Mechanism of Osteoking Improving Osteoarthritis based on Network Pharmacology and DDM Rats
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摘要:
目的 探讨恒古骨伤愈合剂（OK）治疗骨关节炎（OA）的潜在机制并利用DMM大鼠初步验证。 方法 使用TCMSP数据库收集OK潜在的靶点，运用 GeneCards数据库和OMIM筛选与OA相关的靶基因，利用Cytoscape3.8.2软件建立OK有效成分与OA靶基因间互作的调控网络。使用STRING数据库构建蛋白互作图，进行基因本体（GO）及京都基因与基因组百科全书（KEGG）分析。此外，采用内侧半月板不稳定术（DMM）构建OA大鼠，观察膝关节软骨病变，ELISA检测OK治疗后炎症以及氧化应激水平。 结果 网络药理学发现，血清白蛋白 （ALB），白介素6（IL-6）等80个OK治疗OA的核心基因，主要涉及免疫、炎症反应、氧化应激等生物学过程。动物实验发现，与模型组相比，OK组大鼠关节软骨表面结构趋于正常，软骨细胞脱落少；OK降低血清炎症因子IL-6（P < 0.01）、VEGF（P < 0.01）和氧化应激因子MDA（P < 0.05），改善ALB水平和SOD活性（P < 0.01）。 结论 OK可缓解OA软骨组织损伤，改善免疫，抑制炎症和氧化应激反应，初步验证了网络药理学的结果。 Abstract:Objective To explore the potential mechanism of Osteoking （OK） in the treatment of Osteoarthritis （OA） and preliminarily verify it with DMM rats. Methods TCMSP database was used to collect potential targets of OK, GeneCards database and OMIM were used to screen target genes related to OA, and Cytoscape 3.8.2 software was used to establish a regulatory network for interaction between OK Active ingredient and OA target genes. The STRING database was used to construct protein interaction maps and GO and KECG were analyzed. In addition, OA rats were constructed using medial meniscus instability surgery （DMM） to observe knee joint cartilage lesions, and ELISA was used to detect inflammation and oxidative stress levels after OK treatment. Results Network pharmacology results showed that 80 core genes were involved in OK therapy for OA, including serum albumin （ALB） and interleukin-6 （IL6）, mainly involving biological processes such as immunity, inflammatory response, oxidative stress, and metabolism. Animal experiments showed that compared with the model group, the surface structure of the articular cartilage in the OK group of rats tended to be normal, with less detachment of chondrocytes; OK reduced serum inflammatory factors IL-6 （P < 0.01）, VEGF （P < 0.01）, and oxidative stress factor MDA （P < 0.05）, improved ALB levels and SOD activity （P < 0.01）. Conclusion OK can alleviate OA cartilage tissue damage, enhance immunity, and inhibit inflammation and oxidative stress reactions, preliminarily verifying the results of network pharmacology. -
Key words:
- Network pharmacology /
- Osteoking /
- Osteoarthritis /
- DMM rats
