Correlation between DNA Detection Rate and Sweat Pore Density of Palm Touch Biological Samples
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摘要:
目的 研究男性手掌接触性生物检材的DNA（即接触性DNA）检出率与汗孔密度的关系，探索影响接触性DNA检出率的因素。 方法 使用加层捺印法采集73名男性大学生右手小鱼际掌印，对限定区域进行汗孔计数；采用手掌直接擦拭法和载玻片转印间接擦拭法转移35名受试者的手掌接触性生物检材，使用直接扩增法对检材进行PCR，并对STR结果进行分析；对2种转移方法的STR等位基因检出率与汗孔密度进行相关性分析。 结果 综合汗孔采集成功率为84.93%，汗孔密度为（531.41±97.69 ） 个/cm2，最小值为309 个/cm2，最大值为814 个/cm2；35名受试对象的手掌汗孔密度和直接擦拭法、间接擦拭法的STR等位基因检出率之间均不存在相关关系（P1 = 0.806，P2 = 0.701）。 结论 通过2种不同的实验方法对手掌接触性生物检材进行DNA检验，均表明手掌汗孔密度与接触性DNA的检出率无相关性，说明汗孔密度不是接触性DNA检出率的主要影响因素，或不是其唯一影响因素。 Abstract:Objective To study the relationship between the detection rate of touch DNA and sweat pore density in male palm touch biological samples, and explore the factors affecting the detection rate of touch DNA. Methods The right hand hypothenar palmprints of 73 male college students were collected by using the added layer fingerprinting method, and the sweat pore count was performed in specific site . Palm-touch biological samples of 35 individuals were collected by direct palm wiping method and indirect glass slide transfer wiping method. PCR was performed on the samples by direct amplification, and short tandem repeat （STR） results were analyzed. The correlation between STR allele detection rate and sweat pore density was analyzed. Results The success rate of comprehensive sweat pore collection was 84.93%, the density of the sweat pore was （531.41±97.69）/cm2, the minimum value was 309 /cm², and the maximum value was 814 /cm2. There was no correlation between the palm sweat pore density and the STR allele detection rates using direct and indirect wiping methods （P1 = 0.806, P2 = 0.701）. Conclusion Two different experimental methods were used to test the DNA of the palm touch biological samples, both of which showed that there was no correlation between the sweat pore density and the detection rate of touch DNA, indicating that the sweat pore density was not the main or only influencing factor of the detection rate of touch DNA. -
Key words:
- Sweat pore density /
- Touch DNA /
- DNA detection rate /
- Correlation
