An Economical Method for Cultivation and Identification of Mast Cell Derived from Suckling Rabbit Bone Marrow
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摘要:
目的 通过一种操作简单的体外诱导培养体系获得更加成熟、更具有典型特征的肥大细胞。 方法 将乳兔的骨髓吹出放入含DMEM高糖培养基中，隔天换液，待细胞铺满，改用F12诱导培养基，隔天换液，镜下观察有细胞变圆时，更换为1640促成熟培养基，隔7 d换液，直至细胞诱导成熟。利用甲苯胺蓝染色检测其功能，流式细胞仪检测表面CD117及FcεR1α表达结果。 结果 6周后甲苯胺蓝染色可观察到：加入β-巯基乙醇的可得到含较多异染颗粒的细胞。采用流式细胞术进行检测：加入β-巯基乙醇时：CD117+、FcεRIα+双阳性细胞的比例为 96.2%，与不加β-巯基乙醇相比有统计学意义（P < 0.05）。 结论 利用SCF、IL-3及β-巯基乙醇可以成功诱导出兔骨髓来源的肥大细胞，为下一步对兔进行炎性损伤研究提供了依据，使后续基础及临床研究成为可能。 Abstract:Objective To obtain more mature mast cells with more typical characteristics through a simple and well-operated in vitro induction culture system. Methods The bone marrow of suckling rabbits was blown out and put into high glucose medium containing DMEM, and the medium was changed every other day. When the cells were confluent, F12 induction medium was used, and the medium was changed every other day. When the cells became round under the microscope, 1640 maturation medium was replaced, and the medium was changed every 7 days until the cells were induced to mature. Toluidine blue staining was used to detect its function, and flow cytometry was used to detect the surface expression of CD117 and FcεR1α. Results After 6 weeks, toluidine blue staining showed that the cells containing more metachromatic particles could be obtained by adding β-mercaptoethanol. Flow cytometry showed that the proportion of CD117+ and FcεRIα+ double positive cells in the presence of β-mercapto ethanol was 96.2%, which was significantly higher than that in the absence of β-mercapto ethanol （P < 0.05）. Conclusion The use of SCF, IL-3 and β-mercaptoethanol can successfully induce mast cells derived from rabbit bone marrow, which provides foundation for the future research on inflammatory injury in rabbits, and makes subsequent basic and clinical research possible. -
Key words:
- Suckling rabbit /
- Bone marrow /
- Mast cells /
- Induction