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骨关节炎（osteoarthritis，OA ）是常见慢性退行性关节病，通常认为因软骨退变引起，表现为关节疼痛、肿胀、畸形以及功能障碍。据世界卫生组织的数据，60岁以上约9.6%的男性和18%的女性患有OA，25%的OA患者有残疾[1]，OA患者在病程初期多为对症治疗，以减轻疼痛，缓解症状，延缓病情的发展，目前无逆转或治愈药物。当病程发展严重时只能通过手术方式解决，严重损害患者健康，加重了家庭负担。
近年来，中医药治疗骨关节炎受到广泛关注，补肾活血方[2]和独活寄生汤[3-4]均可改善关节软骨损伤。滇产彝药恒古骨伤愈合剂（osteoking，OK）由红花、三七、黄芪、陈皮、人参、杜仲、鳖甲、钻地风、洋金花制成[5-6]，各组分相互融合，具有滋补肝肾、活血益气、止痛祛肿、接骨续筋和促骨功效，可改善肝肾亏虚、气滞血瘀证型膝关节炎患者关节功能、缓解疼痛与僵硬[5-6]，但其作用机制不甚明确。网络药理学多基因、多靶点、多通路的特点，与中医药的特色高度契合。因此，笔者首次基于网络药理学探究恒古骨伤愈合剂与骨关节炎的相互作用，并构建大鼠OA模型，观察OK对膝骨软骨的保护作用，为骨关节炎的临床治疗进一步夯实基础。
1. 材料与方法
1.1 OK有效成分及对应靶基因收集
使用中药系统药理学数据库与分析平台数据库[7]，以生物利用度≥30%、类药性≥0.18为条件，筛选OK有效成分，查找对应靶基因。
1.2 OA治疗靶基因的获取及韦恩图的制作
使用GeneCards和OMIM数据库，检索“osteoarthritis”靶基因。将OK有效成分对应靶点与OA治疗靶基因合并，制作出OA与OK靶点相交集的韦恩图。
1.3 中药调控网络可视化
建立药物-有效成分-靶基因-疾病的关系，利用Cytoscape3.8.2软件建立OK有效成分与OA靶基因之间相互作用的中药调控网络。
1.4 PPI网络构建
将OK具有治疗OA的潜在作用靶基因导入STRING数据库[8]，得到蛋白质互作网络，利用R语言获得蛋白链接数量排序图。
1.5 GO和KEGG富集分析
整理OK作用于OA靶点基因，GO富集分析用Bioconductor cluster-Profiler程序包，根据 P < 0.05升序排序。进行KEGG通路富集分析和包括生物学过程、细胞组分和分子功能的GO分析。
1.6 动物实验
1.6.1 实验动物分组、OA模型建立与给药
8周龄SPF级雄性SD大鼠，体重（200 ± 20）g，购自昆明医科大学实验动物学部，使用许可证号SYXK（滇）K2020-0006。18只大鼠适应性饲养1周，随机分为3组（n = 6只）：假手术（sham）组、模型组（destabilization of medial meniscus，DMM）组、OK治疗组。腹腔注射3% 戊巴比妥钠麻醉动物（40 mg/kg），sham组打开关节腔后正常缝合。其余大鼠行内侧半月板失稳术（DMM）建膝关节炎模型[9]。术后3 d内肌注青霉素（4万U/ d）。造模次日起灌胃给药（1次/ d），恒古骨伤愈合剂来自赛灵药业（批号Z20025103），OK组根据人-鼠等效剂量换算给药剂量为3.79 mL/kg，另外2组灌胃相同剂量的生理盐水，共8周。相关操作符合动物福利原则，试验方案通过昆明医科大学动物实验伦理委员会审查（KMMU 20221016）。
1.6.2 ELISA法检测ALB 、IL-6、VEGF、MDA和SOD
戊巴比妥钠麻醉下采集大鼠腹主动脉血，离心，取血清。按照试剂盒说明书操作，使用酶标仪，测450 nm 波长的吸光度（OD值），通过标准曲线计算含量或活性。
1.6.3 HE染色
取大鼠膝关节软骨，多聚甲醛固定、脱钙后，石蜡包埋，制成5 μm纵切面，伊红-苏木素染色，光镜下观察。
1.7 统计学处理
计量数据以均数±标准差（
$\bar x \pm s$ ）表示，SPSS23.0进行统计分析，各组间比较采用单因素方差（One-way ANOVA）分析，2组间比较采用Tukey’s multiple comparisons test方法。P < 0.05为差异有统计学意义。2. 结果
2.1 OA治疗的靶基因及调控网络可视化
从TCMSP数据库筛得恒古骨伤愈合剂有效成分133种、靶基因132个，骨关节炎相关靶基因3129个，两者共80个交集基因，见图1。OK-有效成分-靶基因-OA间互作中药调控网络图中，紫三角代表OK的活性成分，绿椭圆表示OA治疗靶基因，见图2。
图 2 “OK-有效成分-靶基因-OA”网络图Figure 2. Network diagram of "OK-Active Component-Target Gene-OA"2.2 PPI网络构建
蛋白质间互作图显示共80个蛋白节点、921条相互作关系，血清白蛋白 （albumin，ALB），白介素6 （interleukin- 6，IL6）、 钙粘蛋白相关蛋白（catenin beta 1，CTNNB1）等为核心靶点基因，见图3。其中OA炎症反应与ALB免疫活动相关，IL6可加速OA的发病进程。
2.3 GO和 KEGG富集分析
GO分析显示，OK有效成分作用于OA的靶点基因在生物学过程（biological process，BP）上主要富集于药物反应、氧化应激反应、细胞对氧化应激的反应等，提示OK干预OA的病程发生发展可能与氧化应激等相关的生物过程有关，见图4。KEGG分析发现，OK对OA的治疗可能涉及炎症反应相关的AGE-RAGE、TNF和P53通路等生物学过程，见图5。
2.4 恒古骨伤愈合剂改善DMM大鼠膝关节软骨损伤
