miR-216b-5p Promotes Ferroptosis in Glioblastoma Cells by Targeting NCOA3
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摘要:
目的 主要探讨miR-216b-5p通过靶向NCOA3对胶质瘤细胞铁死亡的影响，以期为胶质母细胞瘤的临床治疗提供新的靶点。 方法 U251细胞分为DMSO处理组，Erastin处理组，Erastin + mimic NC组，Erastin + miR-216b-5p mimic组，Erastin + pcDNA 3.1组，Erastin + pcDNA-NCOA3组，pcDNA+miR-216b-5p mimic+ pcDNA-NCOA3组。通过实时荧光定量PCR检测和Western blot 检测miR-216b-5p和NCOA3的表达以及铁死亡相关蛋白PTGS2， NOX1， ACSL4，GPX4， FTH1的蛋白表达量，CCK-8和流式细胞术检测细胞增殖和凋亡，通过试剂盒检测MDA，亚铁（Fe2+），谷氨酰胺，谷氨酸，α-酮戊二酸的含量。 结果 （1） miR-216b-5p在人胶质母细胞瘤细胞株LN229和U251中均高表达，Erastin刺激下的U25细胞活力回升且细胞凋亡率下降；（2）转染miR-216b-5p mimics后，Erastin刺激下的U251中的MDA，亚铁（Fe2+），谷氨酰胺，谷氨酸，α-酮戊二酸均有明显下降，铁死亡相关蛋白PTGS2， NOX1， ACSL4的蛋白表达量在Erastin的刺激下明显上升，而GPX4， FTH1的蛋白量明显下降；（3）获得9个在胶质母细胞瘤中与铁死亡相关，且与miR-261b-5p有直接靶向关系的基因，即FOXO4，NCOA3，PARP8，PARP11，LIG3，MAPK9，TLR4，RB1，PTEN，miR-216b-5p与 NCOA3直接结合向并负向调控NCOA3；4. 转染NCOA3使细胞活力下降，MDA，亚铁（Fe2+），谷氨酰胺，谷氨酸，α-酮戊二酸含量上升，铁死亡相关蛋白PTGS2，NOX1，ACSL4的蛋白表达量上升，而GPX4，FTH1的蛋白量下降；但miR-216b-5p mimic 的转染可逆转以上结果。 结论 miR-216b-5p直接靶向NCOA3，且通过NCOA3调控胶质母细胞瘤细胞的铁死亡，以此促进肿瘤的凋亡。对胶质母细胞瘤的新的治疗靶点以及后续研究提出了新的可能性，以期为胶质母细胞瘤的治疗提供新思路。 -
关键词:
- 胶质母细胞瘤 /
- miR-216b-5p /
- NCOA3 /
- 铁死亡
Abstract:Objective To investigate the effect of miR-216b-5p on ferroptosis in glioblastoma cells by targeting NCOA3, with a view to providing new targets for the clinical treatment of glioblastoma. Methods U251 cells were divided into DMSO-treated group, Erastin-treated group, Erastin + mimic NC group, Erastin + miR-216b-5p mimic group, Erastin + pcDNA 3.1 group, Erastin + pcDNA-NCOA3 group, pcDNA + miR-216b-5p mimic+ pcDNA-NCOA3 group. The expression of miR-216b-5p and NCOA3 and the expression of ferroptosis -related proteins PTGS2, NOX1, ACSL4, GPX4, FTH1 were detected by real-time fluorescence quantitative PCR assay and Western blot, and cell proliferation and apoptosis were detected by CCK-8 and flow cytometry, and MDA, Fe2+, glutamine, glutamic acid and α-ketoglutarate by kit. Results miR-216b-5p was highly expressed in human glioblastoma cell lines LN229 and U251, and the viability of Erastin-stimulated U25 cells