九十年代初期的研究表明，在动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）形成过程中，动脉内膜和外膜层聚集着肥大细胞（mast cells，MCs），首次提出MCs参与AS进程^[1]。

血管的微环境一旦发生变化，炎性细胞便会从血管外膜的滋养血管中渗出，参与疾病的变化^[2-3]。MCs激活时释放出来的趋化因子、细胞因子、组胺、白三烯等炎症因子^[4]使血管的通透性增加，导致单核巨噬细胞和淋巴细胞聚集到斑块处^[5]，释放出大量的中性蛋白酶，可以加速低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）进入到血管内膜局部并聚集^[6]，促进AS斑块形成。

在骨髓细胞向MCs分化及活化过程中白细胞介素3（interleukin-3，IL-3）和干细胞因子（stem cell factor，SCF）起到重要作用^[7-8]。本研究旨在通过提取乳兔骨髓细胞，利用IL-3、SCF、β-巯基乙醇联合作用诱导培养骨髓来源肥大细胞并鉴定其纯度与活性，为进一步研究肥大细胞与AS的关系提供依据。

1.   材料与方法

1.1   材料

IL-3、SCF（美国Peprotech公司）；FBS、DMEM、DMEM/F12、RPMI-1640（美国Gibco公司）；实验动物：2周龄乳兔，昆明医科大学实验动物学部，环境条件符合国家实验动物环境及设施标准要求，室内保持安静、清洁、干燥和通风。自由饮水。实验动物使用许可证号：SCXK（滇）2015-0002。

1.2   方法

1.2.1   兔骨髓细胞的获取

麻醉：（经2周龄乳兔耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠，1 mL/kg）→浸泡（75%C₂H₅OH，10 min）→剥离（后肢皮肤切开，逐层分离，剥离肌肉）→暴露股骨→取出→浸泡（75% C₂H₅OH的无菌培养皿中浸泡3～5 min）→股骨两端剪去→吹打骨髓（吸取DMEM高糖培养基后吹打骨髓，股骨变白）→获取细胞（1000 r/min，5 min。如果在获取的细胞中有较多红细胞，则应用红细胞裂解液进行处理）→培养体系（含84 mL DMEM高糖培养基、15 mL FBS、1 mL双抗）。

1.2.2   细胞的培养

接种到T25瓶中（含DMEM高糖培养基）→隔天换液→细胞铺满→消化细胞→新培养瓶→贴壁→改用F12诱导培养基（含84 mL DMEM/F12、15 mL FBS、1 mL双抗、10 ng/mL SCF、10 ng/mL IL-3及0、10×10^-5 mol/L的β-巯基乙醇）→放置37 ℃、5% CO₂ 饱和湿度环境→隔天换液→镜下观察细胞有变圆→更换为1640促成熟培养基（含84 mL RPMI 1640、15 mFBS、1 mL双抗、10 ng/mL SCF、10 ng/mL IL-3及0、10×10^-5 mol/L的β-巯基乙醇）→7 d换液→直至细胞诱导成熟。

1.2.3   肥大细胞功能学鉴定

诱导成熟的重悬细胞液→载玻片→干燥→甲苯胺蓝染色→95% C₂H₅OH脱色→清洗→镜下观察。

1.2.4   肥大细胞形态学鉴定

通过光镜下观察不同培养时间的细胞形态，直至诱导成熟。

消化细胞→洗2次（PBS）→细胞密度1×10 ⁷个/mL→每管100 μL→单染管各加入5.0 μL的 CD117-PE抗体及FcεR1α-FITC抗体→双染管加两种抗体→空白对照管（无抗体）→避光孵育30 min→每管加1 mL PBS→离心10 min（400 g）→去上清→上法洗涤1次→去上清→每管加100 μL PBS→检测。

2.   结果

2.1   光镜下观察肥大细胞生长形态

2 d后开始出现以形态为长梭形的贴壁细胞；7 d时：细胞基本将培养瓶铺满；2周时：细胞逐渐变形；4周时：细胞基本变为圆形，悬浮细胞变多；6周时：细胞基本变为类圆形，且形态均匀具有折光性（图1）。

