Effects of Euonymine on Proliferation，Migration，and Cell Cycle of HUVECs and VSMCs
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摘要:
目的 探讨卫茅碱（Euonymine）对人脐静脉内皮细胞（HUVECs）及人血管平滑肌细胞（VSMCs）的影响，以明确其防治冠脉支架内再狭窄（in-stent restenosis，ISR）的可能机制。 方法 台盼蓝检测Euonymine对HUVECs成活率的影响；MTT法检测Euonymine对HUVECs及VSMCs增殖的影响；划痕法检测Euonymine对VSMCs迁移的影响。 结果 MTT结果显示，卫茅碱干预后, HUVECs和VSMCs的吸光度降低。另外，Euonymine分别作用HUVECs 24 h，VSMCs 48 h后，测的半数有效抑制浓度（IC50）分别为28.6 µg/mL和33.92 µg/mL。流式细胞结果显示，Euonymine（25 μg/mL）使HUVECs和VSMCs的细胞周期阻滞于G0/G1期，而Euonymine（100 µg/mL）使VSMCs有丝分裂被阻断于G0/G1期及G2/M期。 结论 Euonymine主要通过抑制VSMCs的增殖和迁移，影响细胞周期，对于抑制经皮冠状动脉介入治疗术（percutaneous coronary intervention，PCI）后新生内膜形成有潜在的临床应用价值。 Abstract:Objective To investigate the effects of Euonymine on isolated cultured human umbilical vein endothelial cells （HUVECs） and human vascular smooth muscle cells （VSMCs）, so as to elucidate the possible mechanism of Euonymine in prevention and treatment of ISR. Methods The effect of trypan blue assay on the viability of HUVECs. MTT assay was used to observe the effect of Euonymine on the proliferation of normal HUVECs and VSMCs. A wound healing assay was performed to detect the effect of Euonymine on the migration of VSMCs. Results The MTT results showed that the absorbance of HUVECs and VSMCs decreased after the Euonymine intervention. In addition, the IC50 of Euonymine on HUVECs after 24 hours and on VSMCs after 48 hours were 28.6 µg/mL and 33.92 µg/mL, respectively. Flow cytometry results showed that Euonymine （25 μg/mL） arrested the cell cycle of both HUVECs and VSMCs at the G0/G1 phase, while Euonymine （100 μg/mL） blocked the mitosis of VSMCs at both the G0/G1 and G2/M phases. Conclusion Euonymine affects the cell cycle mainly by inhibiting the proliferation and migration of VSMCs and has potential value of clinical applications in inhibiting neointima hyperplasia after percutaneous coronary intervention （PCI）. -
Key words:
- Euonymine /
- HUVECs /
- VSMCs /
- Anti-proliferative /
- Anti-migratory /
- Cell cycle