increased and the apoptosis rate decreased. After transfection with miR-216b-5p mimics, MDA, Fe2+, glutamine, glutamic acid and α-ketoglutarate were all decreased significantly, and the expression of ferroptosis-related proteins PTGS2, NOX1, and ACSL4 increased significantly upon Erastin stimulation, while the protein amount of GPX4 and FTH1 decreased significant. 9 genes associated with ferroptosis in glioblastoma and directly targeted to miR-261b-5p were obtained, namely FOXO4, NCOA3, PARP8, PARP11, LIG3, MAPK9, TLR4, RB1, PTEN, miR-216b-5p, which directly bind to and negatively regulate NCOA3. Transfection with NCOA3 decreased cell viability, MDA, Fe2+, glutamine, glutamic acid, α-ketoglutarate levels, the protein expression of PTGS2, NOX1 and ACSL4 increased and that of GPX4 and FTH1 decreased; however, transfection of miR-216b-5p mimic reversed these results. Conclusion This study found that miR-216b-5p directly targets NCOA3 and regulates ferroptosis in glioblastoma cells through NCOA3, thereby promoting apoptosis. This study suggests new therapeutic targets for glioblastoma as well as new possibilities for subsequent research, in order to provide new ideas for the treatment of glioblastoma. -
Key words:
- Glioblastoma /
- miR-216b-5p /
- NCOA3 /
- Ferroptosis
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胶质母细胞瘤（Glioblastoma）是成年人中枢神经系统中恶性程度最高且最常见的肿瘤[1]，目前的标准治疗方法为最大程度切除肿瘤后口服替莫唑胺联合全脑放射[2]。但是因其增殖快，侵袭性强，血管生成迅速丰富的特点，肿瘤的复发率接近100%，5 a总生存率为5%[3]。因此，深入研究胶质瘤的发病机制以及潜在治疗靶向迫在眉睫。铁死亡（Ferroptosis）是一种非典型性程序性细胞死亡的方式，由脂质过氧化损伤引起[3-4]。由于癌细胞独特的代谢特征，铁死亡对肿瘤细胞的恶性生物学特征以及肿瘤的发展的影响逐渐引起人们的重视[5-6]。微小核糖核酸（microRNAs ，miRNA）是大小约为 22 个核苷酸的转录本，在细胞核和细胞质中通过多步过程产生，且被证实参与多种癌症的发生发展过程[7]。本文主要探讨miR-216b-5p通过靶向NCOA3对胶质瘤细胞铁死亡的影响，以期为胶质母细胞瘤的临床治疗提供新的靶点。
1. 材料与方法
1.1 细胞培养