图  1  肥大细胞变形过程（100×）

A：7 d时长梭形贴壁细胞；B：2周时细胞逐渐变形；C：4周时细胞逐渐变圆；D：6周时变为类圆形细胞。

Figure  1.  Changes in mast cells（100×）

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2.2   肥大细胞的甲苯胺蓝染色

培养6周细胞成熟后利用甲苯胺蓝染色：可以观察到细胞质为紫红色，细胞核为蓝色。异染颗粒的细胞加入β-巯基乙醇比不加入β-巯基乙醇的能得到更多（图2）。

图  2  甲苯胺蓝染色（100×）

A：β-巯基乙醇浓度0 mol/L；B：β-巯基乙醇浓度10×10^-5 mol/L。

Figure  2.  Toluene blue staining（100×）

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2.3   流式细胞术检测肥大细胞

培养6周收集细胞，利用流式细胞术检测细胞表面CD117及FcεR1α的表达情况，加入β-巯基乙醇双阳性细胞的比例达96.2%，大于不加入β-巯基乙醇的（图3），且与不加β-巯基乙醇相比有统计学意义（P < 0.05），见表1。

图  3  流式细胞仪检测细胞的双阳性率

A：β-巯基乙醇为0 mol/L；B：β-巯基乙醇为10×10^-5 mol/L。

Figure  3.  Double positive rate of cells detected by flow cytometry

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表  1  不同浓度β-巯基乙醇诱导后CD117+ FcεRIα+肥大细胞的比例

Table  1.  The proportion of CD117+ FcεRIα+ mast cells induced by different concentrations of β-mercaptoethanol

β-巯基乙醇 （mol/L）	实验次数	CD117+ FcεRIα+ 肥大细胞的比例（%）	P
0	5	48.97 ± 3.12	0.7069
10×10−5	5	95.64 ± 4.66#
与β-巯基乙醇浓度为0 mol/L比较，#P < 0.05。

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3.   讨论

在正常人的心脏、主动脉及脂肪组织中有少量的MCs存在，当人类发生疾病时MCs的数量就会增多，比如AS。近年来，研究表明MCs在AS的发生、发展及斑块稳定性中有着重要作用^[9]。

当下有研究认为MCs是利用其表面的趋化因子受体-3与AS斑块中表达的嗜酸细胞活化CC趋化因子亚族中趋化因子配体-11结合而向病变部位聚集^[10]。MCs起源于骨髓造血干细胞^[11]，促进MCs成熟的分子主要有SCF和神经生长因子（nerve growthfactor，NGF）^[17]，SCF可能在MCs向受累区域聚集发挥作用，而MCs侵入受累区域可能会进一步导致更多的炎性细胞浸润，促进AS斑块形成。

IL-3又被叫做肥大细胞生长因子，在MCs的生长、分化、迁移和效应中具有重要作用。活化T细胞、天然杀伤（NK）细胞和MCs都可产生IL-3，且对于SCF在MCs前体的发生、发展、扩增具有促进意义^[12-13]。SCF的配体CD117（c-kit）除在其表面外，各种造血祖细胞中均可存在。MCs发挥重要表面标志的是FcεRIα，但FcεRIα还表达于嗜酸性粒细胞等细胞表面，只有MCs同时表达CD117和FcεRIα^[14]。甲苯胺蓝染色是一种常用于识别及判断MCs功能状态的方法，同时也是MCs的特异性染色，可染细胞核为蓝色，胞质内为异染性紫红色颗粒，说明其具有吞噬功能^[15]。通过甲苯胺蓝染色和流式细胞仪检测结果对诱导获得的MCs的纯度进行鉴定，就目前来说，利用兔的骨髓间质干细胞来诱导培养MCs的报道是极少的。

本研究选用2周龄的乳兔来获取骨髓间质干细胞，因为当兔龄大于或者小于2周龄时，笔者发现细胞生长速度变得缓慢，可能是2周龄的骨髓间质干细胞的活性更好，更有利于细胞的培养。当IL-3浓度10 ng/mL、SCF浓度为10 ng/mL，加入β-巯基乙醇时：甲苯胺蓝染色及流式检测均较不加入β-巯基乙醇时可以获取更多、双阳性率更高的MSc，原因可能为β-巯基乙醇作为一种还原剂，在降低氧对细胞产生氧化损伤的同时促进干细胞生长。所以该培养体系是一种良好的体外诱导培养体系，其操作简单，且能获得更加成熟、更具有典型特征的MCs，为下一步对兔行进炎性损伤研究提供了优势。综上所述，本研究利用形态学、功能学2个方面对诱导的兔骨髓来源MCs进行鉴定，培养出的细胞不仅具有成熟MCs的生物学特性，还具有其功能，这便为后续的基础研究及临床研究奠定基础。