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盐酸氨溴索注射液是常见的呼吸系统疾病临床用药[1]，能有效祛痰、减少咳嗽，临床疗效好，无明显毒副作用。该品种应用人群广，是儿科甚至新生儿常用药物[2]，因临床使用时直接进入血液系统，药物临床使用安全风险较高，被视为高风险注射剂。盐酸氨溴索注射液的含量测定结果是其有效性和安全性的重要指标，代表药品质量的好坏，因此客观评价结果的可靠性显得尤为重要[3]。通常可对测量结果的质量用不确定度给出定量说明，而目前未见盐酸氨溴索注射液含量测定不确定度评定的报道，为此，有必要对其进行研究。
在药物分析领域，目前国内暂未发布评定指南。2018-2020年期间国家药典委先后发布了征求意见稿《不确定度评定在药品检验中的应用》，可见不确定度评定在药品检验领域具有重要性和必要性[3−4]。当前的文献报道中，药品测量不确定度的评定主要是采用GUM法[4]，未见TOP-DOWN法用于药品外标法含量测定的不确定度评定。GUM法评定是按照实际检验，分析各相关分量建立数学模型再评定，过程繁琐、复杂，要求细致，各分量不能重复也不能遗漏，评定质量取决于评定者对有贡献的影响量认识的程度。TOP-DOWN法是由美国人Horwitz提出的是自上而下或自顶向下的评定方法[5−6]，评定原理是：在确保测量过程的偏倚和精密度受控的前提下，将影响检验结果的各因素利用实验室间再现性数据和实验室内重复性数据归纳为偏倚不确定度和期间精密度两个分量，再合成不确定度[7]，该法较于GUM法，能全面反映实验室的质控状态和实验室间的偏倚。
为确保药物的安全性和有效性，本文采用TOP-DOWN法对盐酸氨溴索注射液的含量测定进行不确定评定，利用实验室长期积累的数据作为“期间精密度”分量和17家实验室间的实验数据作为“偏倚精密度”分量，建立TOP-DOWN法测量模型，该方法既包含了在GUM法中体现的各影响因素如称量、测量等，还包含了GUM法所不具备的环境变动、方法本身的误差等不容易识别的不确定度分量，更全面系统。本文首次在药品检验领域采用TOP-DOWN法评定药品含量测定的不确定度，为探索非GUM法评定药品的测量不确定度，提供了一种有价值的参考方法[8]。
1. 材料与方法
1.1 实验仪器
日本岛津LC-20A型高效液相色谱仪；梅特勒-托利多BP221S型电子分析天平；液管和容量瓶均为天玻牌A级玻璃仪器。
1.2 实验材料
甲醇为色谱纯（美国赛默飞科技有限公司）；盐酸氨溴索对照品（来源于中国食品药品检定研究院，批号：100599-202106）；样品为盐酸氨溴索注射液（A企业，批号：2AA21203）；实验其他所用试剂均为分析纯；实验用水为超纯水。
1.3 实验方法
1.3.1 盐酸氨溴索注射液含量测定
盐酸氨溴索注射液含量测定标准收载于《中国药典》2020年版二部，按照其规定的方法进行测定。
色谱柱：月旭 C18 5 μm，250×4.6 mm；流动相A和B分别为0.01 mol/L磷酸氢二铵溶液和乙腈，体积比为50∶50，检测波长：248 nm。对照品和供试品分别用流动相制成约30 μg/mL的试液。
1.3.2 不确定度评定程序
参照《化学检测领域测量不确定度评定》RB/T 141-2018 [7]指南，确定测量不确定度的评定程序：（1）按照1.3.1中盐酸氨溴索注射液的含量测定方法，获取不同实验室间再现性数据（提交两组平行数据x1和x2）和一段时间内本实验室的重复性数据；（2）使用h/k检验确认再现性数据的偏倚是否受控；使用AD检验判断重复性数据的精密度是否处于期望范围内；（3）若偏倚和精密度均处于控制范围内，量化再现性估计值和精密度的不确定度，计算偏倚和精密度分量，合成不确定度。
1.3.3 不确定度评定数学模型
$$ U_{rel}=2 u_{c,re l}=2 \sqrt{u_{b,re l}^{2}+u_{R', re l}^{2}} $$ 式中：$ {u^2}_{b,rel} $ ：偏倚不确定度分量；$ {u^2}_{R',rel} $：期间精密度不确定度分量。
1.4 不确定度评定
1.4.1 偏倚不确定度分量
实验室间再现性数据
向17家实验室同步发放1.2中同批次对照品和盐酸氨溴索注射液样品，按照1.3.1中实验方法，得到各个实验室的含量测定数据，每个实验室提交2次测量数据x1和x2（%），各个实验室数据统计见表1。
表 1 各个实验室数据统计Table 1. Statistics of laboratory data across various laboratories序号 x1（%） x2（%） $ \overline {{x_i}} $（%） bi si h k 样品统计 1 100.82 100.20 100.51 0.51 0.44 0.10 1.88 ARV=100.4%
