Mechanisms of Ginsenoside Rg1 in Protecting Cardiomyocytes by Sestrin2
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摘要:
目的 研究人参皂苷Rg1（G-Rg1）对抗心肌缺血再灌注损伤中Sestrin2的作用及相关机制。 方法 体外培养大鼠 H9c2 心肌细胞，按实验要求随机分5组，分别为对照组，缺氧复氧组，G-Rg1组，缺氧诱导因子 -1α（Hypoxia Inducible Factor-1，HIF-1，HIF-1α） 抑制剂组，Sestrin2 siRNA干扰组。流式细胞术检测各组心肌细胞内活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）含量。蛋白质免疫印迹法检测HIF-1α、Sestrin2、蛋白激酶R样内质网激酶（protein kinase R-like ER kinase，PERK）、活化转录因子6（the activating transcription factor 6，ATF-6）和跨膜蛋白激酶1（inositol requiring enzyme 1，IRE-1）蛋白表达。免疫荧光法检测Sestrin2、HIF-1α、IRE-1蛋白表达。 结果 与对照组相比，缺氧复氧组细胞内ROS水平、HIF-1α、Sestrin2、ATF-6、PERK、IRE-1蛋白表达水平明显升高（P < 0.05）；与缺氧复氧组相比，G-Rg1组细胞内ROS水平明显降低（P < 0.05），HIF-1α、Sestrin2、ATF-6、PERK、IRE-1蛋白表达水平明显升高（P < 0.05）；与G-Rg1组比较，HIF-1α抑制剂组心肌细胞内ROS水平升高，Sestrin2蛋白表达明显下调（P < 0.05）；与G-Rg1组比较，siRNA干扰组心肌细胞内ROS水平升高，IRE-1表达明显升高（P < 0.05）。 结论 G-Rg1通过上调Sestrin2表达，保护缺氧复氧心肌细胞，并维持内质网应激平衡稳态。 Abstract:Objective To explore the role and mechanisms of Sestrin2 in ameliorating hypoxia-reoxygenation injury of rat’s cardiomyocytes by ginsenoside-rg1 （G-Rg1）. Methods Rat H9c2 cardiomyocytes cultured in vitro were randomly divided into 5 groups according to the experimental requirements: control group, Hypoxia reoxygenation group, G-Rg1 group, hypoxia Inducible Factor-1 （HIF-1, HIF-1α） inhibitor group, and Sestrin2 siRNA interference group. Flow cytometry was used to detect the expression levels of ROS in cardiomyocytes. Western blot was used to detect the protein expression of HIF-1α, Sestrin2, ATF-6, PERK, IRE-1 in cardiomyocytes. Immunofluorescence was used to test the protein expression of Sestrin2, HIF-1α, IRE-1. Results Compared with control group, the level of ROS and protein expression of HIF-1α、Sestrin2、ATF-6、PERK、IRE-1 of hypoxiareoxygenation group were significantly increased （P < 0.05） . Compared with the hypoxiareoxygenation group , the ROS level in G-Rg1 group were significantly reduced and protein expression of HIF-1α、Sestrin2、ATF-6、PERK、IRE-1 in G-Rg1 group were significantly increased （P < 0.05） . Compared with G-Rg1 group, the level of ROS were significantly increased and the protein level of Sestrin2 were significantly reduced, in HIF-1α inhibition group （P < 0.05）. Compared with G-Rg1 group, the level of ROS were significantly increased and the protein level of IRE-1 were significantly upregulated in Sestrin2 siRNA group （P < 0.05）. Conclusions G-Rg1 protects rat cardiomyocytes and maintains endoplasmic reticulum homeostasis in vitro by upregulating expression of Sestrin2. -
Key words:
- Ginsenoside-rg1 /
- ATF-6 /
- PERK /
- IRE-1 /
- Sestrin2
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在心肌缺血后血运重建的过程会引起心肌损伤，这种现象被称为心肌缺血再灌注损伤（myocardial reperfusion injury，MRI）。研究认为氧化应激、钙超载、PH快速校正、炎症反应、线粒体膜通透性转运孔开放是心肌缺血再灌注损伤的主要发病机制。人参皂苷Rg1（ginsenoside-Rg1，G-Rg1）为四环三萜类衍生物，是人参、三七等人参属药材的主要活性成分之一。以往研究发现，G-Rg1可抑制钙敏感蛋白和钙调磷酸酶表达，减少细胞内Ca2+超载，缓解心肌细胞肥大及纤维化[1]。G-Rg1可以抑制心肌细胞凋亡，减少心肌梗死面积[2]。Sestrin2 作为Sestrins家族蛋白的一员，具有抗氧化应激的作用。研究发现，Sestrin2可通过激活AMPK通路，减轻心肌缺血损伤[3]。内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）与很多心血管疾病有关。轻度心肌损伤或心肌损伤早期，ERS可减轻心肌细胞病理应激。然而，过度的 ERS可导致心肌细胞凋亡[4]。ERS 与Sestrin2表达调节密切相关，ERS 诱导Sestrin2表达上调，而Sestrin2表达可缓解ERS应激相关性疾病[5]。同时有研究证明血液循环中的Sestrin2水平可在一定范围内表明心血管疾病严重程度或预后[6-8]。
但目前关于ERS和Sestrin2在G-Rg1保护MRI心肌中的作用，以及ERS和Sestrin2相互作用关系，鲜有报道。本研究拟通过模拟大鼠胚胎细胞株（H9C2）的缺血再灌注损伤模型，从分子、细胞层面研究ERS和Sestrin2在G-Rg1缓解MRI心肌细胞损伤中的作用，及其分子间相互作用关系。
1. 材料与方法
1.1 研究材料
1.1.1 主要仪器及试剂
Accuri C6 流式细胞仪（美国 BD 公司）；凝胶成像仪（Tanon）、垂直电泳槽（BIO-RAD）；湿式转膜槽，（BIO-RAD）；普通培养箱及三气培养箱（Theromo electron Corporation，美国）；正置荧光显微镜（奥林巴斯 BX53）；大鼠心肌细胞（H9c2细胞）购买于北纳生物 ；G-Rg1（sigma 68317）；活性氧检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；HIF-1α单抗（bioss bs-20399R）、ATF-6单抗（bioss bs-1634R）；PERK单抗（bioss bs-2469R）、IRE-1单抗（abcam ab37073）、Sestrin2单抗（abcam ab178518）、肌动蛋白单抗（中杉金桥）；HRP标记通用型二抗（goat来源，CST）;纯化荧光单抗（Affinuty purified Antibody Daylight 488 Labeled Goat anti-Rabbit IgG（H+L），购自KPL）；Sestrin2 siRNA转染试剂盒（锐博）;HIF-1α抑制剂（abcam ab141642）。