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甲状腺激素在胎儿生长发育中发挥着重要作用，尤其是中枢神经系统。胎儿甲状腺功能异常可导致生长受限、心功能不全、羊水减少，甚至宫内死亡[1]。随着妊娠期甲状腺疾病的发病率逐年上升，产前诊断胎儿甲状腺功能异常越来越重要。运用二维超声在产前可发现严重的胎儿甲状腺肿大。然而对于轻度胎儿甲状腺肿大，如果没有可供比较的参考值，很容易被忽略。因此，为了对高危胎儿进行产前超声筛查，将胎儿甲状腺疾病的诊断和治疗从产后提前到产前，有必要建立胎儿甲状腺的正常参考范围。本研究利用经腹部二维超声测量胎儿不同孕周、双顶径的甲状腺大小，建立了胎儿甲状腺正常参考值，为早期发现胎儿甲状腺功能异常提供可靠依据。
1. 资料与方法
1.1 对象
选取2018年10月至2020年10月于云南省第一人民医院产科门诊就诊的740名20～38周健康孕妇为研究对象，年龄20～42岁，平均年龄为31岁。所有胎儿出生72小时后均采足跟血做新生儿筛查，随访并记录其促甲状腺激素TSH检测结果。
纳入标准[2]：（2）单胎妊娠；（2）胎儿大小与孕龄一致，超声检查未发现明显发育异常，无创DNA低风险或染色体核型正常；（3）母体无甲状腺疾病，甲状腺激素水平正常，无慢性病或妊娠并发症；（4）母体无妊娠期射线、病毒、药物等接触史。排除标准为：（1）母体既往或目前甲状腺疾病病史；（2）母体合并慢性疾病或妊娠并发症；（3）末次月经不详；（4）多胎妊娠；（5）胎儿畸形。本研究经云南省第一人民医院伦理委员会审批通过。
1.2 仪器与方法
采用Voluson E10型超声诊断仪，腹部凸阵探头，频率2.0～5.0 MHz。
胎儿甲状腺超声检查：由一位经验丰富的专家进行超声测量。常规测量胎儿生长指标，重点对胎儿甲状腺进行扫查。观察甲状腺位置、包膜、回声（是否均匀、有无结节）、内部血流情况。当胎儿两侧颈总动脉同时显示，气管位于图像中央，获得胎儿甲状腺横切面 （图1A），用标准卡尺测量甲状腺横径 （图1B），使用自动椭圆轮廓计算甲状腺周长和面积 （图1C）。测量2～3次，取平均值。
图 1 孕23周胎儿甲状腺横切面A：椭圆形回声甲状腺位于两个低回声颈动脉之间，气管位于腺体中间，S表示脊柱，C表示颈动脉，T表示气管；B：胎儿甲状腺横径的测量；C：胎儿甲状腺周长和面积的测量。Figure 1. A transverse view of the fetal thyroid at 23 weeks’ gestation1.3 统计学处理
采用SPSS23.0统计学软件进行分析，基本描述采用5th、50th和95th百分位数表示，相关性分析采用Pearson相关分析，计算r值和P值，P < 0.01表示差异有统计学意义。
2. 结果
740例20～38周胎儿甲状腺横径、周长及面积第5th、50th、95th百分位数见表1，对胎儿甲状腺横径、周长及面积与孕周的Pearson相关性进行分析显示，三者随孕周的增大而增加，与孕龄具有高度相关性，相关系数r分别为0.909、0.904、0.913，具有统计学意义 （P < 0.01），见图2～图4。不同双顶径胎儿甲状腺横径、周长及面积第5th、50th、95th百分位数见表2，对胎儿甲状腺横径、周长及面积与双顶径的Pearson相关性进行分析显示，三者随双顶径增加而增大，与双顶径呈高度相关性，相关系数r分别为0.922、0.914、0.916，具有统计学意义 （P < 0.01），见图5～图7。740例胎儿出生后均做了新生儿筛查，促甲状腺激素TSH水平均为正常。
表 1 20～38周胎儿甲状腺横径、周长和面积的百分位数Table 1. Percentiles of fetal thyroid diameter，circumference and area during 20-38 weeks’ gestation孕周（周） n（740） 横径（cm）百分位数 周长（cm）百分位数 面积（cm2）百分位数 5th 50th 95th 5th 50th 95th 5th 50th 95th 20 32 0.87 1.02 1.24 2.65 3.01 3.58 0.55 0.68 1.02 21 32 0.94 1.12 1.27 2.74 3.12 3.76 0.58 0.74 1.11 22 76 1.01 1.15 1.33 2.92 3.23 3.92 0.64 0.80 1.20 23 71 1.06 1.22 1.38 3.01 3.43 4.05 0.68 0.89 1.29 24 58 1.12 1.32 1.49 3.28 3.58 4.16 0.72 1.04 1.39 25 30 1.18 1.38 1.57 3.39 3.78 4.27 0.88 1.12 1.43 26 31 1.22 1.43 1.60 3.48 3.96 4.46 0.92 1.18 1.52 27 36 1.27 1.47 1.67 3.60 4.13 4.65 0.98 1.24 1.60 28 30 1.30 1.52 1.72 3.71 4.25 4.79 1.04 1.31 1.67 29 34 1.33 1.57 