人脑正常胶质细胞HEB，人脑胶质母细胞瘤细胞株LN299和U251均购自ATCC（American type culture collection）公司。细胞均培养在加入10% 胎牛血清和100 U/mL青霉素-链霉素的DMEM培养基（购于武汉普诺赛）中，在37℃，5% CO2的培养箱中培养。U251 使用DMSO溶液充分溶解的Erastin溶液（50 mg Erastin 粉末中加入 1.83 mL DMSO 溶液充分溶解成 50 mM 储存液，工作浓度为5.47 μg/g）或等体积DMSO溶液刺激，miR-216b-5p mimics，miR-216b-5p inhibitor，pcDNA-NCOA3以及对应的阴性对照质粒均设计并构建自上海吉满生物科技，通过Lipofectamine TM 2000 agent （Invitrogen，美国）进行。U251细胞分为DMSO处理组（等量DMSO刺激24 h），Erastin处理组（Erastin刺激24 h），Erastin + mimic NC组（转染mimic NC 后Erastin刺激24 h），Erastin + miR-216b-5p mimic组（转染miR-216b-5p mimic 后Erastin刺激24 h），Erastin + pcDNA 3.1组（转染pcDNA 3.1后Erastin刺激24 h），Erastin + pcDNA-NCOA3组（转染pcDNA-NCOA3后Erastin刺激24 h），pcDNA+miR-216b-5p mimic+ pcDNA-NCOA3组（共同转染miR-216b-5p mimic 和pcDNA-NCOA3后Erastin刺激24 h）。
1.2 RNA以及蛋白表达检测
各组细胞接种到6孔板后，加入TRIZOL裂解液提取总RNA后通过分光光度计检测RNA的浓度和纯度。使用Reverse Transcription Kits （TaKaRa，TRR820A） 或Bulge-Loop miRNA qRT-PCR Starter Kit（锐博，C10211-1）进行逆转录，SYBR® premix Ex TaqTM 实时定量PCR 试剂盒（大连宝生物公司）进行PCR 扩增并进行qPCR分析。mRNA水平检测采用GAPDH作为内参基因，miRNAs水平检测采用U6作为内参基因。采用2−ΔΔCT 方法分析mRNA 的相对表达水平，重复3次实验。荧光定量PCR扩增引物序列见表1。所有引物均由广州锐博生物有限公司设计并合成。
表 1 荧光定量PCR扩增引物列表Table 1. Nucleotide sequences of the primers used for real-time quantitative PCR引物名称 引物序列 NCOA3 forward 5’-AAGTGAAGAGGGATCTGGA-3’ NCOA3 reverse 5’-CAGATGACTACCATTTGAGG-3’ miR-216b-5p forward 5ʹ-TGAGAACTGAATTCCATGGGTT-3ʹ miR-216b-5p reverse 5ʹ-CCCAUGGAAUUCAGUUCUCAUU -3ʹ. U6 forward 5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAA-3’ U6 reverse 5’-CGAATTTGCGTGTCATCCTT-3’ GAPDH forward 5’-CGAATTTGCGTGTCATCCTT-3’ GAPDH reverse 5’-CGAATTTGCGTGTCATCCTT-3’ 使用RIPA 法对细胞进行裂解，即将RIPA裂解液（含0.01% PMSF、150 nmol/L Tris（pH = 8）、0.1% SDS、0.2% EDTA、1% Triton X-100、1%脱氧胆酸钠）置于冰上30 min 充分裂解细胞，通过BCA蛋白质测定法（购于江苏凯基生物技术公司）对蛋白量进行测定，将等量蛋白（30～50 μg）和2×SDS上样混合液混合并煮沸5 min，10% SDS-PAGE 分离蛋白并转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（Millipore，美国）。将膜在室温下用5% 脱脂奶粉封闭后，与按比例稀释后的一抗（表2）4℃下孵育过夜，清洗后与二抗室温下孵育2 h，通过增强化学发光法（Millipore，美国）使条带显色，GAPDH被用于内参基因。
表 2 Western blot中所用一抗Table 2. Primary antibodies used in western blot一抗 公司 货号 稀释比 分子量 种属 PTGS2 Abcam ab179800 1∶1000 69 Rabbit NOX1 Abcam ab131088 1∶1000 65 Rabbit ACSL4 Abcam ab155282 1∶10000 79 Rabbit GPX4 Abcam ab125066 1∶1000 22 Rabbit FTH1 Abcam ab75972 1∶500 21 Rabbit NCOA3 Abcam ab133611 1∶1000 160 Rabbit GAPDH Abmart P30008M 1∶1000 37 Rabbit 1.3 细胞增殖凋亡检测