1.1.2 Sestrin2 siRNA转染H9C2细胞
按照转染试剂盒说明书筛选出最佳的siRNA-Sestrin2序列供后续转染使用。siRNA转染方法：以riboFECT™ CP作为转染试剂，转染浓度为50 nM。根据转染试剂盒说明书制备 riboFECT™ CP 混合液。按照分组将制备好的混合液加入6孔培养板中，酒精喷洒后放入培养箱。48 h 转染完成，可进行后续实验。
1.1.3 实验分组及处理
使用10%小牛血清DMEM/F12 高糖培养液培养 H9c2 细胞，以 1×109/L 接种于底面积 25 cm2 培养瓶中，将细胞置于37 ℃，5% CO2培养箱中，每隔2 d传代。当细胞密度达 80%～90% 时，随机分5组。对照组：将高糖培养液置换为无糖无血清培养基继续培养，不作任何处理；缺氧复氧组：无糖无血清培养基培养细胞2 h，除去溶解氧。再将H9C2细胞置于5% CO2和92% N2、3% O2的培养箱中，在37 ℃下诱导缺氧3 h，持续监测培养箱内氧含量（3% O2），以保持稳定的缺氧水平。最后更换成正常含血清的细胞培养液，在正常培养条件下复氧处理 4 h，构建缺氧复氧心肌细胞损伤模型；G-Rg1组：用无糖无血清培养基培养细胞2 h，除去溶解氧，而后加入10 μmol/L G-Rg1，最后将H9C2细胞进行缺氧复氧处理，处理方法同上；HIF-1α抑制剂组：用无糖无血清培养基培养细胞2 h，除去溶解氧，而后使用10 μmol/L HIF-1α抑制剂处理细胞 15 min，再加入10 μmol/L G-Rg1，然后进行缺氧复氧处理，处理方法同上；Sestrin siRNA组：将经过Sestrin siRNA转染细胞的高糖培养液置换为无糖无血清培养基，而后加入10 μmol/L G-Rg1 处理细胞，最后进行缺氧复氧处理。
1.1.4 活性氧ROS检测方法
吸掉培养板中原培养基，加入含有1∶1000稀释DCFH-DA的基础培养基；37 ℃培养箱孵育20 min，用无血清培养基洗涤细胞3次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。0.25%胰酶消化1～2 min左右，当发现细胞收缩成球状或呈流沙状时应立即加入0.5 mL新鲜的完全培养基终止消化；将细胞悬液移至新离心管中，1000 r/min离心3 min收集细胞。流式细胞仪检测细胞ROS水平。用ROS阳性细胞所占百分比表示各组心肌细胞中ROS水平。
1.1.5 蛋白质免疫印迹法
提取蛋白质并定量，进行 SDS-PAGE 电泳，而后使用PVDF膜进行湿转法转膜，完成后将膜置入5%牛血清白蛋白中，室温封闭1 h；TBST洗膜3次后加入1∶1000稀释的一抗，孵育 12 h ；除去一抗，TBST洗膜3次后加入1∶2000稀释的二抗，室温孵育2 h；除去二抗，TBST洗膜3次后进行化学发光、显影、定影。用凝胶成像仪扫描图像，以GAPDH 为内参，使用Image J 软件分析蛋白条带灰度值。
1.1.6 细胞免疫荧光染色
PBS浸洗培养板中已爬好细胞爬片3次；4%的多聚甲醛室温固定爬片30 min；PBS漂洗3次，每次5 min；0.2% Triton X-100室温通透20 min；PBS漂洗3次，每次5 min；用5%羊血清室温封闭 60 mins；除去封闭液，加合适浓度的第一抗体，4 ℃冰箱过夜；PBST漂洗4次，每次5 min；加入合适浓度的荧光标记二抗，避光、室温孵育2 h；PBST避光漂洗4次，每次5 min；除去多余水滴，每张细胞爬片上滴加50 μl含DAPI的抗淬灭封片剂，荧光显微镜下观察并采集图片。
1.2 统计学处理
实验所得数据均采用Prism 8.0软件进行统计分析。计量资料数据经正态检验均为正态分布（P > 0.05），用均数 ± 标准差（
$\bar x \pm s $ ） 表示，采用单因素方差分析多组间差异。P < 0.05 为差异有统计学意义。2. 结果