1.76 3.82 4.36 4.92 1.09 1.39 1.74 30 30 1.37 1.60 1.81 3.95 4.47 5.01 1.12 1.47 1.82 31 31 1.42 1.65 1.88 4.18 4.59 5.16 1.20 1.55 1.90 32 54 1.48 1.69 1.92 4.27 4.76 5.29 1.27 1.62 1.97 33 31 1.51 1.72 1.96 4.36 4.87 5.45 1.35 1.70 2.04 34 30 1.55 1.79 2.02 4.42 5.04 5.62 1.41 1.77 2.13 35 32 1.58 1.87 2.12 4.50 5.13 5.73 1.48 1.86 2.24 36 34 1.67 1.94 2.19 4.57 5.22 5.88 1.54 1.97 2.40 37 32 1.70 2.01 2.33 4.63 5.30 6.02 1.62 2.07 2.52 38 36 1.74 2.06 2.42 4.72 5.45 6.18 1.68 2.12 2.56 
图 2 散点图表示740例胎儿甲状腺横径与孕龄的关系（r = 0.909）Figure 2. Individual scatter plot showing the relationship between the thyroid diameter and gestational age of 740 normal fetuses （r = 0.909）
图 3 散点图表示740例胎儿甲状腺周长与孕龄的关系（r = 0.904）Figure 3. Individual scatter plot showing the relationship between the thyroid circumference and gestational age of 740 normal fetuses （r = 0.904）
图 4 散点图表示740例胎儿甲状腺面积与孕龄的关系（r = 0.913）Figure 4. Individual scatter plot showing the relationship between the thyroid area and gestational age of 740 normal fetuses （r = 0.913）表 2 不同双顶径胎儿甲状腺横径、周长和面积的百分位数Table 2. Percentiles of fetal thyroid diameter, circumference and area according to biparietal diameter双顶径（cm） 横径（cm）百分位数 周长（cm）百分位数 面积（cm2）百分位数 5th 50th 95th 5th 50th 95th 5th 50th 95th 5.0 0.92 1.10 1.30 2.70 3.03 3.43 0.53 0.69 1.02 5.5 0.98 1.16 1.36 2.82 3.17 3.61 0.59 0.77 1.07 6.0 1.04 1.24 1.45 2.95 3.39 3.79 0.65 0.88 1.14 6.5 1.15 1.34 1.52 3.21 3.60 4.04 0.76 1.03 1.31 7.0 1.24 1.40 1.60 3.34 3.85 4.32 0.87 1.18 1.46 7.5 1.30 1.48 1.69 3.59 4.09 4.60 1.01 1.32 1.64 8.0 1.38 1.57 1.74 3.88 4.31 4.86 1.10 1.47 1.79 8.5 1.47 1.65 1.85 4.08 4.58 5.08 1.19 1.55 1.92 9.0 1.52 1.72 1.94 4.28 4.77 5.28 1.28 1.64 2.07 9.5 1.59 1.80 2.01 4.44 4.98 5.47 1.37 1.86 2.30 10.0 1.64 1.89 2.18 4.58 5.24 5.76 1.46 1.95 2.47 
图 5 散点图表示740例胎儿甲状腺横径与双顶径的关系（r = 0.922）Figure 5. Individual scatter plot showing the relationship between the thyroid diameter and biparietal diameter of 740 normal fetuses （r = 0.922）
图 6 散点图表示740例胎儿甲状腺周长与双顶径的关系（r = 0.914）Figure 6. Individual scatter plot showing the relationship between the thyroid circumference and biparietal diameter of 740 normal fetuses （r = 0.914）