X=100.445%
$ {s_{\overline x }} $=1.08
sr=0.2072 100.23 100.33 100.28 0.28 0.07 −0.11 0.30 3 100.80 100.85 100.83 0.82 0.04 0.39 0.15 4 101.70 101.95 101.83 1.83 0.18 1.32 0.76 5 99.48 99.61 99.55 −0.45 0.09 −0.79 0.39 6 100.30 100.80 100.55 0.55 0.35 0.14 1.52 7 98.40 98.20 98.30 −1.70 0.14 −1.94* 0.61 8 100.30 99.70 100.00 0.00 0.42 −0.37 1.82 9 101.48 101.23 101.36 1.36 0.18 0.88 0.76 10 99.01 99.15 99.08 −0.92 0.10 −1.22 0.42 11 101.32 101.33 101.33 1.32 0.00 0.85 0.03 12 100.28 100.06 100.17 0.17 0.16 −0.21 0.67 13 98.58 98.59 98.59 −1.41 0.01 −1.68 0.03 14 100.71 100.55 100.63 0.63 0.11 0.21 0.49 15 101.42 102.15 101.79 1.79 0.52 1.28 2.22* 16 100.99 100.92 100.96 0.95 0.05 0.51 0.21 17 101.77 101.92 101.85 1.85 0.11 1.33 0.46 注：标*为异常值。 判断偏倚受控
参照RB/T141-2018，接受测量系统一致性的假设可判断偏倚是否受控，即h/k检验。
h/k检验计算公式：
$$ h = \frac{{{b_i}}}{{{s_{\overline x }}}} $$ (1) 式中：h为实验室间一致性统计量；bi为第i个实验室的单元偏倚（bi=$ \overline {{x_i}} $-ARV，$ \overline {{x_i}} $为各实验室的平均值，ARV的期望值为100.4%）；$ {s_{\overline x }} $为样品水平下各实验室$ \overline {{x_i}} $的标准差。
$$ k = \frac{{{s_i}}}{{{s_r}}} $$ (2) 式中：k为实验室内一致性统计量；si 为第i个实验室的单元标准差；sr为重复性标准差（$ {s_r} = \sqrt {\frac{{\sum {{s_i}^2} }}{{{p_i}}}} $，pi为实验室总个数）。
查询95%和99%概率下的h/k临界表， h=1.86，k=1.93（95%）；h=2.32，k=2.41（99%），实验室间的数据变异基本符合精密度要求。
计算偏倚不确定度分量
偏倚不确定度计算公式：
$$ {u^2}_{b,rel} = \sqrt {{b^2} + {u^2}_{c,ref}} = \sqrt {{{0.045}^2} + {{0.267}^2}} = 0.27 $$ 式中： $ {u^2}_{c,ref} = \frac{{{S_R}}}{{\sqrt L }} = 0.267 $ ，（SR为复现性标准差，L为实验室数量）
1.4.2 期间精密度不确定度分量
获取实验室内重复性数据
室间变异并未涵盖室内所有误差源的贡献，因此，本实验室在半年内按时间顺序进行了一段时间稳定过程的期间精密度测量，以18个样品的含量测定累计数据作为期间精密度重复性数据，最小值为99.4%，最大值为102.7%，均值为100.9%，相对标准偏差为0.88%。18个检验数据见表2。
表 2 期间精密度重复性数据Table 2. Intermediate precision data of repeatability measurements百分含量（%） 样品统计 99.9，100.2，100.6，100.7，101.1，100.3，101.9，100.5，102.7，
101.4，99.4，99.5，101.5，101.6，101.8，100.3，101.1，100.4$ \overline X $=100.9%；
${S}_{R'} $=0.88%判断期间精密度受控
参照RB/T141-2018标准中AD检验计算公式，对数据进行AD检验，分别检验$ A_S^{2*} $（正态性检验）和$ A_{MR}^{2*} $（独立性检验）。$ A_S^{2*} $检验结果为0.196，$ A_{MR}^{2*} $检验结果为0.272，AD检验结果均小于1.0[9]，按照标准指南，表明该组数据在99%概率下接受测量系统的正态性和独立性假设，说明实验室数据处于统计受控状态[10]。
