SPSS 20.0软件。计量资料以均数±标准差（
$ \bar x $ ±s）表示，计数资料以率或构成比表示。采用Logistic回归分析患者随访期间发生全因死亡的危险因素。应用ROC曲线评估eGFR、血清NT-proBNP在CHF合并Af患者预后中的价值。生存分析使用Kaplan-Meier法，检验用Log-rank法。以P < 0.05为差异具有统计学意义。2. 结果
2.1 CHF合并Af患者的基本临床特点
入选的CHF合并Af患者139例，患者的年龄、性别、心功能状况、基础心脏病情况及血清肌酐、Lg（NT-proBNP）、eGFR、左室射血分数结果，见表1。
表 1 入选患者的基本特征[$ \bar x \pm s $ /n（%）]Table 1. Basic characteristics of the selected patients [$ \bar x \pm s$ /n（%）]基本特征 具体值 年龄（岁） 73.68 ± 9.21 男性 57（41.01） 心功能分级 心功能II级 4（2.88） 心功能III级 27（19.42） 心功能IV级 108（77.70） 基础心脏病 冠心病 97（69.78） 心脏瓣膜病 20 （14.39） 心肌病 12 （8.63） 高血压性心脏病 5（3.60） 其他 5（3.60） 血清肌酐（μmol/L） 96.47 ± 38.39 Lg（NT-proBNP） 3.55 ± 0.47 eGFR[mL/（min·1.73m2）] 84.55 ± 31.63 左室射血分数 0.49 ± 0.13 注：Lg（NT-proBNP）为NT-proBNP的对数值。 2.2 CHF合并Af患者随访期间发生全因死亡情况
患者共随访370～1 086 d，中位随访时间549 d。随访期间发现全因死亡的患者65例，发生率为46.76%。
2.3 Logistic回归分析CHF合并Af患者随访期间发生全因死亡的危险因素
以年龄、性别、心功能分级、血清肌酐、NT-proBNP、eGFR和左室射血分数作为自变量，将CHF合并Af患者随访期间发生全因死亡作为因变量，多因素分析结果显示，NT-proBNP和eGFR是CHF合并Af患者随访期间发生全因死亡的危险因素（P < 0.05），见表2。
表 2 Logistic回归分析入选患者随访期间发生全因死亡的危险因素Table 2. Logistic regression analysis risk factors for all-cause death in selected patients during follow-up变量 B SE Wald P OR 95%CI 年龄 0.040 0.270 2.231 0.135 1.041 0.988～1.096 性别 −0.599 0.573 1.095 0.295 0.549 0.179～1.688 心功能分级 −0.026 0.485 0.003 0.958 0.975 0.376～2.524 血清肌酐 0.000 0.013 0.002 0.968 0.999 0.974～1.025 NT-proBNP 0.000 0.000 6.295 0.012 1.000 1.000～1.000 eGFR 0.070 0.029 6.017 0.014 1.073 1.014～1.135 左室射血分数 −0.014 0.017 0.708 0.400 0.986 0.954～1.019 2.4 eGFR在预测CHF合并Af患者不发生全因死亡的价值
作eGFR预测CHF合并Af患者不发生全因死亡的ROC曲线。eGFR预测CHF合并Af患者不发生全因死亡的曲线下面积为0.651（95% CI：0.562～0.740），最佳界值为84.81 mL/（min·1.73 m2），敏感度为57.70%，特异度为69.20%，见图1。
图 1 eGFR预测CHF合并Af患者不发生全因死亡的ROC曲线Figure 1. ROC curve of eGFR in predicting the absence of all-cause death in patients with CHF complicated with Af2.5 血清NT-proBNP在预测CHF合并Af患者发生全因死亡的价值
绘制ROC曲线反映血清NT-proBNP预测CHF合并Af患者发生全因死亡。结果显示曲线下面积为0.720（95%CI: 0.638～0.803），最佳界值为3 460 pg/mL，敏感度为69.20%，特异度为67.30%，见图2。
图 2 血清NT-proBNP预测CHF合并Af患者发生全因死亡的ROC曲线Figure 2. Serum NT-proBNP predicted the ROC curve of all-cause death in patients with CHF complicated with Af2.6 不同eGFR分组的CHF合并Af患者随访期间累积生存率情况的比较
Kaplan-Meier生存曲线显示，eGFR低水平组患者随访期间累积生存率明显低于eGFR高水平组，Log-rank的检验统计值为9.21，P = 0.002，见图3。
图 3 不同eGFR分组的CHF合并Af患者随访期间累积生存率情况的比较Figure 3. Comparison of follow-up cumulative survival rate in patients with CHF combined with Af in different eGFR groups2.7 不同NT-proBNP分组的CHF合并Af患者随访期间累积生存率情况的比较
Kaplan-Meier生存曲线显示，NT-proBNP高水平组患者随访期间累积生存率明显低于NT-proBNP低水平组，Log-rank的检验统计值为16.91，P < 0.001，见图4。