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下肢深静脉血栓（deep vein thrombosis，DVT）是一种常见病，其并发症肺栓塞（pulmonary embolism，PE）和血栓后综合征对患者的生活质量和生命安全产生显著影响[1]。目前，对深静脉血栓的形成机制和诊治疗方案的研究是一个热点领域，因此建立动物模型成为了关键。血管内皮细胞损伤是引发血栓形成的重要触发因素[2-3]。因此，本研究寻找一种安全可行的方法，制备内皮损伤后的血管内血栓模型，通过超声及病理切片比较模型效果，旨在为深入研究内皮损伤和深静脉血栓提供可靠的实验模型，为更好地模拟DVT的发生过程，及深入研究DVT的机制和开发新的治疗方法提供基础。
1. 材料与方法
1.1 实验动物
选取雄性日本大耳白兔（45）只，体重2.5～3.2 kg。随机分为3组（A组、B组、C组），每组15只。自由饮水，基础饲料喂养。本研究经昆明医科大学动物实验伦理委员会批准 （ 伦理备案号:kmmu2020258A ）。
1.2 仪器
采用法国Supersonic Imagine公司（Supersonic Imagine，Aixen Provence，France）生产的Aixplorer型全数字化彩色多普勒超声波诊断仪，L4-15线阵探头，频率12-15 MHz，也可以对存储的图像进行回顾性测量。
1.3 实验方法
1.3.1 动物血栓模型制备
将3组兔称重编号，在新环境下适应性喂养1周后，行股静脉造模，麻醉、取仰卧及四肢外展位固定，分别游离动、静脉主干长约1.5 cm，分组制备：A组不做血管结扎处理，B组采取完全结扎兔股静脉近端，C组采取不全结扎兔股静脉近端（显露左股静脉后平行放置超滑缝线并一同结扎，打结后撤出超滑缝线）。此外，3组均结扎股静脉侧支并使用无齿血管夹反复钳夹静脉管壁。术后缝合创口，连续3 d后肢肌注青霉素40万U预防感染。
1.3.2 超声观察
纵行与横行扫查兔股静脉目标区域，观察血管内回声及血流情况并记录血管内径后（图1），启用SWE（shear wave elastography， SWE）模式，选取感兴趣区域，取样框面积1mm²，测量血栓的弹性模量值［包括最大值（Max）、最小值（Min）和平均值（Mean）］、弥散度（Sd），选择图像稳定且Sd<5Kpa者，取样3次后计算平均值。对以上所有数据及图片均作记录并保存。
图 1 造模后超声横行与纵行扫查兔股静脉，观察血管内回声及血流情况并记录血管内径A：横行；B：纵行。Figure 1. After modeling，perform transverse and longitudinal ultrasound scans of the rabbit femoral vein to observe the echo and blood flow within the blood vessels and record the vascular diameter1.3.3 病理观察
超声检查后处死动物，取病变血管，放入10%中性福尔马林溶液内固定，血栓组织石蜡切片包埋，HE染色，显微镜检。
1.4 统计学处理
所有数据用SPSS17.0进行统计分析，计量资料用（ $ {\bar x \pm s} $）表示，多组计量资料比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 实验动物股静脉造模处普通超声显示
血管内皮损伤早期（建模后1 d），A、B、C 3组血管内呈均匀一致低回声。血管内皮损伤中期（建模后3 d），C组血管内回声较前稍增强，管腔内径较前增宽（P < 0.05）。到晚期（建模后7 d），B组出现部分管腔闭塞萎缩，管腔均较前有所减小（ P < 0.05）；C组内血栓充填更明显，管腔内回声稍增强，管腔内径明显增宽（ P < 0.05）；CDFI显示：A组部分管腔内有点状或短线状血流通过，内径测值见 表1。
表 1 3组兔股静脉管腔内径比较[（ $\bar x \pm s$），mm]Table 1. Comparison of the intraluminal diameter of the femoral vein in three groups of rabbits [（ $\bar x \pm s$），mm]组别 n 术后1 d 术后3 d 术后7 d F P A组 15 1.547±0.106 1.553±0.106 1.620±0.086 2.475 0.096 B组 15 1.567±0.105 1.473±0.122 1.413±0.226* 3.483 0.040# C组 15 1.587±0.106 1.740±0.130* 1.980±0.204*△ 25.336 < 0.001# 与术后1 d比较，*P < 0.05；与术后3 d比较， △P < 0.05； #P < 0.05 2.2 实验动物股静脉造模处实时剪切波弹性成像显示
1 d、3 d及7 d兔股静脉造模处均有弹性显像，见图2。