图 7 散点图表示740例胎儿甲状腺面积与双顶径的关系（r = 0.916）Figure 7. Individual scatter plot showing the relationship between the thyroid area and biparietal diameter of 740 normal fetuses （r = 0.916）3. 讨论
孕妇甲状腺功能减退、Graves病、接受抗甲状腺药物（antithyroid drugs，ATD）治疗、放射性碘治疗或甲状腺切除术都会影响胎儿甲状腺功能[3-4]。约0.1%～0.4%的妊娠合并甲状腺功能亢进，其中85%～95%为Graves病所致，甲状腺兴奋性抗体（TSAb）通过胎盘屏障可引起胎儿和新生儿甲状腺功能亢进[5-7]。妊娠合并甲减的发生率在0.2%～0.3%，合并亚临床甲减的发病率为2%～5%[8]，母体甲减可引起胎儿甲状腺肿和甲状腺功能减退。先天性甲减在新生儿中发生率是1/3000～4000[9]。一旦甲减发生，会对大脑发育造成不可逆的损伤。因此，在宫内早期诊断和治疗胎儿甲状腺功能亢进或减退是非常重要的。
胎儿甲状腺肿是甲状腺功能异常最早和最常见的敏感超声征象。在晚期病例中，胎儿甲状腺肿在超声下显示为病变肿块，食管、气管受压迫和颈部过度伸展，一般可以诊断出来；如何识别甲状腺仅有轻微肿大的胎儿是目前面临的挑战。最近出版处理指南[9-10]，对于孕前或孕期甲状腺功能异常的孕妇，特别是抗TSH受体抗体（TRAb）升高或接受ATD治疗的孕妇，建议定期超声监测胎儿甲状腺大小，以发现胎儿甲状腺功能异常的征象。一些研究[8, 11-14]报道了超声评估胎儿甲状腺疾病的价值，并通过增加母体ATD的剂量成功治疗胎儿甲状腺机能亢进，或者通过减少母体ATD的用量或羊膜内给予左旋甲状腺素治疗胎儿甲状腺功能减退。 Luton等[15]报道72名Graves孕妇中，超声发现41例胎儿为高危胎儿和11例为甲状腺肿（甲减7例，甲亢4例），利用超声评估胎儿甲状腺功能异常的敏感性为92％，特异性为100％，阳性预测值为100％和阴性预测值为98％，因此胎儿甲状腺肿是诊断胎儿甲状腺功能异常最有价值的体征。Bromley等[16]利用超声连续监测33例高危胎儿，6例诊断出甲状腺功能异常，其中2例因胎儿甲状腺明显肿大而确诊，4例胎儿甲状腺与正常参考值相比仅有轻微增大，如果没有正常参考范围做比较，很可能就漏诊了。
本研究对740例中晚孕期正常妊娠胎儿甲状腺进行了测量，计算出20～38周胎儿甲状腺横径、周长和面积的正常参考范围，发现甲状腺的横径、周长和面积随孕龄和双顶径增加而增大，与孕龄和双顶径均呈显著正相关 （P < 0.01）。本研究有利于初步判断高危胎儿甲状腺功能有无异常，是否行进一步产前诊断，及早发现胎儿甲状腺肿大并及时给予治疗，避免一些不可逆的损伤发生。如果超声测量胎儿甲状腺大小超过本研究95%百分位数，就可能提示胎儿甲状腺肿大，需要引起重视，进一步完善其他相关检查。
本研究不仅计算出了不同孕龄的胎儿甲状腺正常参考范围，还计算出了不同双顶径胎儿甲状腺正常参考范围，对于末次月经不详或者月经周期不规律孕妇非常实用，是一组非胎龄依赖性胎儿甲状腺正常参考范围，国内尚未有类似报道。关于胎儿甲状腺大小正常参考范围文献报道较少[17-21]，大多数研究选用1～2个参数描述甲状腺大小，本研究选用了3个参数，结果更具有可靠性。本结果与其他文献略有不同，可能与文献报道的研究人群的碘摄取量、样本量、胎儿甲状腺测量方法和数据统计方法不同有关。在既往报道中，有利用三维超声测量胎儿甲状腺体积[20-22]，但三维重建技术对机器性能和初始切面要求高、技术繁琐，不利于临床上快速筛查。本方法采用的是二维超声操作更简单、快速、容易掌握、可重复性强，有利于在临床应用推广。
本研究的局限性：早期甲状腺比较小，超声较难分辨，到孕20周后才显示较清晰。且甲状腺前上方为胎儿下颌，宫内空间狭小，扫查甲状腺时容易受到胎儿体位因素的影响；尤其在孕晚期时，宫内拥挤，胎儿常常呈俯卧位，甲状腺的显示率明显降低。
综上所述，对母体合并妊娠期甲状腺疾病的胎儿，超声检测胎儿甲状腺功能是一项无创、安全可靠的评估方式，具有临床应用价值。使用二维超声连续监测甲状腺大小评估胎儿甲状腺功能，能将胎儿甲状腺疾病的诊断和治疗从产后转移到产前，提早预防对孩子造成永久性智力损害。
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图 1 掌纹汗孔计数方案示意
A：4 mm×4 mm正方形汗孔计数框；B：掌纹捺印定位标志；C：被计数点所标记的汗孔。
Figure 1. Palmprint sweat pore counting scheme
图 2 汗孔采集显现的相关情况
A：汗孔采集合格； B：汗孔采集不合格； C：汗孔密度小的掌印；D：汗孔密度大的掌印。
Figure 2. Relevant situation on sweat pore collection and display
图 3 掌印汗孔密度频数分布图及其正态分布曲线