图 4 不同NT-proBNP分组的CHF合并Af患者随访期间累积生存率情况的比较Figure 4. Comparison of follow-up cumulative survival rate in patients with CHF combined with Af in different NT-proBNP groups3. 讨论
CHF和Af往往并存，二者相互影响，可彼此诱发，从而导致恶性循环的发生。Af是CHF患者常出现的心律失常，合并Af使CHF患者死亡的风险大大增加[15-17]。本研究纳入了139例CHF合并Af患者，随访期间共有65例患者死亡，发生率为46.76%。入选患者的随访死亡率高，除了与心功能Ⅲ及Ⅳ级患者多有关；特别是心功能Ⅳ级的患者比例达到77.7%。更重要的是考虑与CHF患者同时合并Af有关，Af进一步恶化了CHF患者心功能。CHF和Af常常同时存在，两者有许多共同的危险因素，既互相促进，也互为因果，导致恶性循环。当CHF和Af并存时，患者出现死亡风险的概率较单个疾病明显增加[18]。
临床上普遍应用NT-proBNP来预测CHF患者的预后[19]。NT-proBNP这项指标也存在不足之处，因而需寻找发现新指标与其联合应用，弥补其存在的局限性。Yilmaz等[20]的研究表明，eGFR可用于预测心力衰竭患者的死亡率，这可能是心力衰竭的预后与肾功能损害程度相关。eGFR作为一项新指标，可以联合NT-proBNP来一起评估心力衰竭预后[21]。本研究中ROC曲线显示：eGFR预测 CHF合并Af患者不发生全因死亡的曲线下面积为0.651（95% CI: 0.562～0.740），最佳切点值是84.81 mL/（min·1.73m2）。这表明eGFR值高于此水平患者发生全因死亡风险较低。本研究发现，eGFR低水平组患者随访期间累积生存率明显低于eGFR高水平组，提示低水平的eGFR预示着较高死亡率的发生。表明eGFR与CHF合并Af的预后密切相关，可以作为判断CHF合并Af预后的指标。eGFR联合使用NT-proBNP可明显提高CHF合并Af患者预后预测的准确性。
NT-proBNP在CHF预后评估的意义和价值是毫无疑问的，而此标志物与Af的关系也很密切[22-23]。Hijazi等[24]的研究显示NT-proBNP水平通常在Af中升高，并与卒中和死亡率的增加独立相关。本研究中，使用血清NT-proBNP预测CHF合并Af患者发生全因死亡的曲线下面积为0.720。本研究根据ROC曲线确定的NT-proBNP切点值，将患者分为NT-proBNP高水平组和NT-proBNP低水平组。患者分组时将NT-proBNP≥3500 pg/mL认定为NT-proBNP高水平组。NT-proBNP高水平组患者随访期间累积生存率明显低于NT-proBNP低水平组，Log-rank的检验统计值为16.91，P < 0.001。以往一直使用NT-proBNP评估CHF患者的预后，是其他指标难以代替的。对于CHF合并Af患者的预后评估，NT-proBNP同样有很高的应用价值。通过本研究发现，CHF合并Af患者血清NT-proBNP达到3500 pg/mL以后全因死亡风险高。
综上所述，eGFR和血清NT-proBNP对CHF合并Af患者发生全因死亡的预测有重要价值。eGFR和血清NT-proBNP可用于预测CHF合并Af患者的近期预后，有一定的临床应用价值。本研究只是一个近期的预后随访，至于eGFR和血清NT-proBNP对慢性心力衰竭合并房颤患者远期预后的评估作用尚未可知，仍需进一步深入研究。
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图 1 各组小鼠体重和胰岛素抵抗相关指标比较（n = 6）
A：体重；B：空腹血糖；C：胰岛素抵抗指数；D：胰岛素。与对照组比较，*P < 0.05；与模型组比较，#P < 0.05。
Figure 1. Comparison of the body weight and insulin resistance related indexes （n = 6）
图 2 菌群门、科水平丰度组成（n = 6）
A：菌群门水平丰度组成；B：菌群科水平丰度组成。
Figure 2. The gut microbiota at the phylum and family level in 5 groups （n = 6）
表 1 各组小鼠肠道菌群丰富度和均匀性指数（ $ \bar x \pm s $）
Table 1. Alpha-diversity index of gut microbiota in the 5 groups （ $ \bar x \pm s $）
组别 chao1指数 shannon指数 simpson指数 Pielou-e指数 样本覆盖度 对照组（wt） 557.81 ± 78.59 7.16 ± 0.47 0.98 ± 0.0044 0.79 ± 0.039 1.00 模型组（db/db） 363.52 ± 28.91* 5.87 ± 0.64* 0.92 ± 0.0087 *0.69 ± 0.047* 1.00 广谱抗生素组（ABX） 193.04 ± 32.41## 3.70 ± 0.14## 0.84 ± 0.0091 ##0.49 ± 0.018## 1.00 恒古骨伤愈合剂组（OK） 467.39 ± 51.07# 6.84 ± 0.82# 0.96 ± 0.041# 0.78 ± 0.080# 1.00 联合用药组（AO） 311.28 ± 33.87 4.50 ± 0.50# 0.91 ± 0.013 0.59 ± 0.032# 1.00 F 4.01 15.75 13.41 11.69 — P 0.0132 < 0.0001 < 0.0001 < 0.0001 — 与对照组比较，*P < 0.05；与模型组比较， #P < 0.05， ##P < 0.01。 
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