图 2 造模后1 d、3 d及7 d 3组兔股静脉实时剪切波弹性成像观察Figure 2. Real-time shear wave elastography observation of the femoral vein in three groups of rabbits at 1 d，3 d，and 7 d after modeling随着造模时间延长，3组兔股静脉血栓模型杨氏模量均值呈增高趋势，且在造模后7 d显著增高，差异有统计学意义（P < 0.05）。同一时间内组间比较，C组于第3天及第7天血栓模型的杨氏模量较A、B 2组明显增高（ P < 0.05）。兔造模处股静脉血栓杨氏模量值比较结果，见 表2。
表 2 3组兔股静脉血栓模型杨氏模量值MEAN值比较（Kpa）Table 2. Comparison of mean values of Young’s modulus （MEAN） in the femoral vein thrombus model of three groups of rabbits （Kpa）组别 n 术后1 d 术后3 d 术后7 d F P A组 15 5.16±1.001 5.987±0.756 9.22±1.725*△ 45.546 < 0.001 ▲ B组 15 4.747±0.986 5.927±0.834 10.56±2.564*△ 51.566 < 0.001 ▲ C组 15 4.453±1.119 7.993±1.223*#+ 18.82±1.66*△#+ 458.322 < 0.001 ▲ F 1.760 22.549 98.855 P 0.185 < 0.001 * < 0.001 * 与术后1 d比较，*P < 0.05；与术后3 d组比较， △P < 0.05；同一时间内与A组比较， #P < 0.05；同一时间内与B组比较， +P < 0.05； ▲P < 0.05。 2.3 病理切片观察分析血栓成分
随着造模后时间的延长，3组实验组均出现不同程度的血管壁的损伤、内皮细胞脱落、炎细胞侵润，最终导致不同程度的血栓形成，并于造模第7天C组血管内出现一定程度的纤维蛋白机化血栓，见表3及图3。
表 3 建模后不同时期血管的病理学变化Table 3. Pathological changes in blood vessels at different time points after modeling组别 A组 B组 C组 1 d 血管壁少量内皮细胞脱落，炎细胞侵润；血管内血细胞淤滞 血管壁少量内皮细胞脱落，管壁水肿可见炎细胞侵润，血管内血细胞淤滞 血管壁部分内皮细胞脱落，
管壁水肿可见炎细胞侵润，血管内血细胞淤滞3 d 血管壁内肉芽组织增生，血管内血细胞淤滞 部分血管壁纤维素样坏死，血管周围炎细胞侵润，血管内血细胞淤 部分血管壁纤维素样坏死，血管周围炎细胞侵润，部分血管内红色血栓形成 7 d 血管壁纤维组织增长，部分血管内出现红色血栓 部分血管壁增厚，血管周围炎细胞侵润，血管内形成红色及白色血栓 血管壁增厚，血管内血栓形成，出现纤维蛋白机化血栓
图 3 C组兔造模1 d、3 d及7 d后股静脉血栓病理切片观察（HE100×）Figure 3. Pathological observation of femoral vein thrombosis in rabbits of group C at 1 d，3 d，and 7 d after modeling （HE100×）3. 讨论
Virchow[4]最早提出了深静脉血栓形成的3大因素：血流淤积、静脉内皮损伤和血液高凝状态。目前，深静脉血栓动物模型的制备方法主要包括阻断静脉血液回流以引发血液淤滞，通过注入促凝物质、异物或机械性损伤血管内皮细胞等辅助手段诱发血栓形成[5-6]。已报道的几种制备方法，包括结扎法、创伤性击打后固定下肢，以及放置球囊导管阻塞血管并局部使用凝血酶[7-10]。这些方法各有适用的研究领域，相较于结扎法，其余3种方法制备血栓时间较长、操作复杂、耗材较多，并且没有关于机化血栓的报道。本研究旨在比较不同结扎方式制备动物股静脉血栓的效果，以期找到一种简单而有效的方法来改进动物血栓模型的制备过程，为后续实验奠定良好的基础。
本研究使用超声联合实时剪切波弹性成像技术观察血栓形成过程，并通过病理切片进行验证，发现不全结扎法制备的静脉血栓模型更符合人体深静脉血栓的特点，具有较高的成功率和更准确的数据基础。动物深静脉血栓模型的制备常因侧支循环的建立，导致模型处血管的完全闭塞和管腔萎缩，因此难以获取充满性深静脉血栓；同时由于缺乏良好的观察方法，不能很好地观察血栓形成过程，最终导致血栓模型的成功制备率较低。超声联合实时剪切波弹性成像技术是一种非侵入性的影像学技术，可以表征血栓的硬度[11-12]。研究已证实SWE可用于评估下肢深静脉血栓的硬度及静脉血栓的临床分期，且其效果优于常规超声检查[13-15]。在本研究中，笔者利用这项技术实时、非侵入性观察血栓形成的过程，获取血栓的形态和血栓硬度的杨氏模量值，帮助笔者了解血栓的形成和演变过程，为后续实验提供了更准确的数据。同时，加入病理检查进行验证，结果表明使用单纯夹闭的方法形成的血栓主要是红色血栓，因此超声观察管腔内以低回声为主，管腔内可见少量血流信号，说明血栓易脱落。完全结扎法制造血栓模型超声及病理结果均证实管腔出现不同程度的闭塞和萎缩。联合不全结扎法同时应用了血流淤滞和静脉内皮损伤这2个导致血栓形成的关键因素，可以快速且大量地形成血栓。在制备模型后的第7天，超声检查发现C组血管内管腔内回声明显充填，SWE证实管腔内杨氏模量值明显升高，说明血栓出现机化后血栓硬度增高，通过病理证实该组血栓机化率明显增高。