期间精密度不确定度分量
实验室数据处于统计受控状态，期间精密度不确定度估计值为数据的相对标准偏差，即将$ {S}_{R'} $视为期间精密度不确定度${u}_{R'} $，则$ {u^2}_{R',rel} $=${S}_{R'} $= 0.88%。
2. 结果
2.1 扩展不确定度
按照评定的数学模型，由上文得到的两个分量值合为相对合成标准不确定度$ {u^2}_{c,rel} $，在置信度95%，包含因子（k取2）概率下求得扩展不确定度$ {U}_{rel } $。
$ {U}_{rel }=2{u}_{c,rel}=2\sqrt{{u}^{2}{}_{b,rel}+{u}^{2}{}_{R{'},rel}}=1.84\% \,\,\, (95\%,\,\,\, k=2)$
2.2 不确定度报告
盐酸氨溴索注射液中含盐酸氨溴索含量表示为：（100.5±1.84）%，100.5%数值为本次实验笔者实验室内测定的样品含量数据。
2.3 评定结果分析
盐酸氨溴索注射液含量评定结果表示为（100.5±1.84）%，即用扩展不确定度1.84%来表征实验室含量测量数据100.5%的分散性，被不确定度表征后的数值在药品标示含量值以内（90.0%～110.0%），表明盐酸氨溴索注射液含量测定可靠，实验室质控较好，可持续保持[11]，含量测定结果的可靠信进一步确保了药物的安全性和有效性。实验结果表明TOP-DOWN法可有效评定药品外标法含量测定，在实际测量中，一个客观事实是无论如何控制环境条件及控制各类对测量结果可能产生影响的因素，最终的测量结果总会存在一定的分散性，这些随机效应所造成的不确定度，包括尚未认识到的系统效应在评定中不可能被完全考虑到，导致了测量结果的误差[5]。而该法的优势恰好在于能充分利用实验室内长期积累的数据和实验室间再现性数据，归纳为精密度和偏倚两个分量，更加系统、全面的评定不确定度。
本次评定结果期间精密度的分量大于偏倚精密度的分量，说明期间精密度是影响不确定度数值的主要分量[12]，则可通过加长期间精密度的时间和样本量来进一步验证期间精密度的贡献量。偏倚分量贡献较小，影响的变化不显著，而偏倚由实验室间的再现性数据提供，提示可以通过增加实验室及样本数量来验证偏倚分量的贡献大小[13]。
2.4 实验数据说明
TOP-DOWN法应用时，数据受控是最重要的前提条件，h/k检验希望参加的实验室数量L越大越好[6−7]，但h/k临界值参考表中L上限为15。由于h/k值随着L增大其可接受的h/k值范围越大，以表中L为15对应的h/k值判断本次实验数据（共17家实验室）是否受控。h或k超出95%的临界值为异常值，但仍在99%临界值范围内。通过调查发现，实验室操作没有任何程序问题，属于随机原因的正常变异，综合判断整体数据基本受控[6−7，14−15]，并未剔除数据异常值（表1中带*号数据）。此外，ARV为接受参照值（即用作比较的经协商同意的标准值），本文使用的ARV值使用数据来源为本实验室自2020年至2023年检验的22批盐酸氨溴索注射液的含量平均值（100.4%）。
3. 讨论
3.1 TOP-DOWN法和GUM法评定结果的比较
TOP-DOWN法和GUM法为两种不同的评定方法，本次实验还按照传统的GUM 法进行含量测定的不确定度评定，对两种方法的结果进行比较， TOP-DOWN法评定结果（1.84%）小于GUM法（2.36%），说明GUM法的测量模型过多的输入了不确定度影响因素，提示在用GUM法计算不确定度时应保守估计影响因素，否则容易造成结果偏大[15]。两种评定方法比较的结果表明，在实际应用可使用TOP-DOWN法对GUM法进行补充和验证。
3.2 TOP-DOWN法可有效评定药品含量的不确定度
TOP-DOWN法已应用于食品等其他行业的不确定度评定中[10−13]，尚未见其应用于药品含量测定，本文首次利用TOP-DOWN法对药品含量测定结果进行不确定度评定，实验结果表明TOP-DOWN法可有效评定药品外标法含量测定，该法的优势在于能充分利用实验室内长期积累的实验数据，评定过程较传统的GUM法更全面，是一种客观、可靠的评定方法，为药品检验领域不确定度评定提供了新的方法。
3.3 首次对盐酸氨溴索注射液进行不确定度评定
盐酸氨溴索注射液作为高风险制剂，目前未见其含量测定不确定度评定的报道，本文首次对其不确定度进行研究，研究结果表明该药物含量测定数据可靠，能确保药物的安全性和有效性。
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图 2 正常HUVECs和VSMCs形态（×100）
A: 正常对照组HUVECs的形态；B: 正常对照组VSMCs的形态。