将细胞以3000个细胞每孔的密度接种于96孔板，每组6个复孔，每孔加入100 μL含有CCK-8工作液（Abcam，批号 ab228554，工作液：培养基 = 1∶10）的DMEM培养基，37℃避光孵育，酶标仪检测450 nm处吸光度值。凋亡检测试剂盒购于东仁化学，用预冷的70%酒精固定细胞，并用PBS清洗。然后将细胞与5 mL Annexin V-FITC和10 μL PI孵育15 min，使用激发波长为488纳米的流式细胞仪观察和分析凋亡细胞的比例。
1.4 生化指标检测
取各组细胞，使用丙二醛（MDA）测定试剂盒（TBA法）（南京建成 A003-1-2），铁检测试剂盒（abcam，ab83366），谷氨酸（Glu）含量测试盒（酶联生物， ml076520），谷氨酰胺检测试剂盒（abcam，ab197011），α-酮戊二酸检测试剂盒（abcam，ab83431）按说明书制备样本，通过酶标仪分析MDA水平，亚铁（Fe2+）水平，谷氨酰胺水平，谷氨酸水平，α-酮戊二酸水平。
1.5 靶向预测及验证
通过miRDB （https://mirdb.org/）预测miR-216b-5p的下游靶向基因，通过FeffDb 数据库（http://www.zhounan.org/ferrdb/current/）获取铁死亡相关基因，通过GeneCards （https://www. genecards. org/） 获取胶质母细胞瘤相关基因，并使用Venn 图（http://bioinformatics. psb.ugent.be/webtools/Venn/）获取共有基因，用clusterProfiler包进行GO富集。通过miRDB 预测miR-216b-5p与NCOA3的结合靶点，将含有miR-216b-5p的野生或突变型NCOA 3 质粒构建到pRL-CMV载体中，通过lipofectamine 2000将WT- NCOA 3，Mut- NCOA 3，miR-216b-5p mimics，mimic NC 转染入U251细胞，并按照Dual-Luciferase Reprter Assay System试剂盒说明书（Promega，美国）测量Renilla和Firefly的荧光素酶活性并计算相对荧光强度。
1.6 统计学处理
通过Graph-Pad Prism 8.0 软件（GraphPad Software，San Diego，CA）进行 Kolmogorov-Smirnov检验数据的正态性。正态分布的连续性变量均以平均数±标准差（
$\bar x \pm s $ ）表示，并通过Graph-Pad Prism 8.3 软件进行统计分析。组间比较采用单因素方差分析，如有差异进一步用Tukey’s检测两两比较，P < 0.05为差异有统计学意义。2. 结果
2.1 miR-216-5p 的上调缓解胶质母细胞瘤细胞在Erastin介导的凋亡
首先验证miR-216a-5p在胶质母细胞瘤中的表达。与人脑胶质细胞HEB相比，miR-216b-5p在人胶质母细胞瘤细胞株LN229和U251中均高表达（图1A）。为了验证miR-216b-5p对胶质母细胞瘤细胞株中铁死亡的影响，通过铁死亡诱导剂Erastin调控U251中铁死亡的发生，并转染miR-216b-5p mimics调控miR-216b-5p在U251中的表达。qPCR的结果显示，与加入等剂量的DMSO的U251细胞相比，miR-216b-5p 在Erastin的刺激下下调，而转染miR-216b-5p mimics会使U251细胞中的miR-216b-5p上调，说明质粒的转染成功（图1B）。通过CCK-8和流式细胞术分别检测细胞的增殖和凋亡，发现相较于DMSO处理的细胞相比，Erastin刺激下的U251的细胞活力下降，且凋亡比率上升，而转染miR-216b-5p mimics后，细胞活力回升且细胞凋亡率下降（图1C～1D）。说明miR-216b-5p参与Erastin介导的细胞凋亡。
图 1 miR-216b-5p参与Erastin介导的细胞凋亡A：miR-216b-5p在人脑胶质细胞HEB、人胶质母细胞瘤细胞株LN229和U251中的表达；B：qRT-PCR检测miR-216b转染效率；C：CCK-8检测细胞活力；D（a）：Annexin V-FITC/PI-流式检测凋亡流式图；D（b）：数据统计柱状图。**P < 0.01；***P < 0.001；****P < 0.0001。Figure 1. miR-216b-5p was involved in Erastin-mediated apoptosis2.2 miR-216-5p 的上调缓解胶质母细胞瘤细胞在Erastin介导的脂质过氧化和铁离子累积