笔者比较了单纯夹闭、联合完全结扎和联合不全结扎法制备血管内皮损伤后血栓模型的优缺点。发现单纯夹闭的方法虽然简单易行，使用止血夹反复夹闭股静脉，可通过损伤血管内皮，并短暂阻断了血流回流造成血流瘀滞，使该血管内处于高凝状态，从而引发血栓形成。但是，单纯夹闭的血栓形成效果不够理想，血栓往往不完整且容易脱落，这导致了观察效果较差。相比之下，完全结扎法能够较好地保持血栓的完整性。它通过将动物的股静脉完全结扎，阻断了血流，并促使血栓形成。这种方法的优点在于血栓形成相对完整，有利于观察和评估血栓的特征和性质。然而，完全结扎法也存在一些局限性。它可能导致血管闭塞和萎缩，影响血管的生理功能，甚至对动物的健康产生负面影响。与完全结扎法相比，不全结扎法则在模拟人体深静脉血栓方面更具优势。这种方法在不全结扎静脉血管壁时可造成一定的血管壁及内皮损伤，同时导致远端血流瘀滞，随着血管内的压力逐渐增高，血管壁承受的血液流体力学发生改变，引起血管壁的病理改变，并影响内皮细胞结构与功能。因此，通过不全结扎兔股静脉，可使血栓形成的速度更快。由于不全结扎法允许少量血流缓慢通过结扎段静脉，很好地模拟了人体静脉疾病的重度狭窄和血流缓慢的特点。因此，这种制模方式形成的静脉血栓模型更符合人体深静脉血栓的病理生理学特点。本研究还发现，使用这种方法进行建模的手术时间较短，血栓制成率高。有利于超声观察，为今后的实验打下了良好的基础。
综上所述，本研究通过对比3种制备动物股静脉血栓的方法，可以看到不同方法各有其优势和局限性。结扎法简单易行，但血栓形成不完整且易脱落，观察效果较差。完全结扎法能够较好地保持血栓的完整性，但容易导致血管闭塞和萎缩，影响观察结果。而夹闭法联合不全结扎法能够产生较为稳定的内皮损伤和血栓形成。这种方法的优势在于，通过结扎不完全闭塞血管，可以模拟出更接近真实情况下的内皮损伤。此外，该方法制备的血栓模型在血管内径和杨氏模量值上显示出明显的变化，进一步验证了其有效性。这一研究结果对于进一步研究深静脉血栓的发生机制、预防和治疗方法具有重要的指导意义。
然而，笔者也注意到本研究存在一些局限性。首先，本研究仅使用兔作为实验动物，而不涉及其他物种，因此不能确定这种方法在其他动物模型中的适用性。其次，本研究的样本量相对较小，可能存在样本量不足的局限性。为了提高研究结果的可靠性和推广性，未来的研究将考虑增加样本量，并进行更严谨的统计分析，以更准确地评估不同方法制备血栓模型的效果。此外，本研究的观察时间较短，只观察了造模后1 d、3 d和7 d的变化，没有对更长时间的变化进行观察。进一步的长期观察可能有助于更全面地评估血栓模型的稳定性和持久性。
总之，本研究的结果表明，夹闭法联合不全结扎法是制备内皮损伤后血栓模型的有效方法。然而，笔者需要进一步的研究来验证其在其他动物模型中的适用性，并扩大样本量、进行更长期的观察以评估其稳定性。
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图 1 肥大细胞变形过程（100×）
A：7 d时长梭形贴壁细胞；B：2周时细胞逐渐变形；C：4周时细胞逐渐变圆；D：6周时变为类圆形细胞。
Figure 1. Changes in mast cells（100×）
图 2 甲苯胺蓝染色（100×）
A：β-巯基乙醇浓度0 mol/L；B：β-巯基乙醇浓度10×10-5 mol/L。
Figure 2. Toluene blue staining（100×）
图 3 流式细胞仪检测细胞的双阳性率
A：β-巯基乙醇为0 mol/L；B：β-巯基乙醇为10×10-5 mol/L。
Figure 3. Double positive rate of cells detected by flow cytometry
表 1 不同浓度β-巯基乙醇诱导后CD117+ FcεRIα+肥大细胞的比例
Table 1. The proportion of CD117+ FcεRIα+ mast cells induced by different concentrations of β-mercaptoethanol
β-巯基乙醇
（mol/L）实验次数 CD117+ FcεRIα+
肥大细胞的比例（%）P 0 5 48.97 ± 3.12 0.7069 10×10−5 5 95.64 ± 4.66# 与β-巯基乙醇浓度为0 mol/L比较，#P < 0.05。 
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