2.1 各组心肌细胞中ROS水平比较
流式细胞术分析显示：与对照组比较，缺氧复氧组细胞内ROS水平明显上调[（67.73±3.70）%，（89.19±1.44）%，P < 0.01]；与缺氧复氧组比较，G-Rg1组细胞内ROS水平明显降低[（89.19±1.44）%，（72.64±1.67）%，P < 0.01]；与G-Rg1组比较，HIF-1α抑制剂组、Sestrin2 siRNA干扰组心肌细胞内ROS水平上升[（72.64±1.67）%，（89.69±2.90）%，P < 0.01]、[（72.64±1.67）%，（87.75±3.29）%，P < 0.01]，见图1。
图 1 各组心肌细胞 ROS 水平用 ROS 阳性细胞所占百分比表示各组心肌细胞中 ROS 水平。**P < 0.01。Figure 1. The levels of ROS in cardiomyocytes2.2 各组心肌细胞HIF-1-α、Sestrin2蛋白表达及内质网跨膜蛋白：ATF-6、PERK、IRE-1表达的比较
Western blot检测结果显示，与对照组比较，缺氧复氧组细胞HIF-1α、Sestrin2、ATF-6、PERK、IRE-1蛋白表达均升高，P < 0.05；与缺氧复氧组比较，G-Rg1组细胞HIF-1α、Sestrin2、ATF-6、PERK、IRE-1蛋白表达均升高，P < 0.05；与G-Rg1组比较，HIF-1α抑制剂组细胞Sestrin2蛋白表达明显下调，P < 0.05，其余蛋白表达差异无统计学意义；与G-Rg1组比较，siRNA干扰组心肌细胞IRE-1表达明显上调，P < 0.05，其余蛋白表达差异无统计学意义，见图2。
图 2 各组心肌细胞 HIF-1α、Sestrin2 蛋白表达及内质网跨膜蛋白：ATF-6、PERK、IRE-1 表达*P < 0.05，**P < 0.01。Figure 2. The protein expression of HIF-1α，Sestrin2，ATF-6，PERK，IRE-1 in cardiomyocytes2.3 免疫荧光检测各组HIF-1-α、Sestrin2及内质网跨膜蛋白
ATF-6、PERK、IRE-1，检测结果与western blot检测结果具有一致性，见图3。
图 3 各组心肌细胞 HIF-1-α、Sestrin2、ATF-6、PERK、IRE-1 蛋白表达（×200）Figure 3. The protein expression of Sestrin2，HIF-1α，ATF-6，PERK，IRE-1 in cardiomyocytes （×200）3. 讨论
已有研究证明G-Rg1可抑制血管内皮细胞氧化应激、衰老；恢复MRI心肌细胞中 ATP 的产生，对心血管具有保护作用[9-10]。发生MRI时，细胞快速产生大量ROS，进而加重损伤。ROS是MRI损伤发生的关键因素[11]。
细胞受到外部刺激，如营养不足、缺氧、缺血、氧化应激、DNA损伤，导致错误折叠蛋白或未折叠蛋白在细胞内质网腔内堆积、钙超载、脂肪代谢异常，内质网平衡稳态遭到破坏，最终引起内质网应激。内质网应激信号转导是通过3种关键酶介导的：PERK、ATF-6和IRE1[4]。Joshua J Martindale等[12]发现，ATF-6对心肌细胞具有保护作用。ATF-6可诱导具有细胞保护性的内质网应激蛋白表达，如GRP78 和GRP94。ATF-6转基因小鼠心肌细胞，在缺血再灌注后具有更好的功能恢复性，同时细胞坏死和凋亡明显减少[12]。Yongxue Ruan等[13]发现，缺血早期，内质网被激活对心肌细胞具有保护作用，然而到了后期，内质网应激主要引起细胞凋亡。内质网应激发挥不同功能主要取决于ATF-6，PERK 和IRE-1蛋白活化的程度和内质网应激的性质。