Figure 2. Typical appearance of HUVECs and VSMCs （×100）
图 4 Euonymine作用HUVECs 24 h的生长抑制率曲线
Figure 4. Curve inhibition rate of Euonymine treated HUVECs for 24 h
图 5 Euonymine作用VSMCs 48 h的生长抑制率曲线
Figure 5. Curve inhibition rate of Euonymine treated VSMCs for 48 h
图 6 卫茅碱抑制VSMCs迁移
A：划痕实验24 h后各实验组 VSMCs迁移的图像；B：Euonymine抑制VSMCs迁移距离的统计分析。与正常对照组比较，**P < 0.01；与模型组比较，#P < 0.05（$ \bar x \pm s $，n = 6）。
Figure 6. Euonymine inhibits the migration of VSMCs
图 7 卫茅碱对血清诱导的HUVECs细胞周期影响（
$ \bar x \pm s$ ，n = 6）A～C：不同浓度的Euonymine作用HUVECs后24 h的DNA直方图； D： Euonymine处理24 h的HUVECs的细胞周期的统计学分析。
Figure 7. Effect of Euonymine on the cell cycle of HUVECs induced by serum （
$ \bar x \pm s$ ，n = 6）
图 8 Euonymine对血清诱导的VSMCs细胞周期影响（
$\bar x \pm s $ ，n = 6）A～C：不同浓度的Euonymine作用VSMC后24 h的DNA直方图；D～E： Euonyming处理24 h和48 h的VSMCs的细胞周期分布。
Figure 8. Effect of Euonymine on the cell cycle of VSMCs induced by serum （
$\bar x \pm s $ ，n = 6）表 1 不同浓度Euonymine对HUVECs增殖的影响（
$ \bar x \pm s $ ，n = 6）Table 1. Effect of different concentrations of Euonymine on the proliferation of HUVECs （
$\bar x \pm s $ ，n = 6）分组 OD （570 nm） IR（%） F P 正常对照组 DMSO 0.768 ± 0.06 Euonymine（µg/mL） 12.5 0.654 ± 0.08△ 16.1 25 0.591 ± 0.19△ 25.0 5.97 0.030* 50 0.460 ± 0.07△ 43.5 100 0.152 ± 0.12△ 87.0 *P < 0.05；与正常对照组相比较，△P < 0.05。 
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表 2 不同浓度Euonymine对VSMCs增殖的影响（
$\bar x \pm s$ ，n = 6）Table 2. Effect of different concentrations of Euonymine on the proliferation of VSMCs （
$\bar x \pm s $ ，n = 6）分组 OD （570 nm） 24 h 48 h 72 h 96 h 正常对照组 DMSO 0.788 ± 0.16 0.841 ± 0.14 0.885 ± 0.08 0.925 ± 0.20 Euonymine
（µg/mL）12.5 0.688 ± 0.10 0.680 ± 0.13 0.676 ± 0.12△ 0.637 ± 0.04 25 0.626 ± 0.08△ 0.628 ± 0.19△ 0.607 ± 0.10△ 0.569 ± 0.12△ 50 0.524 ± 0.11△ 0.425 ± 0.15△ 0.419 ± 0.07△ 0.402 ± 0.18△ 100 0.312 ± 0.07△ 0.259 ± 0.13△ 0.219 ± 0.17△ 0.188 ± 0.08△ 200 0.259 ± 0.04△ 0.185 ± 0.16△ 0.156 ± 0.06△ 0.137 ± 0.18△ F 6.21 6.49 6.61 6.76 P 0.041* 0.041* 0 .031* 0.028* *P < 0.05；与正常对照组比较，△P < 0.05。
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