为了进一步研究miR-216-5p对U251中铁死亡的影响，分别检测了U251中MDA，亚铁（Fe2+），谷氨酰胺，谷氨酸，α-酮戊二酸的含量。结果显示，在Erastin的刺激下，U251中的MDA，亚铁（Fe2+），谷氨酰胺，谷氨酸，α-酮戊二酸均有明显的上调，而转染miR-216b-5p mimics后，U251中的MDA，亚铁（Fe2+），谷氨酰胺，谷氨酸，α-酮戊二酸均有明显下降（图2A～E）。同时，western blot 的结果显示，铁死亡相关蛋白PTGS2， NOX1， ACSL4的蛋白表达量在Erastin的刺激下明显上升，而GPX4， FTH1的蛋白量明显下降；miR-216b-5p的转染可逆转以上结果（图2F～2K）。以上结果说明miR-216-5p可通过调节脂质过氧化和铁离子累积抑制细胞的铁死亡。
图 2 miR-216-5p 的上调缓解胶质母细胞瘤细胞在Erastin介导的脂质过氧化和铁离子累积A：MDA水平检测；B：亚铁离子（Fe2+）水平检测；C：谷氨酰胺浓度检测；D：谷氨酸浓度检测；E：a-酮戊二酸浓度检测；F～K：western blot检测PTGS2， NOX1， FTH1， GPX4， ACSL4的蛋白表达。*P < 0.05；**P < 0.01；****P < 0.0001。Figure 2. Upregulation of miR-216-5p alleviates Erastin-mediated lipid peroxidation and iron accumulation in glioblastoma cells2.3 miR-216b-5p直接靶向并负向调控NCOA3
为了进一步研究miR-216b-5p对U251中铁死亡的调节机制，通过miRDB预测miR-216b-5p的靶向基因共489个，通过Gencards获取胶质母细胞瘤相关基因8289个，通过FeffDb 数据库（http://www.zhounan.org/ferrdb/current/） 获取铁死亡相关基因 934个。通过Venn 图取交集，获得9个在胶质母细胞瘤中与铁死亡相关，且与miR-261b-5p有直接靶向关系的基因，即FOXO4， NCOA3， PARP8， PARP11， LIG3， MAPK9， TLR4， RB1， PTEN（图3A）。对以上9个基因进行GO/KEGG富集分析，以上基因主要富集在调节DNA结合的转录因子的活性，有丝分裂细胞周期相变的负向调节，有丝分裂细胞周期的负向调节，细胞周期相变的负向调控，细胞周期过程的负向调节等功能上（图3B）。根据miRDB的Target score大小排序，选择NCOA3进行后续研究。通过双荧光素酶对miR-216b-5p和NCOA3的靶向关系进行验证，结果显示，当细胞共同转染了MUT- NCOA3质粒和miR-NC或miR-216b-5p mimics后，相对荧光素酶活性没有明显区别，而与NC模拟物相比，miR-216b-5p mimics与WT- NCOA3共同转染后相对荧光素酶活性下降（P < 0.0001，图3C～D）。因此证明了NCOA3与miR-216b-5p之间的靶标关系。qPCR以及Western blot 实验结果显示，当miR-216b-5p 过表达，NCOA3的mRNA以及蛋白表达下降，而当miR-216b-5p 被敲降，NCOA3的mRNA以及蛋白表达上升（图3E～G）。因此证明miR-216b-5p可负向调节NCOA3的表达。
图 3 miR-216b-5p直接靶向并负向调控NCOA3A：Venn图获取铁死亡相关基因，胶质母细胞瘤相关基因，miR-216b-5p的靶向基因中的共有基因；B：GO/KEGG富集分析；C：NCOA3与miR-216b-5p之间的结合位点预测；D：双荧光素酶对miR-216b-5p和NCOA3的靶向关系进行验证；E：qPCR检测NCOA3的mRNA表达；F，G：western blot 检测NCOA3的蛋白表达及对应灰度值。**P < 0.01；***P < 0.001；****P < 0.0001。Figure 3. miR-216b-5p directly targets and negatively regulates NCOA32.4 miR-216b-5p 通过NCOA3调控胶质母细胞瘤细胞的铁死亡
为了明确NCOA3在胶质母细胞瘤细胞中对铁死亡的调控作用，将U251分别转染pcDNA3.1- NCOA3和miR-216b-5p mimic， 并使用DMSO或Erastin进行处理。结果显示，U251细胞在Erastin处理后，细胞活力明显下降，MDA，亚铁（Fe2+），谷氨酰胺，谷氨酸，a-酮戊二酸均有明显的上调，铁死亡相关蛋白PTGS2， NOX1， ACSL4的蛋白表达量明显上升，而GPX4， FTH1的蛋白量明显下降；而转染NCOA3使细胞活力进一步下降，MDA，亚铁（Fe2+），谷氨酰胺，谷氨酸，a-酮戊二酸再次上升，铁死亡相关蛋白PTGS2， NOX1， ACSL4的蛋白表达量再次上升，而GPX4， FTH1的蛋白量明显下降；但miR-216b-5p mimic 的转染可逆转以上结果（图4）。以上结果说明，miR-216b-5p 通过NCOA3调控胶质母细胞瘤细胞的铁死亡。