HE染色可见Sham组大鼠膝关节软骨表面光滑，结构完整。模型组的软骨表面受损，大量软骨细胞脱落，提示模型成功。与模型组相比，OK组大鼠关节软骨表面结构趋正常，软骨细胞脱落较少，见图6。提示OK缓解关节软骨的损伤。
图 6 大鼠关节软骨 HE染色（10×）A：sham组；B：模型组；C：OK组；黑色箭头表示软骨关节损伤。Figure 6. HE staining of knee cartilage in rats （10×）2.5 恒古骨伤愈合剂改善DMM大鼠免疫与炎症因子
与sham组相比，DMM组血清ALB降低，白细胞介素-6、血管内皮生长因子增加，差异具有统计学意义（P < 0.01）；与DMM相比，OK组ALB升高，IL-6、VEGF降低，差异具有统计学意义（P < 0.01），见图7。提示OK 改善免疫功能，减轻关节炎大鼠的炎症反应。
图 7 3组大鼠血清免疫与炎症因子与sham组比较，**P < 0.01；与DMM组比较，##P < 0.01。Figure 7. Serum immunity and inflammatory factors in rats2.6 恒古骨伤愈合剂改善DMM大鼠氧化应激
与sham组相比，DMM组血清丙二醛MDA增加，超氧化物歧化酶SOD活性降低，差异具有统计学意义（P < 0.01）；与DMM相比，OK组MDA（P < 0.05）降低，而SOD活性增加，差异具有统计学意义（P < 0.01），见图8。提示OK 改善OA大鼠的氧化应激。
图 8 3组大鼠血清氧化应激因子与sham组比较，**P < 0.01；与DMM组比较，#P < 0.05、##P < 0.01。Figure 8. The oxidative stress factors in rats3. 讨论
骨关节炎是不可逆的关节软骨退行性病变，软骨损伤降解是该病的重要标志。由于我国社会老龄化不断加重，OA 患者逐年增加。骨关节炎发病机制复杂，临床中主要采取对症支持治疗和人工关节置换术等，仅能缓解症状，无法阻断其进展或彻底治愈，缺乏有效的预防和治愈措施。近年发现中医药辨证论治OA有较好疗效[10]。陈皮中提取的橙皮苷改善OA小鼠的软骨损伤，降低白介素1β、肿瘤坏死因子-α的表达[11]。杜仲皮的桃叶珊瑚甙，可保护大鼠软骨细胞遭受氧化应激的伤害[12-13]，抑制小鼠OA的发生发展[12-13]。LING等[14]发现恒古骨伤愈合剂（osteoking，OK）减缓小鼠OA的进展，减少软骨下骨硬化，改善步态障碍。然而，恒古骨伤愈合剂在OA中的确切机制尚未完全阐明。因此，深入研究分析恒古骨伤愈合剂治疗骨关节炎的作用机制，探索其潜在作用靶点，将为进一步的临床应用提供重要参考价值。
本研究首次采用网络药理学方法，构建恒古骨伤愈合剂-有效成分-靶基因-骨关节炎互作的中药调控网络。PPI网络提示血清白蛋白和白介素6是最重要靶点基因。GO富集分析发现OK有效成分干预OA的发生发展可能与氧化应激反应等生物过程有关。KEGG分析提示OK对OA的治疗可能涉及炎症反应相关通路AGE-RAGE、TNF和凋亡等。血清白蛋白具有多种生理功能，已知在免疫系统被激活时会降低[15-16]。骨关节炎需进行关节置换术的患者ALB水平减少[17]。有研究表明[18-19]，作为促炎因子的白介素6，在膝骨关节炎患者及大鼠血清和关节液中均升高，加速软骨损伤。此外，膝骨关节炎患者血清血管生成相关因子与炎性因子高于健康人群，二者正相关[20-21]。患者关节炎的严重程度与关节中血管生成因子VEGF基因的表达相关[22]。膝关节内注射VEGF蛋白会出现OA样关节病变，抑制VEGF可抑制关节内的血管生成促进软骨修复[23]。此外，氧化应激影响膝骨关节炎的发生和发展。膝关节炎患者中过量的氧自由基抑制软骨细胞增殖，软骨细胞老化、死亡从而加速软骨基质的降解[24]。MDA反映脂质过氧化产生的自由基水平。作为抗氧化酶，SOD可防止细胞裂解和凋亡。因此，笔者对大鼠行DMM术建立OA软骨损伤模型，观察恒古骨伤愈合剂干预8周对关节软骨病变、免疫、炎性和氧化应激因子的影响，结果显示OK改善DMM大鼠膝关节软骨的组织损伤，提高血清白蛋白的水平，显著降低IL-6、VEGF和丙二醛的含量，提高SOD的活性。表明OK可缓解OA软骨组织损伤，改善免疫功能，抑制炎症和氧化应激反应，初步验证了网络药理学的结果。下一步将完善关节组织学上相关因子免疫组化验证，并通过AGE-RAGE等通路的探究，进一步揭示恒古骨伤愈合剂在骨关节炎中的作用。
综上，本研究从网络药理学层面，系统分析恒古骨伤愈合剂治疗骨关节炎的潜在机制。并且发现OK改善DMM大鼠膝关节软骨损伤，改善免疫功能，抑制血清炎性因子和氧化应激，为OK治疗骨关节炎提供基础数据。
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图 2 “OK-有效成分-靶基因-OA”网络图
Figure 2. Network diagram of "OK-Active Component-Target Gene-OA"
图 6 大鼠关节软骨 HE染色（10×）
A：sham组；B：模型组；C：OK组；黑色箭头表示软骨关节损伤。
Figure 6. HE staining of knee cartilage in rats （10×）
图 7 3组大鼠血清免疫与炎症因子
与sham组比较，**P < 0.01；与DMM组比较，##P < 0.01。
Figure 7. Serum immunity and inflammatory factors in rats
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