Figure 3. The frequency distribution diagram and normal distribution curve of palmprint sweat pore density
图 4 毛细管电泳DNA分型结果图谱
A：口腔拭子完整DNA分形；B：实验样本DNA分型。
Figure 4. Capillary electrophoresis DNA typing result chart
图 5 掌印汗孔密度与等位基因检出率的散点图
A：直接擦拭法散点图，对数据进行Spearman相关性分析；B：间接擦拭法散点图，对数据进行Pearson相关性分析。
Figure 5. Scatter plot of sweat pore density and allele detection rate in palmprint
表 1 2种手掌接触性生物检材转移方法的DNA检出结果
Table 1. DNA detection results of two transfer methods for palm touch biological samples
编号 直接擦拭法 间接擦拭法 等位基因检出数（个） 等位基因检出数（个） 检出率（%） 第1次 第2次 第3次 平均检出数 平均检出率（%） M1 25 29 22 25.33 63.33 20 50.00 M3 36 40 40 38.67 96.67 25 62.50 M4 21 32 40 31.00 77.50 26 65.00 M9 40 40 40 40.00 100.00 39 97.50 M10 23 34 38 31.67 79.17 27 67.50 M11 0 0 0 0.00 0.00 0 0.00 M12 40 39 34 37.67 94.17 31 77.50 M13 35 36 40 37.00 92.50 3 7.50 M15 30 29 12 23.67 59.17 17 42.50 M21 10 5 0 5.00 12.50 30 75.00 M22 25 33 27 28.33 70.83 32 80.00 M24 6 9 11 8.67 21.67 29 72.50 M25 37 36 32 35.00 87.50 40 100.00 M26 37 40 40 39.00 97.50 36 90.00 M28 0 0 0 0.00 0.00 11 27.50 M34 40 38 36 38.00 95.00 36 90.00 M35 10 7 5 7.33 18.33 17 42.50 M36 14 6 4 8.00 20.00 2 5.00 M39 38 40 39 39.00 97.50 40 100.00 M40 37 39 36 37.33 93.33 38 95.00 M41 40 40 40 40.00 100.00 19 47.50 M43 16 17 21 18.00 45.00 7 17.50 M49 40 40 40 40.00 100.00 1 2.50 M50 33 40 37 36.67 91.67 36 90.00 M51 40 30 40 36.67 91.67 40 100.00 M52 40 37 38 38.33 95.83 37 92.50 M55 28 25 17 23.33 58.33 14 35.00 M56 14 13 7 11.33 28.33 29 72.50 M58 2 3 0 1.67 4.17 40 100.00 M60 14 11 10 11.67 29.17 9 22.50 M61 0 0 0 0.00 0.00 27 67.50 M63 1 0 3 1.33 3.33 2 5.00 M67 40 40 39 39.67 99.17 33 82.50 M69 40 39 36 38.33 95.83 22 55.00 M70 40 40 40 40.00 100.00 20 50.00 注：等位基因检出数是按照试剂盒中20个常染色体基因座的40个等位基因作为完整分型参照。 
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表 2 2种手掌接触性生物检材转移方法的DNA检验结果与掌印汗孔密度统计比较
Table 2. Comparison of DNA test and palmprint sweat pore density between two trasferring methods of palm touch biological samples
等位基因检出数 直接擦拭法 间接擦拭法 σ ≤ 523 523 < σ σ ≤ 523 523 < σ 0 ≤ N < 20 5 7 6 6 20 ≤ N < 40 12 7 10 9 N = 40 1 3 2 2 秩和检验结果 P = 0.825 P = 0.941 注：表中N表示等位基因检出数，单位：个；表中σ表示汗孔密度，单位：个/cm2。
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