图 4 miR-216b-5p 通过NCOA3调控胶质母细胞瘤细胞的铁死亡A：CCK-8检测细胞活力；B：MDA水平检测；C：亚铁离子（Fe2+）水平检测；D：谷氨酰胺浓度检测；E：谷氨酸浓度检测；F：a-酮戊二酸浓度检测；G～M）：western blot检测PTGS2，NOX1， FTH1，GPX4，ACSL4的蛋白表达。*P < 0.05；**P < 0.01；***P < 0.001；****P < 0.000 1。Figure 4. miR-216b-5p regulates iron death in glioblastoma cells via NCOA33. 结论
胶质母细胞瘤属于成人弥漫性胶质瘤，IDH1/2野生型，WHO4级；在原发性恶性脑肿瘤中占约45.6%，且在胶质瘤中恶性程度最高，五年生存率不足5%，平均生存时间仅14个月[5，8-9]。目前针对胶质母细胞瘤主要通过最大限度切除病灶，辅以放疗和烷基化剂化疗为主[10-11]，但由于胶质母细胞瘤的高侵袭性以及对化疗药物的耐药性使胶质母细胞瘤治疗效果差，且极易复发[12]。因此，对胶质母细胞瘤发病机制研究以及对治疗靶点的探索，以期发现新的治疗方式对胶质母细胞瘤的临床诊断具有重要意义。
铁死亡是一种铁依赖性的细胞程序性死亡形式，主要表现为细胞内线粒体收缩，双层膜的密度增加，线粒体嵴减少或减少，线粒体外膜破裂等[13-14]。铁死亡的诱导途径主要分为脂质代谢途径以及铁代谢途径。在脂质代谢途径中，主要通过胱氨酸谷氨酸反转运系统Xc-（cystine/glutamate antiporter，system Xc-）降低细胞中谷胱甘肽和半胱氨酸的水平，或通过降低谷胱甘肽过氧化物酶 4（glutathione peroxidase 4，GPX4）的表达水平来诱导铁死亡的产生；在铁代谢途径中，通过诱导细胞中亚铁离子水平的增加来诱导铁死亡的产生。铁死亡在胶质母细胞瘤中发挥的作用逐渐受到重视[15-16]。Li 等[8]发现NF-κB通路在GPX4抑制剂RAS选择性致死性小分子3 （RAS-selective lethal 3，RSL3）对应胶质母细胞瘤细胞的铁死亡的激活中发挥重要的作用。Yee 等[17]发现在胶质母细胞瘤早期中性粒细胞诱导的铁死亡促进肿瘤的发展。Erastin 是一种小分子化合物，其激活细胞铁死亡主要通过抑制抑制Xc- 系统上SLC7A11的表达，减少胱氨酸的摄取，导致GPX4合成减少和脂质过氧化水平的升高[18]。Chen 等发现[19] Erastin抑制了半胱氨酸转运体的吸收，并降低胶质母细胞瘤对特莫唑胺的耐药性。类似地，本实验发现Erastin的刺激使细胞活力下降，细胞凋亡率上升，同时U251中的MDA，亚铁（Fe2+），谷氨酰胺，谷氨酸，a-酮戊二酸均有明显的上调，铁死亡相关蛋白PTGS2， NOX1， ACSL4的蛋白表达量明显上升，而GPX4， FTH1的蛋白量明显下降，预示着Erastin可以通过诱导胶质瘤母细胞瘤细胞中的铁死亡的产生抑制肿瘤细胞的生长。
miR-216b-5p 被发现在多种肿瘤中起到肿瘤抑制基因的作用。作为一种微小RNA，miR-216b-5p 参与调控乳腺癌[20]，结肠癌[21-22]，前列腺癌[23]，浆液性上皮性卵巢癌[24]等肿瘤细胞的增殖，侵袭，化疗耐药性等恶性生物学特征。本研究同样发现，miR-216b-5p在胶质母细胞瘤中高表达，Erastin的刺激使U251细胞中的miR-216b-5p 表达下降，而miR-216b-5p参与U251细胞铁死亡引起的细胞凋亡，脂质过氧化和铁离子累积。核受体辅助因子（nuclear receptor coactivator，NCOA3）是类固醇受体辅助因子（steroid receptor coactivator，SRC）家族的成员，通过与转录因子的相互作用调节基因的表达。NCOA3在多种肿瘤中被报道具有促进肿瘤发生与发展的作用[25-27]。有研究发现，NCOA3通过与NR5A2的协作抑制BET抑制剂在乳腺癌中对铁死亡的诱导，从而减压肿瘤细胞的药物抵抗性[28]。本实验发现，miR-216b-5p直接靶向并负向调控NCOA3的表达，且通过NCOA3调控胶质母细胞瘤细胞的铁死亡。
综上所述，本研究发现miR-216b-5p直接靶向NCOA3，且通过NCOA3调控胶质母细胞瘤细胞的铁死亡，以此促进肿瘤的凋亡。本研究对胶质母细胞瘤的新的治疗靶点以及后续研究提出了新的可能性，以期为胶质母细胞瘤的治疗提供新思路。
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图 1 miR-216b-5p参与Erastin介导的细胞凋亡