研究发现哺乳动物Sestrins的亚型分别是Sestrin1、Sestrin2、Sestrin3。Sestrins可在缺氧、氧化应激、饥饿、DNA损伤等各种应激条件诱导下表达升高。目前对Sestrin2的研究最为广泛，Sestrin2可通过激活AMPK、抑制mTOR信号通路，诱导细胞自噬，进而减少细胞内ROS累积，调节细胞内稳态[5]。Yunxia Liu等[14]发现，Sestrin2可通过激活AMPK，减少ROS，抑制P38、ERK、JNK磷酸化，减少缺氧再灌注心脏梗死面积，改善心肌细胞收缩性，保护心肌细胞。Park HW等研究发现，ERS 与Sestrin2表达调节密切相关，ERS 诱导Sestrin2表达上调，而Sestrin2表达可缓解ERS应激相关性疾病。Sestrin2主要通过调节AMPK-mTORC1蛋白信号通路维持内质网应激平衡稳态[15]。Li-Xue Wang等[16]研究发现，Sestrin2通过抑制PERK-ATF4-CHOP信号通路，减少因内质网应激导致的树突状细胞凋亡。然而，Sestrin2作为反馈调剂因子，缓解内质网应激所致细胞损伤的具体机制，目前仍不清楚。ERS时活化的IRE-1具有内切核糖核酸酶的活性，对下游XBP1 mRNA进行剪接，产生活性转录因子XBP1s，上调内质网相关基因表达。长时间活化IRE-1，可通过活化TRAF2/ASK1/JNK信号通路，促进细胞凋亡[4]。
当细胞处于缺血缺氧状态时可表达多种基因，其中缺氧诱导因子1α（Hypoxia Inducible Factor-1，HIF-1）可作为重要的转录因子，调节靶基因的表达。HIF-1α可通过上调一氧化氮合成酶（iNOS）、血红素（HO-1）、环加氧酶2（COX-2）、抗氧化酶缓解心肌细胞缺氧复氧损伤[17]。Essler S等[18]研究证明HIF-1α可诱导活化Sestrin2。但是在癌细胞里则出现了不一样的调节关系，Sestrin2可以通过下调哺乳动物雷帕霉素复合物1（mTORC1）和缺氧诱导因子1-α（HIF-1α）靶标来强烈抑制致癌信号通路，亦可被缺氧诱导因子-1（HIF-1）转录激活，同时在一定条件下，Sestrin2降低T细胞和自然杀伤细胞的细胞毒性活性，这有助于肿瘤细胞免疫逃避[19-20]。
本研究通过大鼠胚胎细胞株（H9C2）的缺血再灌注损伤模型，从分子、细胞层面研究在G-Rg1缓解急性心肌MRI中HIF-1α、ERS和Sestrin2相互作用关系。本研究发现，与对照组相比，G-Rg1处理后，缺氧复氧心肌细胞内ROS含量明显降低，再次证明，G-Rg1对缺氧复氧心肌细胞具有保护作用。经G-Rg1处理的缺氧复氧心肌细胞，HIF-1α、Sestrin2表达上调。抑制HIF-1α或沉默Sestrin2基因，G-Rg1对ROS的抑制作用明显减少。因此笔者认为，HIF-1α和Sestrin2在G-Rg1保护MRI心肌细胞的相关机制中起关键作用，缓解心肌细胞所受缺氧复氧损伤。同时G-Rg1可促进缺氧复氧心肌细胞内质网应激，细胞内ATF-6、PERK、IRE-1表达升高。此外，笔者发现，沉默细胞Sestrin2基因，G-Rg1处理的缺氧复氧心肌细胞，IRE-1表达明显上调，PERK、ATF-6蛋白表达无明显变化，Sestrin2通过抑制IRE-1过度表达，维持内质网应激平衡稳态，减少由内质网应激引起的心肌细胞凋亡。抑制HIF-1α，G-Rg1对Sestrin2的促表达作用受到部分抑制。然而是否沉默Sestrin2基因，并不影响G-Rg1对HIF-1α的作用；抑制HIF-1α前后，G-Rg1对ATF-6、PERK、IRE-1蛋白表达无明显变化。由此我们认为，G-Rg1可通过HIF-1α上调Sestrin2表达，进而保护心肌细胞。而G-Rg1能否通过其它信号通路上调Sestrin2表达目前尚无相关研究证明。
本研究均为体外实验，只涉及一种心肌细胞系，研究具有一定局限性，后续将通过体内实验进一步丰富并完善实验证据。此外，ERS对HIF-1α和Sestrin2的作用及相关机制，仍需后续实验进行深入探究。
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图 1 各组心肌细胞 ROS 水平
用 ROS 阳性细胞所占百分比表示各组心肌细胞中 ROS 水平。**P < 0.01。
Figure 1. The levels of ROS in cardiomyocytes
图 2 各组心肌细胞 HIF-1α、Sestrin2 蛋白表达及内质网跨膜蛋白：ATF-6、PERK、IRE-1 表达
*P < 0.05，**P < 0.01。
Figure 2. The protein expression of HIF-1α，Sestrin2，ATF-6，PERK，IRE-1 in cardiomyocytes
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