A：miR-216b-5p在人脑胶质细胞HEB、人胶质母细胞瘤细胞株LN229和U251中的表达；B：qRT-PCR检测miR-216b转染效率；C：CCK-8检测细胞活力；D（a）：Annexin V-FITC/PI-流式检测凋亡流式图；D（b）：数据统计柱状图。**P < 0.01；***P < 0.001；****P < 0.0001。
Figure 1. miR-216b-5p was involved in Erastin-mediated apoptosis
图 2 miR-216-5p 的上调缓解胶质母细胞瘤细胞在Erastin介导的脂质过氧化和铁离子累积
A：MDA水平检测；B：亚铁离子（Fe2+）水平检测；C：谷氨酰胺浓度检测；D：谷氨酸浓度检测；E：a-酮戊二酸浓度检测；F～K：western blot检测PTGS2， NOX1， FTH1， GPX4， ACSL4的蛋白表达。*P < 0.05；**P < 0.01；****P < 0.0001。
Figure 2. Upregulation of miR-216-5p alleviates Erastin-mediated lipid peroxidation and iron accumulation in glioblastoma cells
图 3 miR-216b-5p直接靶向并负向调控NCOA3
A：Venn图获取铁死亡相关基因，胶质母细胞瘤相关基因，miR-216b-5p的靶向基因中的共有基因；B：GO/KEGG富集分析；C：NCOA3与miR-216b-5p之间的结合位点预测；D：双荧光素酶对miR-216b-5p和NCOA3的靶向关系进行验证；E：qPCR检测NCOA3的mRNA表达；F，G：western blot 检测NCOA3的蛋白表达及对应灰度值。**P < 0.01；***P < 0.001；****P < 0.0001。
Figure 3. miR-216b-5p directly targets and negatively regulates NCOA3
图 4 miR-216b-5p 通过NCOA3调控胶质母细胞瘤细胞的铁死亡
A：CCK-8检测细胞活力；B：MDA水平检测；C：亚铁离子（Fe2+）水平检测；D：谷氨酰胺浓度检测；E：谷氨酸浓度检测；F：a-酮戊二酸浓度检测；G～M）：western blot检测PTGS2，NOX1， FTH1，GPX4，ACSL4的蛋白表达。*P < 0.05；**P < 0.01；***P < 0.001；****P < 0.000 1。
Figure 4. miR-216b-5p regulates iron death in glioblastoma cells via NCOA3
表 1 荧光定量PCR扩增引物列表
Table 1. Nucleotide sequences of the primers used for real-time quantitative PCR
引物名称 引物序列 NCOA3 forward 5’-AAGTGAAGAGGGATCTGGA-3’ NCOA3 reverse 5’-CAGATGACTACCATTTGAGG-3’ miR-216b-5p forward 5ʹ-TGAGAACTGAATTCCATGGGTT-3ʹ miR-216b-5p reverse 5ʹ-CCCAUGGAAUUCAGUUCUCAUU -3ʹ. U6 forward 5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAA-3’ U6 reverse 5’-CGAATTTGCGTGTCATCCTT-3’ GAPDH forward 5’-CGAATTTGCGTGTCATCCTT-3’ GAPDH reverse 5’-CGAATTTGCGTGTCATCCTT-3’ 
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表 2 Western blot中所用一抗
Table 2. Primary antibodies used in western blot
一抗 公司 货号 稀释比 分子量 种属 PTGS2 Abcam ab179800 1∶1000 69 Rabbit NOX1 Abcam ab131088 1∶1000 65 Rabbit ACSL4 Abcam ab155282 1∶10000 79 Rabbit GPX4 Abcam ab125066 1∶1000 22 Rabbit FTH1 Abcam ab75972 1∶500 21 Rabbit NCOA3 Abcam ab133611 1∶1000 160 Rabbit GAPDH Abmart P30008M 1∶1000 37 Rabbit
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